Summary
El método que aquí se presenta incluye el daño exacto de embriones de pez cebra en vivo con pulsos láser de alta energía y el posterior análisis de estas lesiones y su recuperación con el tiempo. También mostramos cómo genéticamente etiquetado individual o grupos de células del músculo esquelético se puede seguir durante y después de la luz láser daño inducido.
Abstract
Varios enfoques experimentales se han utilizado en ratón para inducir lesión muscular con el objetivo de estudiar la regeneración muscular, incluyendo inyecciones myotoxin (bupivacaína, cardiotoxina o notexin), trasplantes musculares (denervación-desvascularización regeneración inducida), el ejercicio intenso, sino también modelos murinos de distrofia muscular como el ratón mdx (para una revisión de estos enfoques ver 1). En el pez cebra, los enfoques genéticos incluyen mutantes que exhiben fenotipos de distrofia muscular (como runzel 2 o sapje 3) y antisentido morfolinos de oligonucleótidos que bloquean la expresión de genes asociados a la distrofia 4. Además, los enfoques químicos también son posibles, por ejemplo, con la galantamina, un compuesto químico inhibiendo la acetilcolinesterasa, resultando así en hipercontracción, que finalmente conduce a la distrofia muscular 5. Sin embargo, los enfoques genéticos y farmacológicos generalmente afectar a todos los músculos dentro de un individuo, mientras que la extensión de las lesiones infligidas físicamente son más fácilmente controlados espacial y temporalmente 1. Lesión física localizada permite la evaluación de músculo contralateral como control interno. De hecho, recientemente hemos utilizado láser mediada por ablación celular para estudiar la regeneración del músculo esquelético en el embrión de pez cebra 6, mientras que otro grupo informó recientemente el uso de un láser de dos fotones (822 nm) a dañar muy localmente la membrana plasmática de músculo individual embrionario de pez cebra células 7.
Aquí, se presenta un método para utilizar el láser micropoint (Andor Technology) para lesión celular del músculo esquelético en el embrión de pez cebra. El láser micropoint es un láser de alta energía, que es adecuado para la ablación de células reconocidas en una longitud de onda de 435 nm. El láser está conectado a un microscopio (en nuestra configuración, un microscopio óptico de Zeiss) de tal manera que el microscopio se puede utilizar en el mismo tiempo fo enfocar la luz láser sobre la muestra y para la visualización de los efectos de la herida (campo claro o fluorescencia). Los parámetros para el control de pulsos de láser incluyen longitud de onda, intensidad, y número de pulsos.
Debido a su transparencia y el desarrollo embrionario externo, el embrión de pez cebra es altamente susceptible, tanto para la lesión inducida por láser y para el estudio de la recuperación posterior. Entre 1 y 2 días después de la fecundación, las células del músculo esquelético somitic someterse a la maduración progresiva de anterior a posterior debido a la progresión de somitogenesis desde el tronco hasta la cola 8, 9. En estas etapas, los embriones espontáneamente crispar e iniciar la natación. El pez cebra se ha reconocido recientemente como un organismo vertebrado importante modelo para el estudio de la regeneración de los tejidos, como muchos tipos de tejidos (cardiacas, neuronal, vascular, etc) se puede regenerar después de la lesión en el adulto pez cebra 10, 11.
Protocol
1. Etiquetado de células individuales
Inyectar una célula de embriones etapa con un plásmido que codifica GFP o cualquier proteína GFP-fusión bajo el control de un promotor de β-actina. Durante el desarrollo, la GFP se expresa entonces en forma de mosaicos. Aquí, se utilizó el constructo transgénico Tg [β-actina: α-actinina-GFP], que coloca la proteína de fusión α-actinina-GFP bajo el control del promotor de la β-actina.
2. Embriones Embedding
- Recoger embriones de pez cebra y mantener en condiciones normales hasta 28 HPF (puesta en escena de acuerdo a 12).
- Embriones Dechorionate bajo el microscopio estereoscópico con fórceps (Dumont # 5).
- Preparar un portaobjetos de microscopio con un anillo de vaselina.
- Preparar un 1% de bajo punto de fusión de agarosa / 10% de solución de tricaína con medio E3: hervir 100 mg de agarosa en 10 ml de solución de E3 para obtener un líquido homogéneo y solución de agarosa; alícuota y tiendasin utilizar una solución de agarosa a -20 ° C para su uso posterior. Para uso inmediato, dejar que la solución se enfríe hervida y mantener en el máximo. 39 ° C. Añadir la solución de stock de tricaína para obtener una concentración final de 10% tricaína. Tanto tricaína y agarosa son necesarias para evitar los movimientos embrionarios.
- Insertar un solo embrión en 1% de agarosa de bajo punto de fusión / 10% tricaína / E3 medio dentro del anillo de la jalea de petróleo, con el embrión por el que se forma natural en el lado; suavemente un cubreobjetos, sólo para mantener el embrión en su lugar y para evitar un convexo superficie que se rompería la luz. Idealmente, el tejido muscular embrionario que se dirigirá debe tocar el cubreobjetos.
3. Embriones láser heridas
- Preparar el láser micropoint y el microscopio:
- Por favor, consulte el manual de micropoint láser para obtener instrucciones detalladas sobre cómo configurar y utilizar el láser en conjunción con el microscopio.
- Seleccionar la adecuadacolorante para la generación de un haz de láser 435 nm de longitud de onda.
- Ajuste la potencia del láser mediante el control deslizante de atenuación. La potencia del láser debe ser lo suficientemente fuerte como para romper una superficie de vidrio con un solo pulso (por ejemplo, el enfoque sobre el cubreobjetos de la muestra para probar esto). Esta es la potencia de láser requerida para la ablación celular.
- Centrarse en la región o célula de interés utilizando la retícula instalada en el ocular del microscopio. Utilice un objetivo de 20x (40x permitirá daños más precisa, pero a menudo la distancia de trabajo no es suficiente para este objetivo).
Nota 1: El láser no sólo se lesionan las células dentro del plano de enfoque, pero también células por encima y por debajo que están dentro del haz de láser. Asegúrese de que antes del experimento que el láser está óptimamente configurado y ajustado para un enfoque alcanza su máximo en el eje z. Lo mejor es determinar la profundidad de la lesión con láser antes de realizar el experimento con el fin de saber qué células exactamente se lesionó.
- Configure la luz necesaria para visualizar el experimento: campo claro para el uso normal, o si la orientación de fluorescencia de una célula fluorescente etiquetados.
- Enviar un pulso de luz láser a la región objetivo, o varios impulsos, dependiendo del grado deseado de lesión.
4. Análisis de las heridas y la recuperación
- Si se desea, el procedimiento de lesión láser puede ser grabado en vivo (por ejemplo, utilizando la opción de adquisición corriente del software Metamorph). 6
- Inmediatamente después de la herida, el embrión debe ser removido suavemente de la agarosa con pinzas y se coloca de nuevo en agua para la recuperación de huevo.
Nota 2: La actividad muscular (natación y contracciones) es especialmente importante para la recuperación del músculo esquelético. Dado que el embrión no puede moverse debido a la exposición tricaína y la incrustación de agarosa rígido, no es RECOMEnded para mantener los embriones de un portaobjetos y un cubreobjetos durante demasiado tiempo.
- Después de la recuperación, el embrión puede ser fijada y se analizaron como se desee por la luz, microscopía de fluorescencia confocal o-como se indica.
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Representative Results
Laser lesión mediada se realizó en inmovilizadas 1 día de edad embriones. Como se muestra en la Figura 1, un láser de pulsos pocos puede generar una pequeña herida, fácilmente reconocible por los dañados, enrollados, actina ricos en miofibrillas que normalmente se extendía entre los límites somite. Un mayor número de pulsos de láser sin embargo resultará en un bloque de somite dañado masivamente, en donde la mayoría de las miofibrillas son destruidos. No obstante, se puede observar que, literalmente, "el tiempo cura todas las heridas", con pequeñas heridas cicatrizan más rápido que las grandes. Después de la recuperación, coloraciones de actina muestran que las miofibrillas de nuevo atraviesan el somite normalmente, sin embargo, la información adicional puede ser obtenida por tinción para Xirp1. La proteína Xirp1 es un buen marcador para la detección de lesiones y recuperación donde se han producido, como se ectópica localizada a lo largo de la recuperación de las miofibrillas dentro de las células musculares antes lesionados 6.
Para algunos fines, es importante para determinar qué células exactly se lesionan con el láser, por lo tanto, podría ser útil para etiquetar genéticamente algunas células (por ejemplo, por mosaically expresar una proteína GFP-etiquetados) con el fin de ser capaz de visualizar con precisión qué celda está dirigido y luego para evaluar si sus células vecinas tienen visto afectado por el pulso láser (Figura 2). Después de la lesión y la recuperación de la tinción de anticuerpos, se hace posible encontrar y analizar la célula diana de nuevo gracias al patrón de células marcadas mosaically que lo rodean.
Un enfoque interesante es el de vigilar con regularidad en el tiempo como la lesión mediada por láser afecta al músculo somitic. Para ello, la lesión láser del embrión inmovilizado puede ser grabado en vivo para ver los efectos inmediatos, por ejemplo, dentro de la primera minutos (Figura 3). Además, las grabaciones timelapse se puede realizar con cualquier intervalo de tiempo deseado (por ejemplo, 5 min intervalo), con el fin de seguir de cerca la forma de las células reorganizaralrededor de la herida.
Figura 1. La gravedad de la lesión infligida puede variar mucho, en función del número de impulsos de láser aplicados. En consecuencia, la recuperación de la lesión se procederá a ritmos de diferencia, pero con el tiempo, la mayoría de las heridas se cierran. Recientemente hemos demostrado que Xirp1 (verde) es un buen marcador para la regeneración muscular, ya que es upregulated después de la lesión y se localiza a la no sarcómero actina (rojo) de las miofibrillas dañadas en 32 HPF 6.
Figura 2. Las células marcadas pueden ser dirigidos específicamente (modificado de Ref. 6). Cells fueron etiquetados por la expresión mosaico de Tg [β-actina: α-actinina-GFP] (verde o blanco y negro). Una celda como se aquí se centra en 32 hpf y severamente dañado por varios pulsos de láser, como se indica por el perno rojo. La flecha blanca indica la célula lesionada, las flechas amarillas indican a otras células GFP-etiquetados. La imagen de la derecha fue tomada después de la tinción de anticuerpos y la recuperación de la misma herida.
Figura 3. Adquisición de streaming de lesión láser revela cómo la lesión afecta al bloque somite entero. Montaje de imágenes individuales registradas en el Axioplan en el modo de transmisión en vivo (es decir, cerca de 16 cuadros / seg) con DIC. La flecha de color negro indica que el láser llega al músculo somitic a 28 HPF. Las flechas rojas indican la retracción de los extremos de un dañadomiofibrilla. Estos cambios dinámicos dentro del bloque somite se dio a menos de 2,5 seg.
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Discussion
Laser lesión mediada es un método poderoso para infligir heridas de un tamaño deseado mediante la ablación de las células con el fin de estudiar la regeneración bajo condiciones controladas en el embrión de pez cebra. En particular, las células pueden ser dirigidos con precisión (Figura 2) y tanto el área de la lesión así como de temporización puede ser controlada. Posteriormente, el sitio de la lesión y los procesos de regeneración son fácilmente controlados, registrados (Figura 3) y analizados (Figura 1). Sin embargo, si bien el láser está bien enfocado en el eje x y el eje y, que no está completamente enfocado en el eje z. Esto puede causar daño a las células situadas por debajo o por encima de las células de interés. Sin embargo, este enfoque abre un vasto campo de investigaciones in vivo de la reparación del músculo.
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Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Damos las gracias a Bob Nowak (Andor Technology) para la ayuda técnica y asesoramiento. SA-S. con el apoyo de una beca Heisenberg de la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Este trabajo fue apoyado por la DFG subvención SE2016/7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
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References
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