Summary
Burada sunulan yöntem, yüksek enerjili lazer darbeleri ve zamanla bu yaralanmalar ve kurtarma ileri analizi ile canlı zebrafish embriyo kesin hasar oluşur. Ayrıca genetik olarak tek etiketli veya iskelet kas hücre gruplarının sırasında ve lazer ışık kaynaklı hasar sonrası takip edilebilir göstermek.
Abstract
Çeşitli deneysel yaklaşımlar murin müsküler distrofi modelleri de myotoxin enjeksiyonları (bupivakain, cardiotoxin veya notexin), kas nakilleri (denervasyon-devaskülarizasyonun bağlı rejenerasyon), yoğun egzersiz, kas yenilenme çalışma amacı ile kas yaralanma ikna etmek için fare kullanılır, ama oylandı mdx fare (bu yaklaşımların bir inceleme için 1'e bakınız) gibi. Zebrafish, genetik yaklaşımlar müsküler distrofi fenotipleri (örneğin runzel 2 ya da 3 sapje gibi) sergilerler ve distrofi ile ilişkili genlerin ekspresyonunu engellemek 4 morpholinos antisens oligonükleotid mutantları sayılabilir. Bunun yanı sıra, kimyasal yaklaşımlar ve böylece sonuçta müsküler distrofi 5 yol açar hypercontraction oluşur, bunların, aynı zamanda Galanthamine, bir asetilkolinesteraz inhibe edici kimyasal bileşik, örneğin mümkündür. Ancak, genetik ve farmakolojik yaklaşımlar gfiziksel yaralanmalar ölçüde daha kolay ve mekansal 1 kontrol edilir ise enerally, bireyin içindeki tüm kasları etkileyebilir. Lokalize fiziksel yaralanma bir iç kontrol olarak kontralateral kas değerlendirmesini sağlar. Başka bir grup son zamanlarda çok lokal bireyin embriyonik zebrafish kas plazma zarı zarar iki foton lazer (822 nm) kullanımı rapor Nitekim, biz son zamanlarda, zebrafish embriyo 6 iskelet kas yenilenme incelemek için lazer aracılı hücre ablasyon kullanılır hücreleri 7.
Burada, zebrafish embriyo iskelet kas hücre hasarı için Micropoint lazer (Andor Teknolojisi) kullanımı için bir yöntem sunulmuştur. Micropoint lazer 435 nm dalga boyunda hedeflenen hücre ablasyon için uygun bir yüksek enerjili lazer. Lazer mikroskop aynı zamanda f da kullanılabilir ki bu tür bir şekilde (bizim kurulum, Zeiss bir optik mikroskop) bir mikroskop ile bağlanırveya numune üzerine ve yaralama (aydınlık veya floresans) etkileri görselleştirmek için lazer ışık odaklama. Lazer darbeleri kontrol parametreleri dalga boyu, yoğunluk ve bakliyat numarasını içerir.
Şeffaflığını ve dış embriyonik gelişme nedeniyle, zebrafish embriyo lazer kaynaklı yaralanma ve hem de daha sonraki iyileşme incelemek için çok müsait olan. 1 ila 2 gün sonrası fertilizasyon, somitic iskelet kas hücreleri giderek kuyruk 8, 9 gövdesinden somitogenesis ilerlemesi nedeniyle posterior anterior olgunlaşması uğrarlar. Bu aşamalarda, embriyo kendiliğinden seğirme ve yüzme başlatabilir. Zebrafish yakın yetişkin zebrafish 10, 11 yaralanma sonrası rejenere edilebilir dokuların birçok türleri (vb vasküler, nöronal, kardiyak) gibi, doku rejenerasyon çalışması için önemli bir omurgalı model organizma olarak kabul edilmiştir.
Protocol
1. Tek Hücreler Etiketleme
Bir β-aktin promotörü kontrolü altında bir plasmid kodlama GFP ya da GFP füzyon proteini ile tek-hücreli embriyoların enjekte edilir. Gelişimi sırasında, GFP sonra bir mozaik bir şekilde ifade edilir. Burada kullanılan transgenik yapı Tg [β-aktin: α-aktinin-GFP] olup β-aktin promotörü kontrolü altında α-aktinin-GFP füzyon proteini yerleştirir.
2. Embriyo Katıştırma
- Zebrafish embriyolar toplayın ve 28 hpf (evreleme 12 göre) kadar normal koşullar altında korur.
- Forseps (Dumont # 5) ile birlikte bir stereomikroskop altında Dechorionate embriyolar.
- Bir vazelin halka ile bir mikroskop slayt hazırlayın.
- Bir% 1 düşük erime noktalı agaroz / E3 orta ile% 10 tricaine çözelti hazırlayın: bir sıvı ve homojen bir çözelti elde etmek için agaroz 10 ml E3 çözelti içinde kaynamaya 100 mg, agaroz, tablet ve mağazadaha sonra kullanmak için -20 ° C 'de kullanılmayan agaroz çözelti. Acil kullanım için, haşlanmış çözüm soğumasını ve max muhafaza edelim. 39 ° C. % 10 tricaine bir nihai konsantrasyon elde etmek için tricaine stok solüsyonu eklenir. Tricaine ve agaroz Hem embriyonik hareketlerin önlenmesi için gereklidir.
- Embriyo tarafında doğal döşeme ile,% 1 vazelin halka içinde düşük erime agaroz / 10% tricaine / E3 ortamda tek bir embriyo Embed; nazikçe yerine embriyo korumak için ve bir dışbükey önlemek için bir lamel ile kaplayın ışığı kıracak yüzey. İdeal hedeflenecektir embriyonik kas dokusu lamel temas etmelidir.
3. Embriyo Lazer-yaralama
- Micropoint lazer ve mikroskop hazırlayın:
- Mikroskop ile birlikte kurmak ve lazer nasıl kullanılacağı hakkında ayrıntılı talimatlar için Micropoint lazer kılavuzuna bakın.
- Doğru SeçinBir 435 nm dalga boylu lazer ışını üretimi için boya.
- Zayıflama kaydırıcısını kullanarak lazer gücünü ayarlayın. Lazer gücü, tek bir darbe (bu test için numune lamel örneğin odaklama) ile cam yüzey kırmak için yeterince güçlü olmalıdır. Bu, hücre ablasyon için gerekli lazer güçtür.
- Mikroskobun oküler yüklü retikül kullanarak ilgi bölgesi veya hücre odaklanın. 20x objektif (40x daha kesin hasar izin verir, ancak genellikle çalışma mesafesi bu lens için yeterli değildir) kullanın.
Not 1: lazer sadece odaklama düzlemi içindeki hücrelere zarar değil, aynı zamanda yukarıda hücreleri ve lazer ışını dahilinde altında değildir. Lazer, optimum kurmak ve z ekseni içinde bir maksimal odak için ayarlanmış olduğundan emin denemeden önce emin olun. Bunu bilmek için deney yapmadan önce lazer yaralanma derinliğini belirlemek için en iyi olan cepİşte aynen yaralı olacaktır.
- Bir floresan etiketli hücre hedefleme eğer normal kullanım veya floresan için aydınlık: Deneme görüntülenmesi için gerekli ışığı ayarlayın.
- Yaralanma istenilen derecesine bağlı olarak, hedef bölge, ya da birkaç puls için lazer bir ışık gönder.
4. Yaralama ve Kurtarma Analizi
- Eğer istenirse, lazer yaralanma prosedür canlı (örn. Metamorph yazılım akışı elde etme seçenek kullanılarak). 6 kaydedilebilir
- Hemen yaralama sonra, embriyo forseps ile agaroz gelen yavaşça kaldırılır ve kurtarma için yumurta suya geri konulmalıdır.
Not 2: Atletik aktivite (yüzme ve seğirmesi) iskelet kas kurtarma için özellikle önemlidir. Embriyo tricaine pozlama ve sert agaroz gömme nedeniyle hareket edemez bu yana, recomme değildirçok uzun süre slayt ve lamel arasındaki embriyo korumak için nded.
- Belirtildiği gibi kurtarma sonra, embriyo ışık-, floresan veya konfokal mikroskopi ile bağlanmış ve istenildiği gibi analiz edilebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Lazer-aracılı yaralanma immobilize 1 gün-yaşlı embriyolar üzerinde yapıldı. Şekil 1 'de gösterildiği gibi, bir kaç lazer atımlarının normal olarak somite sınırları arasında gerilir hasarlı, sarmal, Aktin-zengin miyofibril tarafından kolayca tanınabilir, küçük bir yara oluşturabilir. Lazer atımlarının sayısı arttıkça, ancak en fazla miyofibril yok edilir bir ağır hasar somite blok neden olur. Yine de, biz kelimenin tam anlamıyla büyük olanlardan daha hızlı iyileşmesini küçük yaralanmalar ile, "zaman bütün yaraları iyileştirir" olduğunu gözlemleyebilirsiniz. İyileştikten sonra, Aktin renklendirmeler miyofibril tekrar normal somite yayılan olduğunu göstermektedir, ancak ek bilgi Xirp1 için boyama elde edilebilir. Xirp1 protein ektopik eskiden yaralandı kas hücreleri 6 içinde miyofibril iyileşmekte birlikte lokalize olarak yaralanma ve kurtarma, meydana gelmiş olduğu tespit için iyi bir göstergedir.
Bazı amaçlar için, hücreler exactl belirlemek için önemlidiry lazer ile yaralandı, bu nedenle, genetik komşu hücrelere sahip olup olmadığının değerlendirilmesinde hassas olan hücre hedefli ve daha sonra görselleştirmek için edebilmek için bazı hücreler (mosaically bir GFP etiketli proteini ifade ederek örneğin) etiketlemek için yararlı olabilir lazer darbe (Şekil 2) ile de etkilenmektedir. Yara iyileşme ve antikor boyama sonra onu çevreleyen mosaically işaretli hücrelerin model sayesinde tekrar bulmak ve hedef hücre analiz etmek mümkün hale gelir.
Bir ilginç yaklaşım, lazer aracılı yaralanma somitic kas nasıl etkilediğini zaman içinde düzenli olarak izlemektir. Bunun için, immobilize embriyo lazer yaralanma örneğin ilk dakika (Şekil 3) içinde hemen ortaya çıkan etkileri, görmek için canlı olarak kaydedilebilir. Bundan başka, kayıt timelapse hücrelerin yakından yeniden nasıl takip etmek için, arzu edilen herhangi bir zaman aralığı (örneğin 5 dakika aralığı) ile yapılabilmektedirYara yerinde.
Şekil 1. Verdirdiler yaralanma şiddeti göre, yaralanma kurtarma farkı adım aralıklarla devam edecektir. Uygulanan lazer darbeleri sayısına bağlı olarak büyük ölçüde değişebilir, ama sonunda, çoğu yara kapatılır. Biz son zamanlarda bu yaralanma üzerine upregulated ve 32 hpf 6 hasarlı miyofibril olmayan sarkomerik Aktin (kırmızı) lokalize olduğundan Xirp1 (yeşil), kas rejenerasyonu için iyi bir belirteç olduğunu göstermiştir.
Şekil 2. Etiketli hücreler özellikle (Ref 6 değiştirilerek) hedeflenebilir. Cells Tg mozaik ifade ile etiketlenmiş edildi [β-aktin: α-aktinin-GFP] (yeşil veya siyah beyaz). Böyle bir hücre 32 hpf burada hedef ve ciddi birkaç lazer darbeleri tarafından tahrip edilmiştir, gibi kırmızı cıvata ile gösterilir. Beyaz ok yaralı hücreyi gösterir; sarı oklar diğer GFP etiketli hücreleri gösterir. Sağdaki resim, aynı yara iyileşme ve antikor boyama sonra çekilmiştir.
Şekil 3,. Lazer yaralanma Canlı akışı edinimi yaralanma tüm somite blok nasıl etkilediğini ortaya koymaktadır. DIC ile canlı akışı modunda (yani yaklaşık 16 kare / sn) Axioplan kaydedilen tek resimlerin Montage. Lazer 28 hpf de somitic kas vurur yere siyah bir ok gösterir. Kırmızı oklar geri çekilmeden hasarlı uçları göstermektedirmyofibril. Biri somite blok içinde bu dinamik değişiklikleri 2,5 saniye içinde oluştu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Lazer-aracılı yaralanma zebrafish embriyo kontrollü koşullarda rejenerasyon incelemek amacıyla hücreleri ablasyonu ile istenilen büyüklükte yaralar için güçlü bir yöntemdir. Özellikle, tam hücreler hedef olabilir (Şekil 2) ve yara alanı gibi zamanlama her ikisi de kontrol edilebilir. Daha sonra, yaralanma bölgesinde ve yenilenme işlemleri kolayca izlenir, kaydedilmiş (Şekil 3) ve (Şekil 1) analiz edilir. Lazer de x-ve y-ekseninde odaklanmıştır rağmen Ancak, tamamen z ekseni odaklı değildir. Bu ilgi hücreleri altında ya da üstünde yer alan hücrelere zarar verebilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım kas tamir in vivo araştırmalarda geniş bir alanı açılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Çıkar çatışması ilan etti.
Acknowledgments
Biz teknik yardım ve danışma için Bob Nowak (Andor Teknolojisi) teşekkür ederim. SA-S. Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) bir Heisenberg dostluk tarafından desteklenmektedir. Bu eser hibe SE2016/7-1 DFG tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Heating block | |||
| Pair #5 forceps | Dumont | ||
| Glass slides | Menzel | 76 x 26 mm | |
| Coverslips | Roth | 50 x 24 mm #1 | |
| Petroleum jelly | |||
| Stereomicroscope | Leica | MZFLIII | |
| Micropoint laser | Andor Technology | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioplan II | |
| Metamorph software | Molecular devices | ||
Reagents
|
|||
References
- Charge, S. B., Rudnicki, M. A. Cellular and molecular regulation of muscle regeneration. Physiol. Rev. 84, 209-238 (2004).
- Steffen, L. S. The zebrafish runzel muscular dystrophy is linked to the titin gene. Dev. Biol. 309, 180-192 (2007).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Kawahara, G., Serafini, P. R., Myers, J. A., Alexander, M. S., Kunkel, L. M. Characterization of zebrafish dysferlin by morpholino knockdown. Biochem. Biophys. Res. Commun. 413, 358-363 (2011).
- Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strähle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol. Sci. 77, 325-333 (2004).
- Otten, C., et al. Xirp proteins mark injured skeletal muscle in zebrafish. PLoS One. 7, e31041 (2012).
- Roostalu, U., Strähle, U. In vivo imaging of molecular interactions at damaged sarcolemma. Dev. Cell. 22, 515-529 (2012).
- Stickney, H. L., Barresi, M. J., Devoto, S. H.
- Stellabotte, F., Dobbs-McAuliffe, B., Fernandez, D. A., Feng, X., Devoto, S. H. Dynamic somite cell rearrangements lead to distinct waves of myotome growth. Development. 134, 1253-1257 (2007).
- Choi, W. Y., Poss, K. D.
- Stewart, S., Stankunas, K. Limited dedifferentiation provides replacement tissue during zebrafish fin regeneration. Dev. Biol. 365, 339-349 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F.
