Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي

Published: October 19, 2012 doi: 10.3791/4378
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Louisville School of Medicine

Summary

وقد وضعنا مقايسة الانصهار خلية يحدد مقدار كمين بوساطة الانصهار غشاء من الأحداث تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-.

Abstract

تفاعلات الفخ (ق oluble N-ethylmaleimide تراعي عامل البروتين إعادة متقبل ttachment) البروتينات على حويصلات (V-الافخاخ) وعلى الأغشية الهدف (T-الافخاخ) تحفيز الخلايا الانصهار الحويصلة 1-4. المقايسات ضرورية لإعادة تشريح آلية وتنظيم الانصهار غشاء كمين بوساطة 5. في خلية الانصهار 6،7 الفحص، يتم التعبير عن البروتينات الفخ ectopically على سطح الخلية. هذه "انقلبت" محرك الخلية البروتينات الفخ خلايا الانصهار، مما يدل على أن الافخاخ تكفي لصهر الأغشية الخلوية. لأنه يعتمد الفحص على خلية الانصهار التحليل المجهري، فمن أقل كفاءة عندما تستخدم لتحليل متعددة V-T-والتفاعلات كمين كميا.

نحن هنا وصف الفحص الجديدة 8 يحدد مقدار كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-. اثنانوتستخدم عناصر منظومة الجينات التعبير تيت أوف 9 بمثابة نظام قراءات: في transactivator التتراسيكلين التي تسيطر عليها (TTA) ومراسل البلازميد الذي يشفر الجين LacZ تحت سيطرة العنصر التتراسيكلين والاستجابة (TRE-LacZ). نحن بالنقل نقل واكتساب التكنولوجيا في الخلايا COS-7 التي تعبر عن انعكاس V-كمين البروتينات على سطح الخلية (الخلايا V-) وبالنقل TRE-LacZ في الخلايا COS-7 التي تعبر عن انعكاس تي في كمين البروتينات على سطح الخلية (الخلايا التائية) . التي تعتمد على الانصهار كمين للV-والنتائج (خلايا تي) في ملزمة من نقل واكتساب التكنولوجيا لTRE، تفعيل الترانسكربتي من LacZ والتعبير عن غالاكتوزيداز β-. وكميا نشاط غالاكتوزيداز β-اللونية باستخدام طريقة الامتصاص من قبل في 420 نانومتر.

غشاء الحويصلة البروتينات المرتبطة (الرقعات) هي V-الافخاخ الموجودة في حجرات بعد غولجي مختلف حويصلي 10-15. بالإعراب عن الرقعات 1 و 3 و 4 و 5 و 7 و 8 على نفس المستوى، على قارنا الانصهار الغشاءأنشطة باستخدام الانصهار خلية الأنزيمية فحص. القياس الطيفي على أساس هذا الفحص يوفر النهج الكمي لتحليل كمين بوساطة الانصهار غشاء والإنتاجية العالية للدراسات.

Protocol

1. زراعة الخلايا وترنسفكأيشن

  1. يتم استزراع الخلايا COS-7 في متوسطة Dulbecco معدلة النسر (DMEM) تستكمل مع 4.5 جم / لتر والجلوكوز 10٪ مصل بقري جنيني (FBS).
  2. ويتم ترنسفكأيشن مع البلازميد Lipofectamine وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (إينفيتروجن).

2. المجهري مضان من تحليل سطح الخلية التعبير الفخ

  1. والمصنف في اليوم السابق ترنسفكأيشن، 3 × 10 4 COS-7 الخلايا على الزجاج معقمة coverslips 12-مم (فيشر العلمية) الواردة في 24 لوحات جيدة.
  2. ل V-خلايا في كل ميكروغرام جيدا 0.25، من البلازميد الذي يشفر نقل واكتساب التكنولوجيا (pTet أوف، CLONTECH) وبنسبة 0.25 ميكروغرام cotransfected من البلازميدات التي تعبر عن انعكاس الرقعات.
  3. لخلايا تي في كل بئر، وcotransfected 0،25 ميكروغرام من الترميز البلازميد TRE-LacZ (PBI-G، CLONTECH) بنسبة 0.25 ميكروغرام لكل من البلازميدات التي تعبر عن انعكاس SNAP-25 وsyntaxins 1 أو 4.
  4. بعد 24 ساعة ريتم إصلاح ransfection، والخلايا مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني + + (PBS تستكمل مع 0.1 غرام / لتر CaCl 2 و 0.1 غ / لتر MgCl 2) لمدة 10 دقيقة، ومنعت بعد ذلك في FBS 10٪ في برنامج تلفزيوني + + لمدة 30 دقيقة.
  5. يتم تحضين الخلايا مقابل 1.5 ساعة مع 9E10 مكافحة Myc على الأجسام المضادة أحادية المنشأ (أنيق طاف ورم هجين الثقافة).
  6. بعد أربعة يغسل مع PBS + +، يتم تحضين الخلايا ل1 ساعة مع FITC، مترافق الأجسام المضادة الثانوية (جاكسون المختبرات Immunoresearch) حتى التخفيف 1:500.
  7. بعد أربعة يغسل مع PBS + +، هي التي شنت الخلايا المسمى في إطالة الذهب كاشف antifade (إينفيتروجن).
  8. يتم جمع الصور مبائر على مجهر المسح الضوئي ليزر متحد البؤر أوليمبوس. تتم معالجة الصور مع برنامج أدوبي فوتوشوب.

3. FACS تحليل سطح الخلية التعبير الفخ

  1. والمصنف في اليوم السابق ترنسفكأيشن، 2 × 10 5 خلايا COS-7 في كل بئر من 6 لوحات جيدا.
  2. بعد 24 ساعة هيئة تنظيم الاتصالاتnsfection مع انقلبت الفخ، pTet خارج البلازميدات وPBI-G، يتم إصلاح الخلايا مع 1٪ في بارافورمالدهيد PBS + + لمدة 15 دقيقة، ومنعت بعد ذلك في FBS 10٪ في برنامج تلفزيوني + + لمدة 15 دقيقة.
  3. يتم تحضين الخلايا مع 9E10 مكافحة Myc على الأجسام المضادة أحادية المنشأ لمدة 60 دقيقة.
  4. بعد ثلاث غسلات مع PBS + +، وصفت الخلايا مع أجسام مضادة FITC، مترافق الثانوية (1:200 التخفيف) لمدة 45 دقيقة.
  5. بعد ثلاث غسلات مع PBS + +، يتم كشط الخلايا قبالة لوحات مع مكشطة الخلية.
  6. ويتم تحليل الخلايا 15000 باستخدام قياس التدفق الخلوي FACSCalibur (BD العلوم البيولوجية). يتم الحصول على كثافة مضان يعني من كل عينة باستخدام CellQuest برو البرمجيات.

4. الأنزيمية فحص خلية الانصهار

  1. والمصنف في اليوم السابق ترنسفكأيشن، 1.2 × 10 6 خلايا COS-7 في كل طبق زراعة الأنسجة 100-مم، و 2 × 10 5 والمصنف COS-7 خلايا في كل بئر من 6 لوحات جيدا.
  2. ل V-الخلايا، 0،5 حتي 5 ميكروغرام لكل من flippوcotransfected إد الرقعه البلازميد مع 5 ميكروغرام من pTet أوف في الخلايا في كل طبق الثقافة 100-مم. وcotransfected خلايا التحكم مع pcDNA3.1 ناقلات الفارغة (+) وpTet خارج. لمنع N-بالغليكوزيل من الرقعات 1 و 4 و 5 و 7 و 8، tunicamycin (10 ميكروغرام / مل) يتم تضمينها في المتوسط ​​خلال زراعة الخلايا ترنسفكأيشن.
  3. انقلبت لخلايا تي في كل بئر من لوحات 6 جيدا، 1 ميكروغرام من انقلبت SNAP-25 البلازميد وcotransfected PBI-G مع 0.5 ميكروغرام من syntaxin1 البلازميد أو 0.05 ميكروغرام من syntaxin4 انقلبت البلازميد.
  4. 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن، وفصل الخلايا من V-الأطباق الثقافة مع خلية التفكك الاحتياطي خالية من إنزيم (إينفيتروجن). يتم عد الخلايا منفصلة مع عدادة الكريات ومعلق في HEPES مخزنة DMEM تستكمل مع FBS 10٪، 6.7 ميكروغرام / مل و 0.67 tunicamycin DTT ملم.
  5. تضاف 4،8 × 10 5 خلايا معلق V-إلى كل بئر تحتوي بالفعل على الخلايا التائية.
  6. بعد الفئران ساعة 6 أو 12 أو 24 37 ° C CO في 5٪ 2
  7. بعد 90 دقيقة، يتم إيقاف رد فعل اللونية بإضافة 1 كربونات الصوديوم M.
  8. يتم قياس الامتصاصية في 420 نانومتر باستخدام 100-40 HITACHI الطيف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

لوضع الانصهار خلية الكمية الفحص، ونحن الاستفادة من تفعيل النسخي وقوية من قبل ملزمة للنقل واكتساب التكنولوجيا لTRE. في حالة عدم وجود نقل واكتساب التكنولوجيا، نسخ من الجين LacZ في TRE-LacZ صامت. عندما نقل واكتساب التكنولوجيا موجودة، فإنه يربط إلى TRE وينشط النسخ من LacZ. ويظهر الشكل 1 مخطط انسيابي للفحص خلية الانصهار الأنزيمية. وتقاس نقل واكتساب التكنولوجيا في الخامس والخلايا التي تقاس صريحة V-كمين البروتينات على سطح الخلية، وTRE-LacZ إلى خلايا تي T-تعبر عن كمين البروتينات على سطح الخلية. الانصهار في الخامس والنتائج (خلايا تي) في ملزمة من نقل واكتساب التكنولوجيا لTRE، تفعيل الترانسكربتي من LacZ، والتعبير عن غالاكتوزيداز β-.

الرقم 2A يوضح بنية المجال من يبني كمين انقلبت. وتنصهر تسلسل إشارة إلى preprolactin N-تيرميني من الافخاخ. وتسمى هذه الافخاخ هندسيا 'انقلبت'الافخاخ لأنه انقلبت اتجاه الزخارف كمين ضد الأغشية الخلوية. انقلبت عندما تقاس COS-7 الخلايا مع البلازميدات كمين انقلبت، يتم التعبير عن البروتينات الفخ على سطح الخلية (الشكل 2B). يتم استخدام التدفق الخلوي لقياس مستويات التعبير في كمين للبروتينات سطح الخلية (2C وأرقام D). من أجل مقارنة قدراتها الانصهار الغشاء، الرقعات تحتاج إلى أعرب في نفس المستوى. ولذلك، فإننا معاير والأمثل تركيز كل انقلبت كمين البلازميد المستخدمة في ترنسفكأيشن. وتقاس انقلبت البلازميدات كمين في التركيزات التالية (لكل 10 سم منطقة النمو 2، أي لكل بئر في 6 لوحات جيدا): VAMP1، 0.2 ميكروغرام؛ VAMP3، 0.5 ميكروغرام؛ VAMP4، 0.5 ميكروغرام؛ VAMP5، 0.05 ميكروغرام؛ VAMP7، 1.0 ميكروجم؛ VAMP8، 0.1 ميكروغرام؛ syntaxin1، 0.5 ميكروغرام؛ syntaxin4، 0.05 ميكروغرام. وcotransfected نقل واكتساب التكنولوجيا، TRE LacZ وانقلبت SNAP-25 في 1 ميكروغرام لكل 10 سم منطقة النمو 2. تحت يمثيتم التعبير عن ظروف ح، الرقعات 1 و 3 و 4 و 5 و 7 و 8 على نفس المستوى، في حين يتم التعبير عن syntaxins 1 و 4 على نفس المستوى على سطح الخلية (الشكل 2D). كما هو موضح من قبل مبائر وعلى النقيض مرحلة تحليل الصور (2E الشكل)، وتقاس 80٪ من الخلايا COS-7 مع البلازميدات كمين انقلبت. تحليل التصوير المزدوج وضع العلامات (الشكل 2F) إلى أن 70٪ من خلايا-V بالنقل عن كل من نقل واكتساب التكنولوجيا وانقلبت البروتينات الرقعه. لأنه لم يتم التعبير عن الجينات في LacZ TRE-LacZ قبل الانصهار خلية، ونحن غير قادرين على تحديد نسبة بالنقل الخلايا التائية التي تعبر عن كل TRE-LacZ وانقلبت تي كمين البروتينات.

يتم استخدام الخلايا العصبية الافخاخ (V-كمين VAMP2، وsyntaxin1 تي الافخاخ وSNAP-25) التي تتوسط الإيماس متشابك لاختبار جدوى الفحص. في الواقع، عندما يتم الجمع بين الخامس والخلايا معربا عن VAMP2 الخلايا التائية، معربا عن syntaxin1/SNAP-25 وقوية β-galacتم الكشف عن التعبير tosidase (الشكل 3). ومع ذلك، عندما لا يتم التعبير عن VAMP2 أو SNAP 25-، تم الكشف عن خط الأساس β-فقط غالاكتوزيداز النشاط، مشيرا إلى أن خلية الانصهار والتعبير عن غالاكتوزيداز β-تعتمد على تفاعلات-V و T-الافخاخ. هذه النتائج تشير إلى أن خلية الانصهار الأنزيمية فحص يحدد حدودا بين fusogenic-V و T-بكفاءة الافخاخ.

بالإعراب عن البروتينات الرقعه على نفس المستوى على سطح الخلية (الشكل 2D)، قارنا أنشطتها الانصهار الغشاء. مع T-الافخاخ syntaxin1/SNAP-25، الرقعات 1، 3، و 8 لديك للمقارنة وأنشطة الأعلى الانصهار، في حين الرقعات 4 و 7 يكون 50٪ والأنشطة الانصهار 30٪ أقل، على التوالي (الشكل 4). في المقابل، عندما يتم الجمع بين VAMP5 مع T-الافخاخ، تم الكشف عن خط الأساس β-فقط غالاكتوزيداز النشاط (الشكل 4)، مما يوحي بأن لا تدفع VAMP5 الانصهار الغشاء مع syntaxin1/SNAP-25.

الشكل 1
الشكل 1. الأنزيمية فحص الانصهار خلية. ونقل واكتساب التكنولوجيا cotransfected مع البلازميدات V-كمين انقلبت، وcotransfected TRE-LacZ مع البلازميدات تي كمين انقلبت. الانصهار الخامس وخلايا تي يؤدي إلى ربط نقل واكتساب التكنولوجيا لTRE والتعبير عن غالاكتوزيداز β-، والتي تقاس بطريقة اللونية.

الشكل 2
الشكل 2. التعبير عن الافخاخ انقلبت على سطح الخلية. (A) انقلبت بنية المجال من الافخاخ. تسلسل إشارة preprolactin (SS) وتنصهر إلى N-تيرميني من الافخاخ، ويتم إدراج علامة Myc على تسلسل بين الإشارة والعناصر الزخرفية كمين (لفائف ملفوف). (B) وcotransfected COS-7 الخلايا مع نقل واكتساب التكنولوجيا وناقلات الفارغة pcDNA3.1 (+) أو انقلبت VAMP5 البلازميد. 24ساعة بعد ترنسفكأيشن، ملطخة الخلايا unpermeabilized مع جسم مضاد ضد Myc على وحيدة النسيلة. وتظهر ممثل واحد شريحة الصور مبائر. انقلبت (C D و) 24 ساعة بعد نقل واكتساب التكنولوجيا وcotransfection مع pcDNA3.1 (+) أو انقلبت الرقعات (V-الخلايا)، أو 24 ساعة بعد cotransfection مع TRE-LacZ، SNAP-25 وsyntaxins 1 أو 4 (خلايا تي )، ملطخة الخلايا unpermeabilized مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على وتحليلها من قبل التدفق الخلوي. (C) الممثل ملامح FACS من الخلايا transfected مع pcDNA3.1 (+) أو انقلبت VAMP1 البلازميد. يتم تحديد كثافة مضان يعني من كل عينة باستخدام CellQuest برو البرمجيات. انقلبت (D) للتعبير عن الرقعات على نفس المستوى وسرعة syntaxins 1 و 4 على نفس المستوى على سطح الخلية، وتقاس البلازميدات كمين بتركيزات معاير. أظهرت هي شدة يعني مضان من تلطيخ سطح الخلية من البروتينات الفخ. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري من 4 تجارب مستقلة. (E و F) 24 ساعة بعد cotransfe انقلبت ction مع نقل واكتساب التكنولوجيا وVAMP5 البلازميد، وpermeablized الخلايا مع 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني + + و (E) ملطخة الضد مكافحة Myc على، أو (F) الملون المزدوج مع الأجسام المضادة لمكافحة Myc على المضادة والأجسام المضادة بولكلونل إلى وقامع TET (للكشف عن نقل واكتساب التكنولوجيا). (E) المعروضة هي مبائر ممثل والصور النقيض المرحلة. عدد الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل التي وصفت من قبل الأجسام المضادة لمكافحة Myc على (VAMP5) والعدد الكلي للخلايا في مرحلة قناة المقابل يتم عد (ن = 60 خلايا)، ويتم حساب الكفاءة ترنسفكأيشن (80٪). (F) عدد الخلايا التي تعبر عن كل بالنقل ونقل واكتساب التكنولوجيا VAMP5، والعدد الإجمالي للخلايا التي يتم عد بالنقل صريحة VAMP5، نقل واكتساب التكنولوجيا أو كليهما (ن = 75 الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل). ثم يتم حساب النسبة المئوية للخلايا التي تعبر عن كل بالنقل ونقل واكتساب التكنولوجيا VAMP5 (70٪). على نطاق والحانات، و 20 ميكرومتر. اضغط هنا لمشاهدتها بشكل اكبر شخصية .

"FO: المحافظة على together.within صفحة =" دائما "> الشكل 3
الشكل 3. خلية الانصهار تعتمد على تفاعلات-V و T-الافخاخ. V-الخلايا التي يتم تحضين صريح نقل واكتساب التكنولوجيا وVAMP2 مع خلايا تي التي تعبر عن TRE-LacZ، وsyntaxin1 25-SNAP. بعد 24 ساعة، والخلايا هي lysed ويتم تحديد نشاط غالاكتوزيداز β-في الخلية لست] باستخدام طريقة اللونية بواسطة الامتصاصية في 420 نانومتر. تم الكشف عن خط الأساس فقط B-غالاكتوزيداز النشاط عندما انقلبت إما VAMP2 أو تم حذف SNAP-25 البلازميد من ترنسفكأيشن.

الشكل 4
الشكل 4. مقارنة بين أنشطة اندماج الرقعات. في ظل ظروف ترنسفكأيشن الأمثل، الرقعات 1 و 3 و 4 و 5 و 7 و 8 وأعرب في نفس المستوى على سطح خلية من خلايا V-. 24 ساعة بعد الجمع بين الخامس الخلايا التي تحتوي على خلايا تي التي السابقينالصحافة syntaxin1/SNAP-25، وكميا باستخدام الانصهار خلية خلية الانصهار الأنزيمية فحص. أشرطة الخطأ تمثل الانحراف المعياري من 4 تجارب مستقلة. ** P <0.01؛ *** P <0.001 مقابل VAMP1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

انصهار الخلية الأصلية مقايسة 6 يحدد كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية بواسطة المجهر مضان. نحن هنا وصف لفحص مبتكرة يحدد مقدار كمين بوساطة الأحداث الانصهار خلية تنشيط التعبير من غالاكتوزيداز β-وقياس الطيفي. باستخدام هذا الاختبار، نحن نحلل بشكل روتيني 15 حتي 20-V و T-كمين مجموعات في تجربة واحدة. باستخدام التدفق الخلوي لقياس التعبير في كمين سطح الخلية، ونحن عاير مستويات التعبير عن الرقعات وقدراتها مقارنة الانصهار غشاء (أرقام 2 و 4). وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الانصهار خلية الأنزيمية فحص، قررنا اعتماد النشاط الانصهار خلية على سطح الخلية من كثافة VAMP1 البروتين، ويلاحظ أي من cooperativity VAMP1 البروتين في الخلية رد فعل الانصهار 8، مما يدل على أن غير مطلوب اتخاذ إجراءات متضافرة من المجمعات متعددة الفخ لتلتحم الأغشية الخلوية.

هناك ارتباط بالغليكوزيل المفترضة N-موتيFS (Asn-X-Ser/Thr) في كمين البروتينات. لأن N-بالغليكوزيل يحول دون اندماج الأنشطة انقلبت كمين البروتينات 6، وقد استخدمت نهجين لمنع ارتباط بالغليكوزيل من البروتينات الفخ انقلبت. أولا، يتم إدخال ارتباط بالغليكوزيل في الموقع الطفرات في كمين انقلبت يبني 6. الثانية، كما هو موضح في البروتوكول الحالي، يتم تضمين tunicamycin المانع N-بالغليكوزيل (6.7 ميكروغرام / مل) في الخلية رد فعل الانصهار. وبالإضافة إلى ذلك، يتم إضافة 0،67 ملم DTT في الخلية لمنع رد فعل الانصهار تشكيل السندات ثاني كبريتيد بين البروتينات الفخ انقلبت، التي من شأنها أن تمنع الأنشطة الانصهار الفخ. تجاربنا تبين أن إضافة قدره 6.7 ميكروغرام / مل و 0.67 tunicamycin DTT ملم في مستنبت الخلية لا تتداخل مع انتشار وبقاء COS-7 الخلايا. نحن بشكل روتيني إنهاء رد فعل الانصهار خلية في 24 ساعة بعد الجمع بين الخامس والخلايا التائية. ومع ذلك، تم الكشف عن خلية الانصهار كبيرة كمين بوساطة 6 ساعة بعد الجمع بين الخامس علىالثاني (خلايا تي) 8. لأن الانصهار خلية الأنزيمية رد فعل يعتمد على التعبير عن غالاكتوزيداز β-بعد الانصهار خلية، وبالطبع الوقت لهذا النظام قراءات متأخرة أثناء وقت الانصهار الغشاء بوساطة البروتينات الفخ انقلبت.

انصهار الخلية الأنزيمية فحص يقدم مقايسة الكمية إعادة للنظر في أنشطة الاندماج غشاء من التفاعلات-V و T-الفخ المحتملة في خلايا الثدييات. من البروتينات التنظيمية coexpressing (على سبيل المثال، Munc18) والافخاخ على سطح الخلية أو عن طريق بما في ذلك المؤتلف البروتينات التنظيمية في الخلية رد فعل الانصهار، يمكن استخدام هذا الاختبار لتوضيح آليات تنظيمية من الانصهار الغشاء بوساطة كمين. وبالإضافة إلى ذلك، ينبغي لهذا الفحص أن تكون لها تطبيقات في الفرز الفائق الإنتاجية لمثبطات أو تفعيل الانصهار الغشاء بوساطة كمين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم هذا العمل من جانب صناديق بدء التشغيل من جامعة لويزفيل وCA135123 من المعاهد الوطنية للصحة (لCH).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM Invitrogen 12800-017
COS-7 cells ATCC CRL-1651
tunicamycin Sigma-Aldrich T7765-5MG
pTet-Off Clontech K1620-A
pBI-G Clontech 6150-1
lipofectamine Invitrogen 18324-012
Enzyme-free cell dissociation solution Invitrogen 13151-014
Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody Millipore AB3541
FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 715-095-150
Laser scanning confocal microscope Olympus FV1000
FACSCalibur flow cytometer BD Biosciences
β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer Promega E2000
Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer Hitachi C740843

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rothman, J. E. Mechanisms of intracellular protein transport. Nature. 372, 55-63 (1994).
  2. Jahn, R., Lang, T., Sudhof, T. C. Membrane fusion. Cell. 112, 519-533 (2003).
  3. Bonifacino, J. S., Glick, B. S. The mechanisms of vesicle budding and fusion. Cell. 116, 153-166 (2004).
  4. Jahn, R., Scheller, R. H. SNAREs--engines for membrane fusion. Nature. 7, 631-643 (2006).
  5. Weber, T. SNAREpins: minimal machinery for membrane fusion. Cell. 92, 759-772 (1998).
  6. Hu, C. Fusion of cells by flipped SNAREs. Science (New York, N.Y). 300, 1745-1749 (2003).
  7. Hu, C., Hardee, D., Minnear, F. Membrane fusion by VAMP3 and plasma membrane t-SNAREs. Experimental cell research. 313, 3198-3209 (2007).
  8. Hasan, N., Corbin, D., Hu, C. Fusogenic Pairings of Vesicle-Associated Membrane Proteins (VAMPs) and Plasma Membrane t-SNAREs - VAMP5 as the Exception. PloS one. 5, e14238 (2010).
  9. Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 89, 5547-5551 (1992).
  10. Hanson, P. I., Heuser, J. E., Jahn, R. Neurotransmitter release - four years of SNARE complexes. Current opinion in neurobiology. 7, 310-315 (1997).
  11. McMahon, H. T. Cellubrevin is a ubiquitous tetanus-toxin substrate homologous to a putative synaptic vesicle fusion protein. [see comments. Nature. 364, 346-349 (1993).
  12. Steegmaier, M., Klumperman, J., Foletti, D. L., Yoo, J. S., Scheller, R. H. Vesicle-associated membrane protein 4 is implicated in trans-Golgi network vesicle trafficking. Molecular biology of the cell. 10, 1957-1972 (1999).
  13. Zeng, Q. A novel synaptobrevin/VAMP homologous protein (VAMP5) is increased during in vitro myogenesis and present in the plasma membrane. Molecular biology of the cell. 9, 2423-2437 (1998).
  14. Galli, T. A novel tetanus neurotoxin-insensitive vesicle-associated membrane protein in SNARE complexes of the apical plasma membrane of epithelial cells. Molecular biology of the cell. 9, 1437-1448 (1998).
  15. Wong, S. H. Endobrevin, a novel synaptobrevin/VAMP-like protein preferentially associated with the early endosome. Molecular biology of the cell. 9, 1549-1563 (1998).

Tags

البيولوجيا الجزيئية، العدد 68، الكيمياء الحيوية، علم الأحياء الخلوي، الفخ، الغشاء الانصهار، الرقعه، syntaxin، الحويصلات
تحليل الانصهار الغشاء بوساطة كمين باستخدام الانصهار خلية الفحص الانزيمي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hasan, N., Humphrey, D., Riggs, K.,… More

Hasan, N., Humphrey, D., Riggs, K., Hu, C. Analysis of SNARE-mediated Membrane Fusion Using an Enzymatic Cell Fusion Assay. J. Vis. Exp. (68), e4378, doi:10.3791/4378 (2012).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter