Summary
我们已经开发出一种量化SNARE介导膜融合事件由激活的β-半乳糖苷酶的表达的细胞融合实验。
Abstract
T-SNARE蛋白的相互作用的SNARE（oluble N-乙基马来酰亚胺敏感因子一个的重整 ttachment蛋白受体）的目标膜蛋白在囊泡（V-SNARE蛋白）和（）催化细胞内的囊泡融合1-4。重组分析是必不可少的解剖机制和调节SNARE蛋白介导的膜融合5。在细胞融合实验6,7中 ，异位SNARE蛋白表达在细胞表面。这些“翻转”SNARE蛋白驱动细胞与细胞融合，展示，网罗足够细胞膜融合。由于测定是基于微观分析的细胞融合，它是低效率的，使用时，多个的v-叔SNARE相互作用定量分析。
在这里，我们描述了一种新的检测的量化β-半乳糖苷酶的活性表达的SNARE蛋白介导的细胞融合。二在Tet-关基因表达系统9的组件被用作读出系统：四环素控制的反式激活（tTA的）和四环素反应元件（TRE-LacZ的）的控制下，编码的LacZ基因的报道质粒。我们tTA的转染到COS-7细胞表达翻转的v-SNARE蛋白在细胞表面（的v-细胞）和TRE-LacZ基因转染到COS-7细胞表达翻转叔SNARE蛋白在细胞表面（t细胞） 。 SNAP-依赖的融合的v-和T-细胞的查询结果中的结合的tTA的TRE，LacZ和β-半乳糖苷酶的表达的转录激活。 β-半乳糖苷酶的活性，使用的比色的方法通过在420 nm处的吸光度进行定量。
囊泡相关膜蛋白（VAMPS），是V-SNARE蛋白驻留在不同的后高尔基体泡状车厢10-15。鞋面1，3，4，5，7和8，在相同的水平表达，我们比较了它们的膜融合活动中使用的酶的细胞融合实验。基于光谱测量，该法提供了一个量化的方法分析SNARE蛋白介导的膜融合，为高通量研究。
Protocol
1。细胞培养和转染
- 补充与4.5克/升葡萄糖和10％牛胎儿血清（FBS）的Dulbecco改良的Eagle氏培养基（DMEM）中培养COS-7细胞。
- 根据制造商的说明（Invitrogen公司），与Lipofectamine质粒转染。
2。 SNARE细胞表面表达的荧光显微分析
- 转染前一天，3×10 4个 COS-7细胞接种在无菌的12毫米的盖玻片（Fisher Scientific）的24孔培养板中所载。
- 对于v-细胞，在各孔中，0.25微克，编码tTA的质粒（pTet-关闭，CLONTECH公司）共转染的质粒表达翻转VAMPS用0.25微克。
- 0.25微克的质粒编码TRE-LacZ的（的pBI-G，CLONTECH公司）对于t在每个孔中的细胞，用0.25微克表示翻转SNAP-25和syntaxins 1或4的每一个的质粒共转染。
- 24小时后T转染的，固定细胞，用4％的多聚甲醛（PBS补充有0.1克/升CaCl 2和0.1克/升的MgCl 2）10分钟，然后在10％FBS的在PBS中的阻塞，在PBS + + + + 30分钟。
- 与抗Myc单克隆抗体9E10（纯的杂交瘤培养上清液），将细胞温育1.5小时。
- PBS + +洗涤四次后，将细胞温育1小时，在1:500稀释的FITC标记的二次抗体（Jackson ImmunoResearch Laboratories公司）。
- 洗涤四次后用PBS + +，标记的细胞被安装在延长Gold抗淬灭试剂（Invitrogen）。
- 共聚焦图像采集的奥林巴斯激光扫描共聚焦显微镜。与Adobe Photoshop软件处理图像。
3。流式细胞仪检测细胞表面SNARE表达
- 转染前一天，2×10 5 COS-7细胞接种于6孔培养板的各孔中。
- 24小时后，TRAnsfection与翻转圈套，pTet-Off和的pBI-G质粒，细胞被固定，用1％多聚甲醛的PBS + +的15分钟，然后在10％FBS在PBS + + 15分钟中断。
- 将细胞孵育60分钟抗Myc单克隆抗体9E10。
- 洗涤三次后，用PBS + +中，被标记细胞用FITC标记的二次抗体（1:200稀释），45分钟。
- 用PBS洗涤三次后，+ +，将细胞刮下板，用细胞刮刀破碎。
- 使用FACSCalibur流式细胞仪（BD Biosciences公司），分析了15,000个细胞。使用CellQuest Pro软件得到各样品的平均荧光强度。
4。酶细胞融合含量
- 转染前一天，1.2×10 6个 COS-7细胞接种于每100毫米的组织培养皿中，和2×10 5 COS-7细胞接种于6孔培养板的各孔中。
- 对于v-细胞，0.5 - 5微克每个flipp编辑VAMP质粒共转染pTet关闭到每100毫米的培养皿中的细胞用5μg。控制细胞转染空载体pcDNA3.1（+）和pTet关闭。为了防止鞋面1，4，5，7和8，衣霉素的N-糖基化的（10微克/毫升）被包括在转染细胞培养基中。
- 对于t-细胞的6孔培养板的各孔中，1微克翻转SNAP-25质粒的pBI-G的共转染0.5μg的翻转的翻转syntaxin4质粒syntaxin1质粒或0.05微克。
- 转染后24小时，培养皿与酶的无细胞解离缓冲液（Invitrogen）中的v-细胞脱离。剥离的细胞，用血细胞计数器计数，并再悬浮在HEPES缓冲的DMEM培养液含10％FBS，6.7微克/毫升衣霉素和0.67 1mM DTT的。
- 4.8×10 5再悬浮的v-细胞被添加到每个孔中已经含有的t-细胞。
- 6，第12或24小时后的大鼠37℃，在5％CO 2的
- 90分钟后，停止显色反应，通过加入1M碳酸钠。
- 在420 nm处的吸光度测量采用日立100-40分光光度计。
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Representative Results
要制定一个定量的细胞融合实验，我们利用强有力的转录激活TTA到TRE的结合。在tTA的的情况下，转录的 LacZ基因在TRE-LacZ的是无声的。 tTA的存在时，它的TRE结合并激活的 LacZ基因的转录， 图1示出了流程图的酶的细胞融合实验。 tTA的转染到v-细胞表达的v-SNARE蛋白在细胞表面，和TRE-LacZ基因转染到t细胞，在细胞表面的表达叔SNARE蛋白。的v-和T-细胞的查询结果中的结合的tTA的TRE 的 LacZ基因的转录活化，和β-半乳糖苷酶的表达的融合。
图2A示出的结构域结构的翻转SNARE构造。的preprolactin信号序列的N-末端的SNAREs融合。这些工程SNARE蛋白被称为“翻转”斯耐尔因为其SNARE图案的取向对细胞膜被翻转。当与翻转SNARE质粒转染COS-7细胞时，翻转SNARE蛋白表达在细胞表面（ 图2B）。流式细胞仪是用来测量SNARE蛋白的表达水平在细胞表面（ 图2C和D）。为了比较它们的膜融合能力，鞋面需要表示在同一水平。因此，我们滴定的和优化的浓度每个翻转SNARE质粒中使用转染。翻转SNARE质粒转染在下列浓度（每10cm 2的增长领域， 即 ，在6孔培养板每孔）：VAMP1，0.2微克; VAMP3，含0.5μg; VAMP4，含0.5μg; VAMP5，0.05微克; VAMP7 1.0微克; VAMP8，0.1微克; syntaxin1，含0.5μg; syntaxin4，0.05微克。共转染TTA，TRE-LacZ和翻转SNAP-25在1微克每10平方厘米的增长领域。在SUCĤ条件，鞋面1，3，4，5，7和8是表示在相同的水平，而syntaxins 1和图4表示在同一水平在细胞表面（ 图2D）。正如所示的共聚焦，相位相反的图像分析（ 图2E），80％的COS-7细胞的转染与翻转SNARE质粒。双重标记成像分析（ 图2F）表明，70％的转染的v-细胞同时表达tTA的和翻转VAMP蛋白质。由于在TRE-LacZ的LacZ基因不表达在细胞融合之前，我们不能够确定同时表达TRE-LacZ和翻转叔SNARE蛋白的转染的T细胞的百分比。
神经元斯耐尔（的v-SNARE VAMP2，和叔 - 斯耐尔syntaxin1和SNAP-25）介导突触胞吐作用的用于测试的测定法的可行性。事实上，当v-细胞表达VAMP2和t-细胞表达syntaxin1/SNAP-25相结合，鲁棒的β-半乳tosidase检测到表达（ 图3）。然而，不表达时，无论VAMP2或SNAP-25，仅基线的β-半乳糖苷酶的活动被检测到，这表明细胞融合和β-半乳糖苷酶的表达依赖于相互作用的v-和t-斯耐尔。这些结果表明，酶的细胞融合实验在v-和t-SNARE蛋白有效地标识膜融合的配对。
通过表达VAMP蛋白在细胞表面处于同一水平（ 图2D），我们比较了它们的膜融合活动。随着叔斯耐尔syntaxin1/SNAP-25，鞋面1，第3，和8具有可比性和最高的融合，而鞋面4和7具有50％和30％下的融合活动，（ 图4）分别。相比之下，当结合与t-斯耐尔VAMP5时，被检测到仅基线的β-半乳糖苷酶的活性（ 图4），这表明VAMP5不驱动膜融合与SYNTaxin1/SNAP-25。
图1。酶法细胞融合实验。 TTA的翻转V-SNARE质粒的共转染，转染和TRE-LacZ的翻转T-SNARE质粒的。的v-和t-细胞的融合导致的结合tTA的TRE和通过比色的方法，其测量的β-半乳糖苷酶的表达。
图2中的表达在细胞表面的翻转斯耐尔。 （A）翻转域结构的圈套。 （SS）preprolactin信号序列融合到SNARE蛋白的N-末端，并插入一个Myc标签之间的信号序列和SNARE基序（卷曲螺旋）。 （B）被共转染COS-7细胞与tTA的和空载体pcDNA3.1（+），或翻转VAMP5质粒。 24小时转染后，用抗Myc单克隆抗体。unpermeabilized的细胞被染成代表单片的共聚焦图像显示。 （C和D）24小时后，与tTA的和pcDNA3.1（+）的共转染，或翻转鞋面（五-细胞），或与TRE-LacZ的共转染后的24小时，翻转SNAP-25和syntaxins 1或4（t细胞），unpermeabilized细胞的抗Myc抗体染色，并用流式细胞仪分析。 （C）代表FACS公司转染的细胞，将pcDNA3.1（+），或翻转VAMP1质粒。使用CellQuest Pro软件确定各样品的平均荧光强度。 （D）表示VAMPS在同一水平和快速syntaxins 1和4在细胞表面在同一水平，翻转SNARE质粒转染浓度在滴定。所示SNARE蛋白染色的细胞表面的平均荧光强度。误差棒表示标准偏差4个独立实验。 （E，F）24小时后，cotransfe ction与tTA的和翻转VAMP5质粒，细胞被permeablized与0.2％的Triton X-100在PBS + +和（E）染色，用抗Myc抗体，或（F）的双染色的抗Myc单克隆抗体和一个多克隆抗体以TET阻遏（检测tTA的）。 （E）是代表聚焦和相位对比图像。由的抗Myc的抗体（VAMP5）和总相衬通道中的细胞数进行计数的组（n = 60细胞），并计算转染效率（80％）被标记为的转染的细胞的数目。 （F）的数目的同时表达VAMP5和tTA的转染细胞，转染的细胞的总数，明示VAMP5，tTA的或两者进行计数（n = 75人转染的细胞）。然后计算同时表达VAMP5和tTA的转染的细胞的百分比（70％）。比例尺，20微米。 点击此处查看大图 。
图3。细胞融合取决于上的v-和t-SNARE蛋白的相互作用。 V-表示TTA和VAMP2培养的T细胞，细胞表达TRE-LacZ的，syntaxin1和SNAP-25。 24小时后，裂解细胞和细胞裂解物中的β-半乳糖苷酶的活性来确定使用的比色的方法通过在420 nm处的吸光度。仅基线β-半乳糖苷酶的活性来检测时，无论翻转VAMP2或SNAP-25质粒省略从转染。
图4。融合活动VAMPS比较。在优化的转染条件下，鞋面1，3，4，5，7和8是表示在同一水平的v-细胞在细胞表面。用t-细胞结合的v-细胞的24小时后，前按syntaxin1/SNAP-25，细胞融合使用的酶的细胞融合实验量化。误差棒表示标准偏差4个独立实验。 ** P <0.01，*** P <0.001与VAMP1。
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Discussion
原细胞融合实验6荧光显微镜决定SNARE蛋白介导的细胞融合。在这里，我们描述了一个创新的分析，量化SNARE蛋白介导的细胞融合，通过激活β-半乳糖苷酶的表达和光谱测量。使用这个实验中，我们经常分析15 - V-20和T-SNARE组合在一个单一的实验。使用流式细胞仪来测量圈套在细胞表面的表达，我们滴定的鞋面的表达水平，并比较它们的膜融合的能力（图2和图4）。此外，使用的酶的细胞融合实验，我们确定密度VAMP1蛋白的细胞表面上的细胞融合活性的依赖，并没有观察到协同性VAMP1蛋白在细胞融合反应8，这表明多个SNARE复合物不需要协调一致的行动融合细胞的膜。
是公认的N-糖基化莫蒂FS（Asn-X-Ser/Thr）在SNARE蛋白。由于N-糖基化抑制融合活动翻转SNARE蛋白6，有两种方法已被用来防止翻转SNARE蛋白的糖基化的。首先，糖基化位点突变导入翻转SNARE构成体6。其次，所述的N-糖基化抑制剂衣霉素（6.7微克/毫升）在目前的协议，包括在细胞融合反应。此外，加入0.67 1mM DTT的细胞融合反应中，以防止翻转SNARE蛋白之间的二硫键的形成，这将抑制SNARE融合活动。我们的实验表明，增加了6.7微克/毫升衣霉素和0.67毫米DTT细胞培养液中不会干扰COS-7细胞的增殖和存活的。我们常规终止结合的v-和T-细胞的细胞融合后，在24小时反应。然而，重大SNAP-介导的细胞融合被检测到6小时，合成后的V-AND T细胞。因为酶的细胞融合反应依赖于β-半乳糖苷酶的表达，细胞融合后，此读出系统的时间过程的滞后翻转SNARE蛋白介导的膜融合过程中的时间。
的酶的细胞融合实验用于检查潜在的v-和t-SNARE在哺乳动物细胞中的相互作用的膜融合活动提供一个定量重组测定。通过共表达调节蛋白（ 例如 ，Munc18）和SNARE蛋白在细胞表面或通过包括重组调节蛋白在细胞融合反应，该法可用于阐明SNARE介导膜融合的调控机制，。此外，该法应SNARE介导膜融合抑制剂或活化剂的高通量筛选中的应用程序。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是支持的大学，路易斯维尔和CA135123从美国国立卫生研究院（CH）的启动资金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Invitrogen | 12800-017 | |
| COS-7 cells | ATCC | CRL-1651 | |
| tunicamycin | Sigma-Aldrich | T7765-5MG | |
| pTet-Off | Clontech | K1620-A | |
| pBI-G | Clontech | 6150-1 | |
| lipofectamine | Invitrogen | 18324-012 | |
| Enzyme-free cell dissociation solution | Invitrogen | 13151-014 | |
| Rabbit anti-TET Repressor polyclonal antibody | Millipore | AB3541 | |
| FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 715-095-150 | |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV1000 | |
| FACSCalibur flow cytometer | BD Biosciences | ||
| β-Galactosidase Enzyme Assay System with Reporter Lysis Buffer | Promega | E2000 | |
| Model 100-40 UV-VIS spectrophotometer | Hitachi | C740843 |
References
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