Un alto contenido de imágenes de flujo de trabajo para estudiar Grb2 complejos de señalización por clonación de expresión

Summary

Un método de cribado de alto contenido para la identificación de nuevos receptores de señalización transmembrana competentes se describe. Este método es susceptible de automatización a gran escala y permite predicciones acerca

Abstract

La transducción de señales por los receptores del factor de crecimiento es esencial para las células para mantener la proliferación y la diferenciación y requiere un estricto control. La transducción de señales es iniciada por la unión de un ligando externo de un receptor transmembrana y la activación de cascadas de señalización corriente abajo. Un regulador clave de la señalización mitogénica es Grb2, una proteína modular compuesto de un interior SH2 (homología src 2) dominio flanqueado por dos dominios SH3 que carece de actividad enzimática. Grb2 está constitutivamente asociada con la GTPasa hijo de Sevenless (SOS) a través de su extremo N-terminal de dominio SH3. El dominio SH2 de Grb2 se une a receptores de factores de crecimiento en los residuos de tirosina fosforilados acoplando así la activación del receptor de la cascada SOS-Ras-MAP quinasa señalización. Además, otros papeles para Grb2 como un regulador positivo o negativo de la señalización y la endocitosis del receptor se han descrito. La composición modular de Grb2 sugiere que se puede acoplar a una diversidad de receptores y transductorese indica a lo largo de una multitud de diferentes vías de ^1-3.

A continuación se describe un ensayo de microscopía simple que supervisa el reclutamiento de Grb2 a la membrana plasmática. Está adaptado a partir de un ensayo que mide los cambios en la localización subcelular de la proteína fluorescente verde (GFP)-etiquetados Grb2 en respuesta a un estímulo ^4-6. Receptores de membrana plasmática que se unen Grb2 como receptor activado por el factor de crecimiento epidérmico (EGFR) recluta GFP-Grb2 a la membrana plasmática tras la expresión de ADNc y, posteriormente, trasladarse a endosomal compartimentos de la célula. Con el fin de identificar en los complejos de proteínas in vivo de Grb2, esta técnica se puede utilizar para realizar una escala del genoma de alto contenido de la pantalla basándose en los cambios en Grb2 sub-localización celular. La preparación de clones de cDNA de expresión, transfección y la adquisición de imagen se describen en detalle a continuación. En comparación con otros métodos genómicos utilizados para identificar socios de interacción de proteínas, tales como la levadura-dos-hybrid, esta técnica permite la visualización de los complejos de proteínas en células de mamífero en el sitio de la sub-celular de la interacción por un simple ensayo basado en microscopía. Por lo tanto ambas características cualitativas, como los patrones de localización puede ser evaluado, así como la fuerza cuantitativa de la interacción.

Protocol

1. Recogiendo clones de cDNA de expresión

1. La biblioteca de cDNA se ofrece como clones bacterianos individuales en las reservas de glicerol en un formato de 96 pocillos. El uso del comando Rearray en el menú selector de la CP7200 Norgen, recoger clones bacterianos de la placa de fuente e inocular 1,5 ml en LB / amp en un 96-pozos profundos (1 ml también) plato.
2. Sellar las placas de pocillos profundos con un sello permeable a los gases e incubar durante la noche a 37 ° C en un agitador.

2. Preparación de la biblioteca de expresión de ADNc

1. Girar las placas de pocillos profundos que contenían las bacterias a 2.000 rpm durante 20 min utilizando adaptadores de placas en una centrífuga de mesa.
2. Aspirar los medios de los pocillos, dejando el sedimento bacteriano intacto.
3. Configurar la cubierta de la estación de trabajo de automatización de laboratorio, como se muestra en la Figura 2. Soluciones para la preparación de plásmidos se distribuyen en canales 1-5 y la placa de pozos profundos se coloca en la cubierta. A través de múltiples pocillos con solución de eluciónse coloca adyacente a la placa de pozos profundos. Consejos se cargan en los bastidores de punta.
4. Montar el colector de vacío. La placa de unión plásmido se coloca en el interior del colector y la placa de filtro plásmido se coloca en la parte superior del colector.
5. Resuspender pellet con 250 l Solución 1 (tampón de resuspensión) pipeteando arriba y abajo.
6. Lisar las bacterias mediante la adición de 250 l Solución 2 (tampón de lisis). La placa se sella y se invierte para permitir una mezcla completa.
7. Inicio 2 min temporizador.
8. Añadir 350 l Solución 3 (tampón de neutralización). Tapar la placa e invertir tres veces.
9. Transferir los lisados ​​bacterianos a las placas de filtro de plásmidos.
10. Aplicar vacío durante 5 min.
11. Retire la placa del filtro y colocar la placa de fijación en la parte superior del colector. Aplicar vacío durante 1 min.
12. Añadir 500 l de lavado adicional (AW) buffer.
13. Aplicar vacío durante 2 min.
14. Añadir 900 l de solución tampón de lavado 4. Aplicar vacío durante 2 min.
15. Repita step 2.14. Aplicar vacío durante 15 min adicionales.
16. Coloque la placa de colección de ADN en el interior del colector. Añadir 100 l de tampón de elución para la unión en placa y se incuba durante 2 min.
17. Vacío durante 10 min.
18. Retire la placa de recogida y concentración de ADN medida mediante el Nanodrop 8000. Típicamente un rendimiento de ~ 100 ng / l se puede esperar con este método.

3. Siembra Celular

1. Las células HEK293 se tripsinizaron y se contaron.
2. 2 x 10 ⁴ células se distribuyen en cada pocillo de una Viewplate PerkinElmer usando el ThermoFisher 96 pocillos multipunto.
3. Las células se incubaron durante la noche a 37 ° C y 5% CO _2.

4. Transfección

1. Preparar una mezcla de 100 ng GFP-Grb2 plásmido de ADN con 100 ng de ADNc en 25 l medio libre de suero por pocillo en un fondo redondo de 96 pocillos.
2. Añadir 25 mu l medios libres de suero que contienen 0,5 Transfectin l por pocillo.
3. Mezclar e iniciar el temporizador for 30 min.
4. Transferir 50 l de cDNA / Transfectin mezcla a las células utilizando un método de dispensación suave. Alternativamente, la mezcla de transfección se puede prescindir primero en placas de células y luego añadido en la parte superior (transfección inversa).
5. Se incuban las células durante la noche a 37 ° C y 5% CO _2.

5. Adquisición de imágenes

1. Inicie el software Opera. Una instantánea de pantalla de la configuración del experimento se muestra en la Figura 3. Seleccione la ficha "Configuración" y seleccione 20x objetivo y el tipo de placa correcta. Asegúrese de "collar" está ajustado al valor correcto en el objetivo de permitir el enfoque con diferentes tipos de planchas.
2. Seleccione la opción "Microscopio" ficha. Definir una exposición como FITC (488 láser) y la exposición 2 como UV (365 láser). Activar el filtro UV en ambas exposiciones y asignar una exposición a la cámara 1 y 2 a la exposición la cámara 2. Establecer los tiempos de exposición a 800 ms de exposición 1 y 40 ms para la exposición 2.
3. Seleccione la opción "Microscopio" ficha. Definir eXposure 1 como FITC (488 láser) y la exposición 2 como UV (365 láser). Activar el filtro UV en ambas exposiciones y asignar una exposición a la cámara 1 y 2 a la exposición la cámara 2. Establecer los tiempos de exposición a 800 ms de exposición 1 y 40 ms para la exposición 2.
4. Seleccione exposición 1. Establecer el foco altura de 0 m. Seleccione "Focus". Una vez centrado, exponga la cámara 1. Ajuste la altura de enfoque para optimizar el plano de exposición y haga clic en "Take altura". Cambiar los tiempos de exposición y la potencia del láser para dar una intensidad de píxeles máximo de ~ 3.000. Guardar los parámetros de exposición. Repita el procedimiento para la exposición 2.
5. Seleccione "Definición Experiment" ficha. Crear un diseño y sublayout. Arrastre y suelte la disposición pertinente, la exposición, la imagen de referencia, archivo y skewcrop sublayout. Guardar experimento.
6. Seleccione "Experimento automática" ficha y adquirir imágenes.

6. Análisis de Imagen (Basado en ImageJ versión 1.46h.)

1. Convertir el PerkinElmer propietario. Archivos flex para Tagged Image Format. Tif utilizando elFlex2Volocity Acapella guión.
2. 1. Importar imágenes en ImageJ como una secuencia de imágenes, lo que resulta en una pila.
   2. Convertir la pila en un HyperStack 2 canales mediante la selección de la imagen / HyperStack / pila a punto del menú HyperStack. El número de cortes se debe establecer en medio de la pila importado.
   3. Duplicar el canal GFP usando la imagen / comando Duplicar: marque la casilla Duplicar HyperStack y especificar los canales: 1-1. Allá usa la pila duplicado.
3. Seleccione proceso / Mejorar contraste con píxeles 0,01% saturadas, utilizando histograma apilado y convertir a 8 bits con Image/Type/8-bit.
4. Definición de un radio de 15 píxeles local de segmentación adaptativa utilizando el algoritmo Bernsen con umbral de contraste (parámetro 1) q = 30. Marque las casilla de verificación objetos blancos en fondo negro en el menú Umbral Imagen / Ajustar / Auto Local.
5. Segmentación de control de calidad: generar superposición segmentada contorno de objetos en las imágenes originales.
6. Manipular las característicasre extracción mediante el análisis de partículas: área de medición, la media y la intensidad total de cada orgánulo. Guarde los archivos de resultados.
7. Abra el archivo de resultados de funciones en R y generar un histograma.

7. Los resultados representativos

En condiciones normales Grb2 se localiza a lo largo de toda la celda. Tras la estimulación de un receptor del factor de crecimiento que se transloca a la membrana plasmática y posteriormente se internalizan en los endosomas, como se muestra en la Figura 4. La expresión de un receptor de superficie celular capaz de Grb2 de unión es suficiente para inducir esta translocación. En un experimento de selección típico, no hay cambio en GFP-Grb2 localización se observa. Sin embargo, cuando una proteína se expresa que Grb2 recluta a un sitio de la sub-celular, hay un cambio en la localización que puede ser fácilmente visualizado por microscopía de fluorescencia. Por ejemplo, la expresión de los resultados de EGFR en la relocalización de GFP-Grb2 a endosoma-como las estructuras (figura4). Por lo tanto, cuando se aplica una biblioteca de todo el genoma, se puede esperar que los nuevos Grb2 proteínas de unión a la superficie celular puede ser identificado.

Este método no se limita a la detección de proteínas de superficie celular. Por ejemplo, Dynamin2 induce un cambio en la localización subcelular de GFP-Grb2 mostrar endosoma-como el reclutamiento (Figura 5). Dynamin2 se une al dominio C-terminal SH3 de Grb2 y está implicado en la endocitosis de este complejo de ^9,10. Por lo tanto, este enfoque permite la identificación de complejos de proteínas de unión generales y no se limita a la identificación de compañeros de interacción para el dominio SH2.

Varios tipos diferentes de translocación se puede esperar como la localización en la membrana plasmática, a endosomas, otras estructuras vesiculares citoplasmáticas o al núcleo. Por lo tanto, se recomienda que todas las imágenes también son inspeccionadas por ojo. Sin embargo, cuando la detección de grandes conjuntos de ADNc de un sistema automatizadoalgoritmo de análisis de imágenes es más práctico. En este caso, una combinación de algoritmos es deseable, tales como la detección in situ para identificar endosomas, citoplasma / núcleo de detección para identificar los algoritmos morfológicos nucleares shuttling y general para identificar cambios celulares de forma. El uso de estos métodos de detección fenotípicos diferentes se ha discutido en más detalle en otra parte ^11.

Figura 1. Esquema general del experimento. El experimento detalla un completo alto contenido de flujo de trabajo de cribado a partir de la amplificación y la preparación de la biblioteca de ADNc, la transfección de vectores de ADNc más construcciones reporteras, adquisición de imágenes y análisis de imágenes utilizando el software libre abierto ImageJ.

Figura 2. Configuración de la plataforma de Tecan. (1) En el lado izquierdo, cinco canales 100 ml necesitan ser llenados con tampones 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) y A4 (100 ml). A4 Trough será necesario volver a llenar una vez durante el procedimiento. (2) El colector de vacío se encuentra en la posición 14 en este ejemplo. (3) La placa de pozos profundos con sedimentos bacterianos se encuentra en la posición 30, al lado de la cubeta tampón de elución con 25 ml de tampón de elución. (4) Puntas desechables para la cabeza 8-canales necesitan ser cargados en los bastidores de punta en el lado izquierdo y consejos para la cabeza multicanal deben llenarse en la posición 40. El manejador de Tecan FreedomEvo líquido que se utiliza en este experimento está equipado con 500 jeringas mu l. Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura3. Automatización de la adquisición de la imagen en el LX Opera. A) Seleccione la ficha Configuración (1). Activar las líneas de láser requeridos para el experimento (2). Seleccione las cámaras para la adquisición de imágenes (3). Seleccionar el tipo de placa y la lente objetivo para el experimento (4). B) Seleccione la pestaña microscopio (1). Defina la fuente de luz y el tiempo de exposición de exposición 1 (2,3). Centrarse en un pozo y tomar altura (4). C) Seleccione la pestaña Definición Experiment (1). Arrastre y suelte la exposición, skewcrop, la referencia, el diseño y los archivos sublayout (2). Arrastrar y soltar el archivo de experimento (3). D) Selección automática Experiment (1). Arrastre y suelte los archivos experimento (2). Asignar código de barras correspondiente (3). Iniciar la adquisición de imágenes haciendo clic en el botón de inicio (4). Haga clic aquí para ampliar la cifra .

Figura 5. Ejemplo de cDNA inducida por la translocación de GFP-Grb2. El Dynamin2 GTPasa, que está implicada en la endocitosis mediada Grb2, reubica GFP-Grb2 a endosoma estructuras similares (en el círculo). En este experimento, GFP-Grb2 fue co-transfectadas con DNM2 en células HEK293T. Las células se tiñeron con Hoechst 33342 a las 24 horas y las imágenes fueron adquiridas en el Opera LX. Un campo de visión de la luz verde (GFP) de canal y la UV (azul; Hoechst 33342) se muestra.

Discussion

La clonación de expresión es una poderosa herramienta que se ha utilizado en el pasado para identificar nuevos componentes celulares tales como receptores de virus y antígenos de células sanguíneas ^12. Aquí se describe un método para facilitar la identificación de nuevos supuestos receptores de transducción de señales que se unen a Grb2.

Hay algunos pasos críticos en el protocolo.

1. Para la preparación del plásmido automatizado es absolutamente indispensable contar con la completa resuspensión del sedimento bacteriano. A veces, es necesario incluir una etapa de agitación rigurosa o una nueva mezcla con pipetas.
2. Tras la adición de solución 2 y 3, mezcla completa es esencial y se ha encontrado que manualmente invirtiendo la placa sellado es más eficaz que el uso de un agitador automático. Pipeteado se debe evitar a este paso ya que conduciría a la cizalladura de la DNA.
3. En todos los pasos de vacío, hay que asegurarse de que el líquido es drenado completamentede la placa. De lo contrario rendimientos bajos son de esperar.
4. Tras la elución, es bastante común que eluato se forman gotas en la parte inferior de la placa de unión del plásmido. Estas gotas deben recogerse en la placa de elución, lo que se recomienda que la placa de fijación plásmido se levantó cuidadosamente y las gotas residuales en la parte inferior se transfiere cuidadosamente a la placa de eluato.
5. Durante la transfección, el momento de la formación del complejo es crítica. Por lo general, se adhieren a 20-30 min. Los tiempos más largos de hasta 1 h están bien sin reducción en el rendimiento, mientras que tiempos más cortos no son recomendados.
6. Para la microscopía, la elección de la ampliación es importante. En el sistema Opera LX utiliza aquí, la resolución de 20x es suficiente para obtener imágenes de alta calidad. Si imágenes de mayor resolución son necesarios, el objetivo puede ser cambiado, pero con el fin de obtener números estadísticamente significativos de las células, un mayor número de campos y mayores tiempos de adquisición se requieren. En general, nuestro objetivo esobtener al menos 100 células por pocillo fotografiadas.

La translocación de ensayo Grb2 se ha usado por otros grupos para identificar inhibidores de molécula pequeña de EGFR activación de la quinasa ^6. En ese caso, el EGFR se activa específicamente con el ligando provoca el reclutamiento de Grb2 a la membrana plasmática. La disrupción de esta interacción puede ser investigado el uso de compuestos de moléculas pequeñas. De manera similar, se puede prever que las pantallas de siRNA puede ser empleado para identificar genes endógenos implicados en la señalización EGFR-Grb2 o otros Grb2 de unión a receptores de factores de crecimiento tales como c-KIT o el receptor de eritropoyetina. Por lo tanto, hay múltiples aplicaciones potenciales de esta técnica. Un enfoque análogo podría aplicarse a sistemas reportero GFP-etiquetados para otras moléculas adaptadoras tales como Shc, Gab o IRS.

Una ventaja importante de usar este ensayo basado en células en células de mamífero es que permite la identificación de rel fisiológicamenteinteracciones nentes. El ensayo es una lectura para la formación de complejos de proteínas, pero lo más importante, las interacciones de interés son controlados en la correcta celular sub-sitio. En este sentido, esta técnica supera los artefactos de otros métodos de interacción proteína-proteína, tales como la levadura de dos híbridos o en ensayos in vitro. Hay que señalar sin embargo, que las interacciones indirectas también puede dar lugar a reclutamiento Grb2. De manera similar, la transcripcional regulación de parejas de unión puede ser inducida por la expresión de cDNA. Para distinguir entre estas posibilidades, es necesario realizar los ensayos secundarios apropiados para distinguir entre los efectos de unión directos e indirectos.

En conclusión, el ensayo molécula de GFP-adaptador translocación promete un alto potencial de todo el genoma de selección y aplicaciones de descubrimiento de fármacos.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
cDNA library	Origene
LB+amp
Gas-permeable seals	ThermoScientific	AB-0718
Nucleospin 96 Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740625.4
Transfectin	BioRad	170-3351
H–chst33342	Molecular Probes	H3570
Viewplate 96 F TC	PerkinElmer	6005182
RapidPick	Hudson		Norgren CP7200
Freedom Evo	Tecan		With vacuum manifold
Multidrop 384	Thermo
Opera LX	PerkinElmer