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Biology

Un workflow d'imagerie à haute teneur pour étudier Grb2 complexes de signalisation par clonage d'expression

Published: October 30, 2012 doi: 10.3791/4382
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1MRC LMCB, University College London, 2Center for Computational and Integrative Biology, Massachusetts General Hospital

Summary

Procédé de criblage à haut contenu de la nouvelle identification de signalisation des récepteurs transmembranaires compétentes est décrite. Cette méthode se prête à l'automatisation à grande échelle et permet des prédictions sur

Abstract

Transduction du signal par les récepteurs du facteur de croissance est essentielle pour les cellules pour maintenir prolifération et la différenciation et exige un contrôle strict. Transduction du signal est initiée par la liaison d'un ligand externe à un récepteur transmembranaire et l'activation des cascades de signalisation en aval. Un régulateur clé de la signalisation mitogénique est Grb2, une protéine modulaire composé d'un interne SH2 (Src homology 2) de domaine flanqué de deux domaines SH3 qui manque de l'activité enzymatique. Grb2 est constitutivement associé à la GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) par l'intermédiaire de son extrémité N-terminale du domaine SH3. Le domaine SH2 de Grb2 se lie aux récepteurs de facteurs de croissance à résidus tyrosine phosphorylés donc d'accouplement à l'activation du récepteur de la cascade SOS-Ras-MAP-kinase de signalisation. En outre, d'autres rôles pour Grb2 comme un régulateur positif ou négatif de la signalisation et de l'endocytose des récepteurs ont été décrits. La composition modulaire de Grb2 suggère qu'il peut s'arrimer à une variété de récepteurs et TRANSDUCe signale le long d'une multitude de différentes voies 1-3.

Décrite ici est un test simple qui surveille la microscopie recrutement de Grb2 à la membrane plasmique. Il est adapté à partir d'un dosage qui mesure les changements de localisation sub-cellulaire de la protéine fluorescente verte (GFP)-tag Grb2 en réponse à un stimulus 4-6. Récepteurs membranaires plasmatiques qui lient Grb2 comme récepteur activé par le facteur de croissance épidermique (EGFR) recruter GFP-Grb2 à la membrane plasmique lors de l'expression d'ADNc et ensuite déménager à endosomes dans la cellule. Afin d'identifier de complexes protéiques in vivo de la protéine Grb2, cette technique peut être utilisée pour effectuer un génome à haut contenu de l'écran en fonction de l'évolution de Grb2 localisation sub-cellulaire. La préparation de clones d'expression d'ADNc, la transfection et l'acquisition d'images sont décrites en détail ci-dessous. Comparé à d'autres méthodes génomiques utilisés pour identifier les partenaires d'interaction de protéines, comme la levure-deux-hybrid, cette technique permet la visualisation des complexes de protéines dans les cellules de mammifères sur le site sub-cellulaire de l'interaction par un simple microscopique de dosage. D'où les deux caractéristiques qualitatives, comme les schémas de localisation peut être évaluée, ainsi que la force quantitative de l'interaction.

Protocol

1. Cueillette de clones d'expression d'ADNc

  1. La banque d'ADNc est fourni en simples clones bactériens dans les stocks de glycérol dans un format 96-puits. Utilisation de la commande Rearray dans le menu du sélecteur de la CP7200 Norgen, choisissez clones bactériens de la plaque de source et inoculer dans 1,5 ml de LB / amp dans un 96-puits profonds (1 ml bien) plaque.
  2. Sceller les plaques Deepwell avec un joint perméable au gaz et incuber une nuit à 37 ° C dans un shaker.

2. Préparation de la banque d'expression d'ADNc

  1. Faites tourner les plaques Deepwell contenant les bactéries à 2.000 tours par minute pendant 20 minutes en utilisant des adaptateurs plaque dans une centrifugeuse de table.
  2. Aspirer le support du puits, en laissant intact le culot bactérien.
  3. Configurer le pont de la station de travail d'automatisation de laboratoire comme le montre la figure 2. Solutions pour la préparation de plasmide sont réparties dans des auges 1-5 et la plaque Deepwell est placé sur la plate-forme. Un creux à cavités multiples avec une solution d'élutionest placé à côté de la plaque Deepwell. Conseils sont chargés dans les portoirs de pointes.
  4. Assembler le collecteur à vide. La plaque de fixation plasmide est placé à l'intérieur du collecteur et la plaque de filtre plasmide est placé au-dessus du collecteur.
  5. Resuspendre boulettes avec 250 ul de solution 1 (tampon de remise en suspension) par pipetage de haut en bas.
  6. Lyser les bactéries par addition de 250 ul Solution 2 (tampon de lyse). La plaque est rendue étanche et inversée pour permettre un mélange complet.
  7. Start 2 min minuterie.
  8. Ajouter 350 ul Solution 3 (tampon de neutralisation). Sceller la plaque et retourner 3 fois.
  9. Transfert des lysats bactériens aux plaques plasmide filtre.
  10. Appliquer une dépression pendant 5 min.
  11. Retirer la plaque du filtre et placez la plaque de fixation sur le dessus de la rampe. Appliquer une dépression pendant 1 min.
  12. Ajouter 500 ul de lavage supplémentaire (AW) tampon.
  13. Appliquer une dépression pendant 2 min.
  14. Ajouter 900 ul de la solution tampon de lavage 4. Appliquer une dépression pendant 2 min.
  15. Répétez step 2.14. Appliquer une dépression de 15 minutes supplémentaires.
  16. Placez la plaque de prélèvement d'ADN à l'intérieur du collecteur. Ajouter 100 ul de tampon d'élution à la plaque de fixation et incuber pendant 2 min.
  17. Sous vide pendant 10 min.
  18. Retirer la plaque de la collecte et de la concentration d'ADN mesure en utilisant le 8000 Nanodrop. Typiquement un rendement de ~ 100 ng / ul on peut s'attendre avec cette méthode.

3. L'ensemencement de cellules

  1. Les cellules HEK293 sont trypsinisées et comptées.
  2. 2 x 10 4 cellules sont distribués dans chaque puits d'une Viewplate PerkinElmer en utilisant le ThermoFisher de 96 puits multipoint.
  3. Les cellules sont incubées une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2.

4. Transfection

  1. Préparer un mélange de 100 ng GFP-Grb2 ADN plasmidique avec 100 ng d'ADNc dans 25 pl de milieu sans sérum par puits dans un fond rond de 96 puits.
  2. Ajouter 25 ul de milieu sans sérum contenant 0,5 Transfectin ul par puits.
  3. Mélanger et démarrer la minuterie for 30 min.
  4. Transférer 50 ul d'ADNc / Transfectin mélange aux cellules en utilisant une méthode douce de distribution. Alternativement, le mélange de transfection peuvent être dispensés d'abord en plaques et les cellules ajoutées sur le dessus (transfection inverse).
  5. Incuber les cellules pendant la nuit à 37 ° C et 5% de CO 2.

5. Image Acquisition

  1. Lancez le logiciel Opera. Une capture d'écran du montage expérimental est illustré à la figure 3. Sélectionnez l'onglet "Configuration" et sélectionnez objectif 20x et le type de plaque correct. Veiller à "col" est réglé sur la valeur correcte sur l'objectif de permettre de se concentrer avec différents types de plaques.
  2. Sélectionnez l'option "Microscope" onglet. Définir l'exposition 1 comme FITC (488 laser) et de l'exposition 2 comme UV (365 laser). Activez le filtre anti-UV sur les deux expositions et d'affecter l'exposition 1 à la caméra 1 et 2 à l'exposition caméra 2. Réglez le temps d'exposition à 800 msec pour une exposition de 1 à 40 ms pour l'exposition 2.
  3. Sélectionnez l'option "Microscope" onglet. Définir exposition 1 comme FITC (488 laser) et de l'exposition 2 comme UV (365 laser). Activez le filtre anti-UV sur les deux expositions et d'affecter l'exposition 1 à la caméra 1 et 2 à l'exposition caméra 2. Réglez le temps d'exposition à 800 msec pour une exposition de 1 à 40 ms pour l'exposition 2.
  4. Sélectionnez exposition 1. Réglez la hauteur concentrer à 0 um. Sélectionnez "Mise au point". Une fois la mise, exposer l'appareil photo 1. Réglez la hauteur du foyer afin d'optimiser le plan d'exposition et cliquez sur "Take hauteur". Modifiez les durées d'exposition et la puissance laser pour donner une intensité de pixel maximum de ~ 3.000. Enregistrer les paramètres d'exposition. Répétez l'opération pour l'exposition 2.
  5. Sélectionnez "Définition Experiment" onglet. Créez mise en page et sublayout. Glissez et déposez la disposition pertinente, l'exposition, l'image de référence skewcrop fichier et sublayout. Enregistrer expérience.
  6. Sélectionnez "Expérience automatique" onglet et acquérir des images.

6. Image Analysis (Basé sur ImageJ 1.46h version.)

  1. Convertir le PerkinElmer propriétaire. Fichiers flex au format Tagged Image. Tif en utilisant leFlex2Volocity Acapella script.
    1. Importer des images dans ImageJ comme une séquence d'images, ce qui entraîne une erreur.
    2. Convertir la pile dans un HyperStack 2 canaux en sélectionnant l'image / HyperStack / Pile à option de menu HyperStack. Le nombre de tranches doit être réglé à la moitié de la pile importés.
    3. Dupliquer le canal de la GFP en utilisant l'éditeur / commande Dupliquer: cochez la case en double HyperStack et choix des canaux: 1-1. Ci-après utilisent la pile en double.
  3. Sélectionnez Process / Améliorer contraste avec 0,01% de pixels saturés, utilisant un histogramme de la pile et le convertir en 8 bits avec Image/Type/8-bit.
  4. Définir un rayon de 15 pixels segmentation locale adaptative en utilisant l'algorithme Bernsen avec seuil de contraste (paramètre 1) q = 30. Cochez les objets blancs sur fond noir case à cocher dans le menu Image / Adjust / Seuil automatique locale.
  5. Contrôle de la qualité de la segmentation: segmentation générer superposition contour de l'objet sur les images originales.
  6. Feature d'extraction par analyse de particules: zone de mesure, la moyenne et l'intensité totale de chaque organite. Enregistrer les fichiers de résultats.
  7. Ouvrez le fichier résultat fonctionnalités de R et de générer un histogramme.

7. Les résultats représentatifs

Dans des conditions normales de Grb2 est localisée tout au long de la totalité de la cellule. Lors de la stimulation d'un récepteur du facteur de croissance, il translocation vers la membrane plasmique et est ensuite internalisée dans les endosomes, comme indiqué dans la figure 4. L'expression d'un récepteur de surface cellulaire capable de Grb2 liaison est suffisante pour induire cette translocation. Dans une expérience typique de dépistage, aucun changement dans la GFP-Grb2 localisation est observée. Cependant, quand une protéine est exprimée que Grb2 recrues vers un site sub-cellulaire, il ya un changement dans la localisation qui peuvent être facilement visualisées par microscopie à fluorescence. Par exemple, l'expression de l'EGFR dans les résultats relocalisation de la GFP-Grb2 à endosome structures semblables (Figure4). Ainsi, en appliquant une bibliothèque échelle du génome, on peut s'attendre à ce que de nouveaux Grb2 protéines de liaison à la surface cellulaire peuvent être identifiés.

Cette méthode n'est pas limitée à la détection de protéines de surface cellulaire. Par exemple, Dynamin2 induit un changement de localisation sub-cellulaire de la GFP-Grb2 affichage endosome comme le recrutement (figure 5). Dynamin2 se lie au domaine SH3 C-terminal de la protéine Grb2 et est impliqué dans l'endocytose de ce complexe 9,10. Ainsi, cette approche permet l'identification des complexes protéiques générales contraignantes et ne se limite pas à l'identification de partenaires d'interaction pour le domaine SH2.

Plusieurs types de translocation peut s'attendre comme la localisation de la membrane plasmique, vers les endosomes, d'autres structures vésiculaires cytoplasmiques ou vers le noyau. Par conséquent, il est recommandé que toutes les images sont également inspectés à l'oeil. Toutefois, lorsque le dépistage de grands ensembles d'ADNc un système automatiséalgorithme d'analyse d'image est plus pratique. Dans ce cas, une combinaison d'algorithmes est souhaitable, comme la détection tache d'identifier les endosomes, le cytoplasme / noyau de détection pour identifier nucléaires navette et générale algorithmes morphologiques pour identifier les changements de forme cellulaire. L'utilisation de ces différentes méthodes de détection phénotypique a été examinée plus en détail dans d'autres 11.

Figure 1
Figure 1. Diagramme d'ensemble de l'expérience. L'expérience détails d'un flux de travail de dépistage complet à haute teneur en commençant par l'amplification et la préparation de la banque d'ADNc, la transfection de vecteurs d'ADNc ainsi que des constructions rapporteurs, l'acquisition d'images et l'analyse d'images à l'aide du logiciel gratuit open ImageJ.

Figure 2
Faigure 2. Configuration de la plate-forme Tecan. (1) Sur le côté gauche, cinq bacs 100 ml doivent être remplis avec des tampons 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) et A4 (100 ml). A4 fosse devra être rempli une fois au cours de la procédure. (2) Le collecteur à vide se trouve sur la position 14 dans cet exemple. (3) La plaque Deepwell avec culots bactériens se trouve sur la position 30, à côté de la cuve tampon d'élution avec 25 ml de tampon d'élution. (4) embouts jetables pour la tête 8-canaux doivent être chargés dans les portoirs de pointes sur le côté gauche et des conseils pour la tête multicanal doivent être remplis sur la position 40. Le gestionnaire de Tecan liquide FreedomEvo qui est utilisé dans cette expérience est équipé de 500 seringues ul. Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 3
Figure3. L'automatisation de l'acquisition d'images sur le LX Opéra. A) Sélectionnez l'onglet Configuration (1). Activer les lignes laser nécessaires pour l'expérience (2). Sélectionnez les caméras d'acquisition d'images (3). Sélectionnez le type de plaque et objectif de l'expérience (4). B) Sélectionnez l'onglet microscope (1). Définir la source de lumière et du temps d'exposition pour l'exposition 1 (2,3). Focus sur un bien et prendre de la hauteur (4). C) Sélectionnez l'onglet Définition expérience (1). Glissez et déposez l'exposition, skewcrop, de référence, mise en page et fichiers sublayout (2). Glissez-déposez le fichier d'expérience (3). D) Sélectionnez expérience Automatique (1). Faites glisser et déposez le fichier expérience (2). Allouer des codes à barres approprié (3). Démarrer l'acquisition d'images en cliquant sur ​​le bouton de démarrage (4). Cliquez ici pour agrandir la figure .

Figure 4

Figure 5
Figure 5. Exemple d'ADNc induit la translocation de la GFP-Grb2. Le Dynamin2 GTPase, qui est impliqué dans l'endocytose Grb2, déménage GFP-Grb2 à endosome structures semblables (dans le cercle). Dans cette expérience, la GFP-Grb2 a été co-transfectées avec DNM2 dans les cellules HEK293T. Les cellules ont été colorées avec Hoechst 33342 après 24 h et images ont été acquises sur le Opera LX. Un champ de vision de la verte (GFP) et le canal UV (bleu, Hoechst 33342) est affiché.

Discussion

Clonage d'expression est un puissant outil qui a été utilisé dans le passé pour identifier de nouveaux composants cellulaires tels que les récepteurs du virus et les antigènes des globules 12. Nous décrivons ici une méthode pour faciliter l'identification de nouveaux récepteurs putatifs de transduction du signal qui se lient à la protéine Grb2.

Il ya quelques étapes critiques dans le protocole.

  1. Pour la préparation de plasmide automatisé, il est absolument essentiel d'avoir remise en suspension complète du culot bactérien. Parfois, il est nécessaire d'inclure une étape rigoureuse secouant ou en mélange supplémentaire avec des pipettes.
  2. Lors de l'addition de la solution 2 et 3, le mélange complet est essentiel et nous avons trouvé que manuellement inversant la plaque scellée est plus efficace que l'utilisation d'un agitateur automatisé. Pipetage devrait être évité à cette étape car elle conduirait à un cisaillement de l'ADN.
  3. Dans toutes les étapes de vide, il faut veiller à ce que le liquide soit complètement vidéà partir de la plaque. Sinon rendements faibles sont à prévoir.
  4. Après élution, il est assez fréquent que éluat gouttes se forment au bas de la plaque de plasmide contraignant. Ces baisses doivent être collectées dans la plaque d'élution, il est donc recommandé que la plaque de plasmide liaison est soulevée avec précaution et les gouttes résiduelles au fond sont soigneusement transférés à la plaque éluat.
  5. Au cours de la transfection, le temps de formation du complexe est critique. Nous adhèrent généralement à 20-30 min. Des temps plus longs jusqu'à 1 h sont très bien sans baisse de rendement, tandis que des temps plus courts ne sont pas recommandés.
  6. Pour la microscopie, le choix du grossissement est important. Sur le système Opera LX utilisée ici, la résolution à 20x est suffisant pour obtenir des images de haute qualité. Si des images haute résolution sont nécessaires, l'objectif peut être changé, mais dans le but d'obtenir des chiffres statistiquement significatifs de cellules, un plus grand nombre de domaines et les temps d'acquisition plus élevés sont nécessaires. En général, nous visonsd'obtenir au moins 100 cellules par puits imagés.

Le test de translocation Grb2 a été utilisé par d'autres groupes pour identifier les petites molécules inhibitrices de l'EGFR kinase d'activation 6. Dans ce cas, l'EGFR est spécifiquement activé par un ligand provoquant le recrutement de Grb2 à la membrane plasmique. La perturbation de cette interaction peut alors être étudiée en utilisant des composés à petites molécules. De même, il peut être envisagé que les écrans siRNA peuvent être utilisées pour identifier les gènes endogènes impliquées dans la signalisation EGFR-Grb2 ou d'autres Grb2-récepteurs de liaison du facteur de croissance tels que c-KIT ou le récepteur de l'érythropoïétine. Ainsi, il existe de multiples applications potentielles de cette technique. Une approche analogue peut être appliquée aux systèmes rapporteur GFP-marqués pour d'autres molécules adaptatrices comme Shc, Gab ou IRS.

Un avantage majeur de l'utilisation de ce dosage à base de cellules dans les cellules de mammifères est qu'elle permet d'identifier physiologiquement relinteractions Evant. Le dosage est une lecture pour la formation des protéines complexes, mais plus important encore, les interactions pertinentes sont suivies à la bonne sub-cellulaire site. À cet égard, cette technique permet de surmonter les artefacts provenant d'autres méthodes d'interaction protéine-protéine tels que la levure double hybride ou in vitro. Il est à noter cependant, que les interactions indirectes peuvent également entraîner le recrutement de Grb2. De même, la transcription régulation à la hausse de partenaires de liaison peut être induite par l'expression d'ADNc. Pour faire la distinction entre ces deux possibilités, il est nécessaire d'effectuer les dosages appropriés secondaires de distinguer entre les effets directs et indirects de liaison.

En conclusion, le dosage de la GFP adaptateur molécule translocation promet un fort potentiel pour l'ensemble du génome de dépistage et de découverte de médicaments.

Disclosures

Aucun conflit d'intérêt déclaré.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Medical Research Council et la Fondation Marie-Curie internationales de réintégration PAT (à JKV).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
cDNA library Origene
LB+amp
Gas-permeable seals ThermoScientific AB-0718
Nucleospin 96 Plasmid Kit Macherey-Nagel 740625.4
Transfectin BioRad 170-3351
H–chst33342 Molecular Probes H3570
Viewplate 96 F TC PerkinElmer 6005182
RapidPick Hudson Norgren CP7200
Freedom Evo Tecan With vacuum manifold
Multidrop 384 Thermo
Opera LX PerkinElmer

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References

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Biologie Moléculaire Numéro 68 Grb2 la préparation d'ADNc à haut débit haute teneur en dépistage transduction du signal le clonage d'expression de 96 puits
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Freeman, J., Kriston-Vizi, J., Seed, … More

Freeman, J., Kriston-Vizi, J., Seed, B., Ketteler, R. A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning. J. Vis. Exp. (68), e4382, doi:10.3791/4382 (2012).

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