Summary
O método aqui apresentado compreende a lesão precisa de embriões vivos zebrafish com pulsos de laser de alta potência e a subsequente análise das lesões e sua recuperação com o tempo. Também mostramos como geneticamente marcado individual ou grupos de células do músculo esquelético pode ser monitorado durante e após o laser danos leves induzido.
Abstract
Várias abordagens experimentais têm sido utilizados no mouse para induzir lesão muscular com o objetivo de estudar a regeneração muscular, incluindo injeções miotoxina (bupivacaína, cardiotoxina ou notexin), transplantes musculares (denervação desvascularização-regeneração induzida), exercício intensivo, mas também modelos murinos de distrofia muscular como o camundongo mdx (para uma revisão dessas abordagens ver 1). No peixe-zebra, abordagens genéticas incluem mutantes que exibem fenótipos de distrofia muscular (como runzel 2 ou sapje 3) e anti-sentido morpholinos oligonucleotídicas que bloqueiam a expressão de genes associados a distrofia 4. Além disso, as abordagens químicas também são possíveis, por exemplo, com a galantamina, um composto químico inibe a acetilcolinesterase, resultando assim em hipercontração, o que eventualmente leva a distrofia muscular 5. Abordagens entanto, genéticos e farmacológicos generally afectam todos os músculos no interior de um indivíduo, ao passo que a extensão dos ferimentos infligidos são fisicamente mais facilmente controlada espacialmente e temporalmente 1. Lesão física localizada permite a avaliação do músculo contralateral como controle interno. De facto, foi recentemente utilizado por laser de ablação celular mediada para estudar a regeneração do músculo esquelético no embrião do peixe-zebra 6, enquanto que um outro grupo recentemente relatada a utilização de um laser de dois fotões (822 nm) para danificar muito localmente na membrana plasmática de músculo de peixe zebra indivíduo embrionário células 7.
Aqui, relatamos um método para a utilização do laser Micropoint (Andor Technology) por lesão do músculo esquelético de células no embrião do peixe-zebra. O laser Micropoint é um laser de alta energia, que é adequado para a ablação de células alvo num comprimento de onda de 435 nm. O laser é ligado a um microscópio (na nossa configuração, um microscópio óptico Zeiss partir) de tal modo que o microscópio pode ser utilizado para o mesmo tempo fou focalizar a luz de laser sobre a amostra e para a visualização dos efeitos do ferimento (campo claro ou de fluorescência). Os parâmetros para controlar o comprimento de onda de pulsos de laser incluem, a intensidade e o número de pulsos.
Devido à sua transparência e desenvolvimento embrionário externo, o embrião do peixe-zebra é altamente favorável para ambos lesão induzida por laser e para estudar a recuperação posterior. Entre 1 e 2 dias após a fertilização, somíticos células do músculo esquelético progressivamente sofrerem maturação de anterior para posterior, devido à progressão da somitogénese do tronco para a cauda 8, 9. Nessas etapas, os embriões espontaneamente se contorcer e iniciar a natação. O peixe-zebra foi recentemente reconhecido como um importante organismo vertebrado modelo para o estudo da regeneração de tecidos, tal como vários tipos de tecidos (cardíaca, neuronal, vascular, etc) pode ser regenerado após a lesão no peixe-zebra adultos 10, 11.
Protocol
1. Rotular Células individuais
Injectar embriões unicelulares palco com um plasmídeo que codifica GFP ou de qualquer proteína de fusão GFP sob o controlo de um promotor β-Actina. Durante o desenvolvimento, a GFP é então expressa de uma forma de mosaico. Aqui, utilizou-se o construto transgénico Tg [β-actina: α-actinina-GFP], o que coloca a proteína de fusão α-actinina-GFP sob o controlo do promotor da β-actina.
2. Incorporação de embrião
- Coletar embriões zebrafish e manter em condições normais até 28 hpf (estadiamento de acordo com a 12).
- Embriões Dechorionate sob o estereomicroscópio com uma pinça (Dumont # 5).
- Prepara-se uma lâmina de microscópio com um anel de vaselina.
- Preparar um 1% de baixo ponto de fusão de agarose / 10% de solução de tricaina com meio E3: fervura 100 mg de agarose em 10 ml de solução E3 para obter um líquido homogéneo e solução de agarose; aliquota e armazenarsolução de agarose não utilizado a -20 º C para posterior utilização. Para uso imediato, deixe a solução fervida esfriar e manter no máximo. 39 ° C. Adicionar tricaina solução stock para se obter uma concentração final de 10% tricaina. Ambos tricaina e agarose são necessárias para evitar movimentos embrionários.
- Incorporação de um único embrião de 1% de ponto de fusão baixo a médio de agarose / 10% tricaina / E3 dentro do anel de vaselina, com o embrião fixa naturalmente no lado; suavemente cobrir com uma lamela apenas para manter o embrião no lugar e evitar um convexo superfície que iria quebrar a luz. Idealmente, o tecido do músculo embrionário que serão alvo deve tocar na lamela.
3. Embryo Laser ferimento
- Prepare o laser Micropoint e do microscópio:
- Por favor, consulte o manual do laser Micropoint para instruções detalhadas sobre como configurar e utilizar o laser em conjunto com o microscópio.
- Selecione o corretocorante para a geração de um feixe de laser 435 nm de comprimento de onda.
- Ajustar a potência do laser usando o controle deslizante de atenuação. A potência do laser deve ser suficientemente forte para quebrar a superfície de vidro com um único impulso (por exemplo, o foco sobre a lamela de sua amostra para testar esta). Esta é a potência do laser necessária para a ablação de células.
- Concentre-se na região ou célula de interesse, utilizando o retículo instalado na ocular do microscópio. Use uma objetiva de 20x (40x permita danos mais preciso, mas muitas vezes a distância de trabalho não é suficiente para essa lente).
Nota 1: O laser não só danificam as células no interior do plano de focagem, mas também as células acima e abaixo que se encontram dentro do raio laser. Certifique-se antes da experiência que o laser é perfeitamente configurado e ajustado para um foco máxima dentro do eixo z. É melhor para determinar a profundidade da lesão do laser antes de realizar o ensaio, a fim de saber qual células exatamente será ferido.
- Defina-se a luz necessária para a visualização do experimento: brightfield para uso normal, ou fluorescência, se uma célula alvo marcada com fluorescência.
- Enviar um impulso de luz laser para a região alvo, ou em vários pulsos, dependendo do grau desejado de lesão.
4. Análise de ferimento e Recuperação
- Se desejado, o procedimento de lesão do laser pode ser gravado (por exemplo, utilizando a opção de aquisição fluxo do software Metamorph) 6.
- Imediatamente após o ferimento, o embrião deve ser removido suavemente a partir da agarose com uma pinça e colocado de novo em água de ovo para a recuperação.
Nota 2: A atividade muscular (natação e espasmos) é especialmente importante para a recuperação do músculo esquelético. Uma vez que o embrião não pode mover-se devido à exposição tricaina e a incorporação de agarose rígida, não é RECOMEnded para manter os embriões entre lâmina e lamínula por muito tempo.
- Depois da recuperação, o embrião pode ser fixado e analisadas, conforme desejado pela luz, microscopia de fluorescência confocal ou conforme indicado.
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Representative Results
Lesão mediada por laser foi realizada em imobilizadas um dia de idade, os embriões. Como mostrado na Figura 1, um impulso de laser que poucos podem gerar uma pequena ferida, facilmente reconhecível pelos danificadas, enroladas, Actina ricos miofibrilas, que normalmente são esticadas entre os limites somito. Um maior número de pulsos de laser vai, porém, resultar em um bloco somito maciçamente danificados, onde a maioria das miofibrilas são destruídos. No entanto, podemos observar que, literalmente, "o tempo cura todas as feridas", com pequenas lesões de cura mais rápido do que os maiores. Após a recuperação, colorações de actina mostram que miofibrilas novamente abrangem o somito normalmente, no entanto, informações adicionais podem ser obtidas através da coloração de Xirp1. A proteína Xirp1 é um bom marcador para a detecção de lesões e em que tenha ocorrido recuperação, como está localizada ao longo ectopicamente recuperando miofibrilas dentro das células musculares anteriormente lesionados 6.
Para alguns propósitos, é importante para determinar as células Exactly são feridos com o laser, por isso, pode ser útil para rotular geneticamente algumas células (por exemplo, por mosaically expressando uma proteína marcada com GFP), a fim de ser capaz de visualizar com precisão que é alvo das células e, em seguida, para avaliar se as suas células vizinhas têm foram também afectados pelo pulso de laser (Fig. 2). Após coloração lesão e da recuperação do anticorpo, que se torna possível encontrar e analisar a célula alvo novamente graças ao padrão de células marcadas mosaically rodeiam.
Uma abordagem interessante é monitorar regularmente ao longo do tempo como a lesão de laser mediada afeta o músculo somítica. Para isto, o laser de lesão do embrião imobilizada pode ser gravado para ver os efeitos imediatos, por exemplo, dentro do primeiro minuto (Figura 3). Além disso, as gravações timelapse pode ser realizada com qualquer intervalo de tempo desejado (por exemplo, intervalo de 5 min), a fim de seguir de perto a forma como as células de reorganizarem torno da ferida.
Figura 1. A gravidade da lesão infligida pode variar bastante, dependendo do número de impulsos de laser aplicado. Consequentemente, a recuperação da lesão irá proceder a ritmos de diferença, mas, eventualmente, a maioria das feridas são fechadas. Mostrámos recentemente que Xirp1 (verde) é um bom marcador para a regeneração do músculo, uma vez que é regulada positivamente após lesão e localiza a não-sarcomérica actina (vermelho) de miofibrilas danificadas a 32 hpf 6.
Figura 2. Células marcadas pode ser alvo específico (modificado de Ref. 6). Cells foram marcadas pela expressão mosaico de Tg [β-actina: α-actinina-GFP] (verde ou preto e branco). Uma célula como aqui foi alvejado a 32 hpf e severamente danificada por pulsos de laser diversos, como indicado pelo parafuso vermelho. A seta branca indica a célula feridos; setas amarelas indicam outras células GFP-rotulados. A imagem da direita foi tomada após a recuperação e anticorpo coloração da mesma ferida.
Figura 3. Aquisição transmissão ao vivo de lesão do laser revela como a lesão afeta o bloco somito inteiro. Montagem de fotos individuais registrados no Axioplan no modo de transmissão ao vivo (ou seja, cerca de 16 frames / seg) com DIC. A seta preta indica onde o laser atinge o músculo somíticos a 28 hpf. As setas vermelhas indicam a retração termina de uma danificadomiofibrila. Estas mudanças dinâmicas dentro de um bloco de somito ocorreu dentro de 2,5 segundos.
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Discussion
Laser mediada lesão é um método poderoso para infligir feridas de um tamanho desejado, a ablação de células, a fim de estudar a regeneração em condições controladas, o embrião do peixe-zebra. Notavelmente, as células podem ser direcionados precisamente (Figura 2), e tanto a área de lesão, assim como de temporização pode ser controlada. Subsequentemente, o local da lesão e os processos de regeneração são facilmente monitorizados, registada (Figura 3) e analisadas (Figura 1). No entanto, embora o laser é bem focado no x-e y-eixo, que não está completamente focada no eixo z. Isto pode provocar danos nas células situadas por baixo ou por cima das células de interesse. No entanto, esta abordagem abre um vasto campo de investigações em in vivo de reparação muscular.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Agradecemos Bob Nowak (Andor Technology) para obter ajuda e aconselhamento técnico. SA-S. é apoiado por uma bolsa de Heisenberg da Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG). Este trabalho foi financiado pelo DFG concessão SE2016/7-1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
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References
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