Et højt indhold Imaging Workflow til Uddannelse Grb2 signalering Komplekser ved ekspressionskloning

Summary

Et højt indhold screeningsmetode til identifikation af hidtil ukendte signalering kompetente transmembrane receptorer er beskrevet. Denne metode er muligt at foretage en storstilet automatisering og giver mulighed for forudsigelser om

Abstract

Signaltransduktion ved vækstfaktorreceptorer er afgørende for celler at opretholde proliferation og differentiering og kræver nøje kontrol. Signaltransduktion initieres ved binding af en ekstern ligand til en transmembran-receptor og aktivering af downstream signaleringskaskader. En vigtig regulator af mitogene signaler er Grb2, et modulært protein sammensat af et indre SH2 (Src Homology 2) domæne flankeret af to SH3 domæner, som mangler enzymatisk aktivitet. Grb2 er konstitutivt associeret med GTPase-Son-Of-Sevenless (SOS) via sin N-terminale SH3 domæne. SH2-domænet af Grb2 binder til vækstfaktorreceptorer på phosphorylerede tyrosinrester dermed kobling receptoraktivering til SOS-Ras-MAP-kinase signalering kaskade. Desuden har andre roller for Grb2 som en positiv eller negativ regulator af signalering og receptor endocytose blevet beskrevet. Den modulære sammensætning af Grb2 tyder på, at det kan forankre til en række forskellige receptorer og transduce signalerer langs et væld af forskellige veje ^1-3.

Beskrevet her er en simpel mikroskopi assay, der overvåger rekruttering af Grb2 til plasmamembranen. Det er tilpasset fra et assay, der måler ændringer i sub-cellulære lokalisering af grønt-fluorescerende protein (GFP)-mærkede Grb2 som reaktion på en stimulus ^4-6. Plasmamembran-receptorer, der binder Grb2 såsom aktiveret epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) rekrutterer GFP-Grb2 til plasmamembranen efter cDNA-ekspression og efterfølgende flytte til endosomale rum i cellen. For at identificere in vivo protein-komplekser af Grb2, kan denne teknik anvendes til at udføre en genomet hele screening med højt indhold baseret på ændringer i Grb2 sub-cellulære lokalisering. Fremstillingen af ​​cDNA-ekspressionsbiblioteker kloner, transfektion og billedoptagelse er beskrevet detaljeret nedenfor. Sammenlignet med andre genomiske metoder til at identificere protein-interaktion partnere, såsom gær-to-hybrid, denne teknik tillader visualisering af protein-komplekser i pattedyrceller ved subcellulære sted for interaktion med simpelt mikroskopi-baseret assay. Derfor både kvalitative egenskaber, såsom mønstre for lokalisering kan vurderes, og den kvantitative styrken af ​​vekselvirkningen.

Protocol

1. Picking cDNA Expression Clones

1. CDNA-biblioteket er tilvejebragt som enkelte bakterielle kloner i glycerol bestande i en 96-brønds format. Brug af Rearray kommando i picker menu Norgen CP7200, pluk bakterielle kloner fra kilden plade og inokulatet i 1,5 ml LB / amp i en 96-Deepwell (1 ml brønd) plade.
2. Forsegle Deepwell plader med en gaspermeabel forsegling og inkuberes natten over ved 37 ° C i en ryster.

2. Fremstilling af cDNA-ekspressionsbibliotek

1. Dreje Deepwell plader indeholdende bakterierne ved 2.000 rpm i 20 min ved hjælp af plade adaptere i en bordcentrifuge.
2. Aspireres mediet fra brøndene, hvorved den bakterielle pellet intakt.
3. Konfigurere dæk Lab automatisering arbejdsstation som vist i figur 2. Løsninger til plasmidfremstilling fordeles i render 1-5 og Deepwell plade anbringes på dækket. En multibrønd trug med elueringsopløsninger placeret ved siden af ​​Deepwell pladen. Tips fyldes ind i spidsen stativer.
4. Saml vakuummanifolden. Plasmidet bindepladen er placeret inde i manifolden og plasmidet filterplade er placeret på toppen af ​​manifolden.
5. Resuspender pellets med 250 ul Opløsning 1 (resuspensionsbuffer) ved at pipettere op og ned.
6. Lysere bakterierne ved tilsætning af 250 ul Opløsning 2 (lysepuffer). Pladen forsegles og inverteres for at tillade fuldstændig blanding.
7. Start 2 min timer.
8. Tilføj 350 gl Løsning 3 (Neutralisering buffer). Forsegl pladen og vend 3 gange.
9. Overfør bakterielysater til plasmidet filterplader.
10. Anvende vakuum i 5 min.
11. Fjern filterpladen og placere bindepladen på toppen af ​​manifolden. Anvende vakuum i 1 min.
12. Der tilsættes 500 pi af yderligere vask (AW) puffer.
13. Anvende vakuum i 2 min.
14. Tilføj 900 ul vaskebuffer Løsning 4. Anvende vakuum i 2 min.
15. Gentag stoe 2.14. Anvende vakuum i yderligere 15 min.
16. Anbring DNA opsamlingsplade inde i manifolden. Tilsættes 100 ul elueringspuffer til bindepladen og inkuberes i 2 min.
17. Vakuum i 10 min.
18. Fjern opsamlingspladen og måle DNA-koncentration ved hjælp af Nanodrop 8000. Typisk et udbytte på ~ 100 ng / gl kan forventes ved denne fremgangsmåde.

3. Cellepodning

1. HEK293-celler trypsiniseret og talt.
2. 2 x 10 ⁴ celler fordeltes i hver brønd i en PerkinElmer Viewplate hjælp af ThermoFisher 96-brønds multidrop.
3. Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C og _5% CO2.

4. Transfektion

1. Der fremstilles en blanding af 100 ng GFP-Grb2 plasmid-DNA med 100 ng cDNA i 25 ul serumfrit medium per brønd i en rundbundet 96-brønds plade.
2. Tilsættes 25 ul serumfrit medium indeholdende 0,5 pi Transfectin per brønd.
3. Bland og starte timeren for 30 min.
4. Overfør 50 ul cDNA / Transfectin blanding til celler under anvendelse af en blid dispensering fremgangsmåde. Alternativt kan transfektion mix dispenseres først i plader og derefter celler tilsættes ovenpå (reverse transfektion).
5. Cellerne inkuberes natten over ved 37 ° C og _5% CO2.

5. Image Acquisition

1. Start Opera software. En skærm øjebliksbillede i opsætningen af eksperimentet er vist i figur 3. Vælg "Konfiguration" fanen og vælge 20x objektiv og den korrekte plade type. Sikre "krave" er indstillet til den korrekte værdi på målet om at give mulighed for at fokusere med forskellige pladetyper.
2. Vælg "Microscope" fanen. Definer eksponering 1 som FITC (488 laser) og eksponering 2 som UV (365 laser). Aktivér UV-filter på begge eksponeringer og tildele eksponeringen 1 til kamera 1 og eksponering 2 til kamera 2. Indstil eksponeringstider til 800 msek for eksponering 1 og 40 msek for eksponering 2.
3. Vælg "Microscope" fanen. Definer eXposure 1 som FITC (488 laser) og eksponering 2 som UV (365 laser). Aktivér UV-filter på begge eksponeringer og tildele eksponeringen 1 til kamera 1 og eksponering 2 til kamera 2. Indstil eksponeringstider til 800 msek for eksponering 1 og 40 msek for eksponering 2.
4. Vælg eksponering 1. Sæt fokus højden til 0 um. Vælg "Focus". Når fokuseret, eksponere kameraet 1. Juster fokus højde for at optimere eksponering flyet og klik på "Take højde". Ændre eksponeringen gange og laser magt til at give en maksimal pixelintensitet på ~ 3.000. Gem eksponeringsparametre. Gentag for eksponering 2.
5. Vælg "Experiment Definition" fanen. Opret layout og sublayout. Træk og slip den relevante layout, eksponering, reference image, skewcrop fil og sublayout. Gem eksperiment.
6. Vælg "Automatisk Experiment" fanen og hente billeder.

6. Billedanalyse (Baseret på ImageJ 1.46h version.)

1. Konverter den proprietære PerkinElmer. Flex filer til Tagged Image Format. Tif-fil ved hjælp afFlex2Volocity Acapella script.
2. 1. Importere billeder i ImageJ som en billedsekvens, hvilket resulterer i en stabel.
   2. Konverter stakken ind i en 2-kanal hyperstack ved at vælge billedet / Hyperstack / Stak til Hyperstack menupunkt. Antallet af skiver skal indstilles til halvdelen af ​​det indførte stabel.
   3. Dubler GFP-kanal ved hjælp af billedet / Duplicate kommando: Sæt kryds i Duplicate hyperstack afkrydsningsfeltet og angive Kanaler: 1-1. Herefter anvende den duplikerede stakken.
3. Vælg Process / Enhance Contrast med 0,01% mættede pixels ved hjælp stack histogram og konvertere til 8 bit med Image/Type/8-bit.
4. Definer en 15 pixel radius lokal adaptiv segmentering ved hjælp af Bernsen algoritmen med kontrast tærskel (Parameter 1) q = 30. Afkryds de hvide objekter på sort baggrund afkrydsningsfeltet i billedet / Adjust / Auto Local Threshold menu.
5. Segmentation kvalitetskontrol: generere segmenteret objekt kontur overlay på de originale billeder.
6. Feature ekstraktion ved at analysere partikler: måleområde, middelværdi og totale intensitet af hver organel. Gem resultat filer.
7. Åbn funktionerne resultat filen i R og generere et histogram.

7. Repræsentative resultater

Under normale forhold Grb2 er lokaliseret i hele cellen. Ved stimulering af en vækstfaktorreceptor det translokerer til plasmamembranen og efterfølgende internaliseres i endosomer som vist i fig. 4. Ekspressionen af ​​en celleoverfladereceptor stand til at binde Grb2 er tilstrækkelig til at inducere denne translokation. I et typisk screening eksperiment, er ingen ændring i GFP-Grb2 lokalisering observeret. Men når et protein udtrykkes som rekrutterer Grb2 til en subcellulære sted, der er en ændring i lokalisering, der let kan visualiseres ved fluorescensmikroskopi. For eksempel, ekspression af EGFR resulterer i relocalization af GFP-Grb2 til endosom-lignende strukturer (fig.4). Når således anvendelse af et genom hele biblioteket, kan det forventes, at hidtil ukendte Grb2-bindende celleoverfladeproteiner kan identificeres.

Denne metode er ikke begrænset til påvisning af celleoverfladeproteiner. For eksempel inducerer Dynamin2 en ændring i sub-cellulære lokalisering af GFP-Grb2 viser endosom-lignende rekruttering (figur 5). Dynamin2 binder til det C-terminale SH3 domæne af Grb2 og er involveret i endocytosis af dette kompleks ^9,10. Således er denne fremgangsmåde muliggør identifikation af generelle proteinbindende komplekser og er ikke begrænset til identifikation af interaktion partnere til SH2 domæne.

Flere forskellige typer af translokation kan forventes såsom lokalisering til plasmamembranen, i endosomer, andre cytoplasmiske vesikulære strukturer eller til kernen. Derfor anbefales det, at alle billeder også kontrolleres af øjet. Når screening af store sæt af cDNA'er et automatiseretbilledanalyse algoritme er mere praktisk. I dette tilfælde er en kombination af algoritmer ønskelig, såsom spot detektion til at identificere endosomer, cytoplasma / kerne detektering at identificere nukleare shuttling og generelle morfologiske algoritmer til at identificere cellulære formændringer. Anvendelsen af disse forskellige fænotypiske detektionsmetoder er beskrevet mere detaljeret andetsteds ^11.

Figur 1. Overordnet ordning af forsøget. Det eksperiment detaljer en komplet high-content screening workflow starter med forstærkning og forberedelse af cDNA bibliotek, transfektion af cDNA vektorer plus reporterkonstruktioner, billede erhvervelse og billedanalyse ved hjælp af gratis open software IMAGEJ.

Figur 2. Konfiguration af Tecan Deck. (1) På den venstre side, brug for fem 100 ml render skal fyldes med puffere 1 (40 ml), 2 (40 ml), 3 (50 ml), AW (60 ml) og A4 (100 ml). Trough A4 skal fyldes igen en gang i løbet af proceduren. (2) vakuummanifold er placeret på position 14 i dette eksempel. (3) Deepwell plade med bakterielle pellets er placeret på position 30, ved siden af ​​elueringspufferen trug med 25 ml elueringspuffer. (4) Engangs tip til 8-kanals hoved skal lastes i spidsen stativer på venstre side og tips til flerkanals hoved skal besættes på position 40. The Tecan FreedomEvo væskehåndteringsudstyr, der anvendes i dette forsøg er udstyret med 500 pi sprøjter. se større tal .

Figur3. Automatisering af billedet erhvervelse på Opera LX. A) Vælg fanen Konfiguration (1). Aktivere laseren linier, der kræves til dette forsøg (2). Vælg de kameraer til billedoptagelse (3). Vælg pladetypen og objektivlinse for forsøget (4). B) Vælg mikroskop fanen (1). Definer lyskilden og eksponeringstid for eksponering 1 (2,3). Fokus på en brønd og tage højde (4). C) Vælg Experiment fanen (1). Træk og slip eksponering, skewcrop, reference, layout og sublayout filer (2). Træk og slip eksperimentet fil (3). D) Vælg Automatisk Experiment (1). Træk og slip eksperiment fil (2). Afsætte passende stregkode (3). Start billede erhvervelse ved at klikke på start-knappen (4). Klik her for at se større figur .

Figur 5. Eksempel på cDNA-induceret translokation af GFP-Grb2. The GTPase Dynamin2, der er involveret i Grb2 endocytose, flytter GFP-Grb2 til endosome-lignende strukturer (cirkel). I dette forsøg blev GFP-Grb2 cotransficeret med DNM2 ind HEK293T celler. Celler blev farvet med Hoechst 33342 efter 24 timer og billeder blev erhvervet på Opera LX. En synsfeltet for det grønne (GFP) kanal og UV (blå, Hoechst 33342) vises.

Discussion

Ekspressionskloning er et stærkt værktøj, som er blevet anvendt i fortiden for at identificere hidtil ukendte cellulære komponenter, såsom virus-receptorer og blodlegemer antigener ^12. Her beskriver vi en fremgangsmåde til at lette identifikationen af ​​hidtil ukendte putative signal transduktion receptorer, der binder til Grb2.

Der er nogle få kritiske trin i protokollen.

1. For automatiseret plasmid forberedelse er det absolut nødvendigt at have fuldstændig resuspension af den bakterielle pellet. Nogle gange er det nødvendigt at inkludere en streng ryste trin eller yderligere blanding med pipetter.
2. Efter tilsætning af opløsning 2 og 3, fuldstændig blanding er vigtig, og vi har fundet, at manuelt at vende forseglede plade er mere effektiv end anvendelse af en automatiseret rysteapparat. Pipettering bør undgås på dette trin, da det ville medføre forskydning af DNA'et.
3. I alle vakuum trin skal man sørge for, at væsken fuldstændigt drænesfra pladen. Ellers lave udbytter kan forventes.
4. Efter eluering, sker det ikke sjældent, at eluatet falder form i bunden af ​​plasmidet bindepladen. Disse dråber skal indsamles i elueringen pladen, så det anbefales, at plasmidet bindepladen løftes forsigtigt og eventuelle resterende dråber i bunden er omhyggeligt overført til eluatet pladen.
5. Under transfektion, er tidspunktet for kompleksdannelsen kritisk. Vi plejer at holde sig til 20-30 min. Længere tid op til 1 time er fint uden nedsættelse af udbyttet, mens kortere tider ikke anbefales.
6. For mikroskopi, er valget af forstørrelse vigtig. På Opera LX system, der anvendes her, er opløsning på 20x er tilstrækkelig til at få billeder af høj kvalitet. Hvis billeder i højere opløsning er påkrævet, målet kan ændres, men for at få statistisk signifikante antal celler, er et større antal felter og højere erhvervelsestider påkrævet. Generelt tager viat få mindst 100 celler filmede per brønd.

Grb2 translokation assay er blevet anvendt af andre grupper til at identificere inhibitorer med små molekyler af EGFR-kinase aktivering ^6. I så fald er EGFR aktiveres specifikt med ligand forårsager rekruttering af Grb2 til plasmamembranen. Forstyrrelse af denne interaktion kan derefter undersøgt under anvendelse af små molekyler. Ligeledes kan det tænkes, at siRNA skærme kan anvendes til at identificere endogene gener involveret i EGFR-Grb2 signalering eller andre Grb2-bindende vækstfaktor-receptorer, såsom c-Kit eller erythropoietin-receptoren. Der er således flere potentielle anvendelsesmuligheder for denne teknik. En analog fremgangsmåde kan anvendes på GFP-mærkede reportersystemer for andre adaptormolekyler såsom Shc, Gab eller IRS.

En væsentlig fordel ved anvendelse af denne celle-baseret assay i pattedyrceller er, at den muliggør identifikation af fysiologisk relvante interaktioner. Analysen er en udlæsning for protein kompleks formation, men endnu vigtigere er de relevante interaktioner overvåges ved den korrekte sub-cellulær site. I denne forbindelse overvinder denne teknik artefakter fra andre protein-protein-interaktion metoder såsom gær-to-hybrid-eller in vitro-assays. Det skal dog bemærkes, at indirekte interaktioner også kan resultere i Grb2 rekruttering. Tilsvarende kan det transkriptionelle opregulering af bindingspartnere induceres af cDNA-ekspression. At skelne mellem disse muligheder, er det nødvendigt at foretage den nødvendige sekundære assays til at skelne mellem direkte og indirekte bindende virkning.

Som konklusion, lover GFP-adapter molekyle translokation assay stort potentiale for genom-dækkende screening og drug discovery applikationer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
cDNA library	Origene
LB+amp
Gas-permeable seals	ThermoScientific	AB-0718
Nucleospin 96 Plasmid Kit	Macherey-Nagel	740625.4
Transfectin	BioRad	170-3351
H–chst33342	Molecular Probes	H3570
Viewplate 96 F TC	PerkinElmer	6005182
RapidPick	Hudson		Norgren CP7200
Freedom Evo	Tecan		With vacuum manifold
Multidrop 384	Thermo
Opera LX	PerkinElmer