Summary
ووصف إجراءات بسيطة وقابلة للتكرار لصنع الكولاجين ثلاث جمعيات متميزة هيكليا من نوع شائع المتاحة تجاريا I مونومر الكولاجين. نوع الأصلي، ويمكن أن تبنى تباعد طويلة ليفية أو قطعي الكولاجين تباعد طويل من خلال تغيير الظروف التي تكون طويلة و300 نانومتر يتعرض 1،4 نانومتر مونومر قطر بنة.
Abstract
ييفات الكولاجين موجودة في المصفوفة خارج الخلية من الأنسجة الحيوانية لتوفير السقالات الهيكلية والقوة الميكانيكية. هذه الألياف الكولاجين الأصلي لها دورية مميزة النطاقات من 67 نانومتر ~ وتتكون في الجسم الحي من خلال الجمعية هرمية من نوع الكولاجين مونومرات I، والتي هي 300 نانومتر في الطول و 1.4 نانومتر في القطر. في المختبر، من خلال تغيير الظروف التي تكون ويتعرض اللبنات مونومر، يمكن بناء هياكل فريدة من نوعها تتراوح في جداول طول مدة تصل إلى 50 ميكرون، بما في ذلك ليس فقط الألياف نوع الأصلي، ولكن أيضا ليفية طويلة تباعد وقطعي الكولاجين تباعد طويل هنا، نقدم إجراءات تشكيل الكولاجين ثلاثة هياكل مختلفة من مونومر المشتركة الكولاجين متوفرة تجاريا. باستخدام البروتوكولات التي نحن وغيرنا قد نشرت في الماضي لجعل هذه الأنواع الثلاثة تؤدي عادة إلى مزيج من الهياكل. على وجه الخصوص، كانت الألياف عادة و unbandedound عند اتخاذ الكولاجين الأصلية، والألياف الأصلية كانت غالبا ما تكون موجودة عند اتخاذ الليفية الكولاجين تباعد طويل. هذه الإجراءات الجديدة لديها ميزة إنتاج الكولاجين المطلوب نوع يفية على وجه الحصر تقريبا. يتم التحقق من تشكيل الهياكل المطلوبة عن طريق التصوير باستخدام مجهر القوة الذرية.
Introduction
الكولاجين هو فئة من البروتينات الهيكلية التي يكون لها هيكل ثلاثي حلزونية تكونت من ثلاث سلاسل ببتيد. هذه مونومرات الثلاثي حلزونية تجميع مزيد بطريقة الهيكل التنظيمي لتشكيل هياكل أكبر تدريجيا. هناك ما لا يقل عن 28 أنواع مختلفة وراثيا الكولاجين التي تم تحديدها 1. مجتمعة، تشكل الكولاجين 30٪ من البروتين الكلي وجدت في الحيوانات، مع النوع الأول الشكل السائد المحاسبة لمدة تصل إلى 90٪ من مجموع بروتينات الكولاجين و2. تم العثور على النوع الأول الكولاجين والهياكل fibrillous في الجلد، والأوتار والأربطة والعظام. مجهر القوة الذرية (AFM) والمجهر الالكتروني (EM) صور النوع الأول ألياف الكولاجين الأصلية عادة ما تظهر النطاقات مع فترة 67 نانومتر من سمات ~ (غالبا ما يشار إليها باسم D-النطاقات) 3-5.
النوع الأول الكولاجين مونومر هو heterotrimer حلزونية ثلاثية تتكون من اثنين من α1 متطابقة (I) سلاسل واحد α2 (I) السلسلة، أكثر من كلألف الأحماض الأمينية طويلة. وهو طويل ورقيقة مع أبعاد 300 نانومتر في الطول و 1.4 نانومتر في القطر. النوع الأول يمكن الحصول عليها بسهولة مونومر الكولاجين عن طريق تحطيم هياكل تشكلت طبيعيا مرتبة أعلى 6. لقد أظهرنا الكثير من 8-10 7 و غيرها من الجهات التي يمكن بعد هذه مونومر ذوبان كتل بناء يمكن استخدامها لإعادة بناء D-النطاقات الألياف في المختبر (الشكل 1).
بالإضافة إلى الألياف الكولاجين الأصلية، تم العثور على اثنين آخرين الكولاجين أعلى ترتيب لتشكيل الهياكل في المختبر باستخدام بناء مونومر نفس الكتلة. الهياكل هما تباعد طويلة ليفية (FLS) وتباعد طويل قطعي (SLS) الكولاجين (الشكل 1). FLS الكولاجين هو بناء fibrillous مثل الكولاجين الأصلية، ولكن يتميز أكبر من الكولاجين دورية النطاقات المحلية 11. في المختبر، FLS الكولاجين تتشكل عندما يتم الجمع بين مونومر مع الكولاجين بروتين سكري الحمضية α1
والهدف من هذا المخطوط هو تقديم الإجراءات التفصيلية لصنع الألياف الكولاجين الأصليين FLS جيدا وSLS الكولاجين أنه حتى الباحثين الأكثر الحاحا في الخبرة يمكن أن تتكاثر. استخدام المواد المتقدمة المتاحة تجاريا البداية، حاولنا جعل البروتوكولات بسيطة قدر الإمكان والعمل لا يزال يكون لهم بشكل موثوق. ونحن أيضا بالتفصيل كيفية استخدام AFM لوصف بنية الكولاجين مختلفةق التي يتم إجراؤها. وهذا العمل يكون مفيدا للباحثين الذين يرغبون في دراسة واحدة أو أكثر من هذه الهياكل أجل أعلى الكولاجين و / أو استخدامها كما السلائف في تطبيقات أخرى، ولكنها تفتقر حاليا من الخبرات أو ببساطة لا يرغبون في العمل مع عينات الأنسجة.
Protocol
ملاحظة: المياه المستخدمة في بروتوكولات كل لها مقاومة> 18 MΩ.cm.
1. ييفات الكولاجين الأصلية
- الجمع بين 6 ميكرولتر من المياه، 20 ميكرولتر من 200 مم نا 2 HPO 4 تعديلها لدرجة الحموضة 7 مع حمض الهيدروكلوريك و 10 ميكرولتر من 400 ملم بوكل في أنبوب microfuge والمزيج.
- إضافة 4 ميكرولتر من مونومر الكولاجين (~ 3 ملغ / مل في حمض الهيدروكلوريك N 0.01) إلى أنبوب microfuge والمزيج. ينبغي أن تكون واضحة والحل عديم اللون.
- وضع أنبوب يحتوي على microfuge خليط التفاعل في كتلة الحرارة التي تم قبل تحسنت إلى 37 ° C وترك لمدة 3 إلى 4 ساعات. في هذه المرحلة، ينبغي أن يكون الحل غائم قليلا، وتحتوي على الألياف الكولاجين الأصلي في المقام الأول.
2. ليفية الكولاجين تباعد طويل
- Dialyze 1 مل من الكولاجين مونومر (~ 3 ملغ / مل في حمض الهيدروكلوريك N 0.01) باستخدام غشاء 12-14 كيلو دالتون ضد MWCO 400 مل من الماء، وتغيير المياه أربعة أضعاف خلال فترة 24 ساعة في درجة حرارة الغرفة. وcollag مدالويمكن تخزين EN مونومر عدم استخدام على الفور في 4 درجات مئوية لاستخدامها في المستقبل.
- الجمع بين 20 ميكرولتر من الماء، و 20 ميكرولتر من 3 بروتين سكري الحمضية α1 ملغ / مل في الماء و 20 ميكرولتر من مونومر الكولاجين مدال في أنبوب microfuge. ينبغي أن تكون واضحة والحل عديم اللون.
- ترك الأنبوب الذي يحتوي على microfuge خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. في هذه المرحلة، ينبغي أن يكون الحل غائما وتحتوي على الألياف الكولاجين FLS في الغالب.
3. قطعي الكولاجين تباعد طويل
- الجمع بين 67 ميكرولتر من المياه، و 60 ميكرولتر من 100 العازلة جليكاين، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 3،3 ملم على و 40 ميكرولتر من 10 ملغ / مل في الماء ATP في أنبوب microfuge والمزيج.
- إضافة 33 ميكرولتر من مونومر الكولاجين (~ 3 ملغ / مل في حمض الهيدروكلوريك N 0.01) إلى أنبوب microfuge والمزيج. ينبغي أن تكون واضحة والحل عديم اللون.
- ترك الأنبوب الذي يحتوي على microfuge خليط التفاعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. عند هذه النقطة، فإن الحل لا يزال يظهر واضحا، ولكن ينبغيتحتوي على الكولاجين SLS في الغالب.
4. AFM توصيف
- يلتصق سطح قطعة من الميكا تعلق على الركيزة AFM من خلال تغطية سطح الميكا مع قطعة من شريط لاصق ثم تقشير بعيدا. تحقق من الشريط بعد ذلك لتأكيد أنه تم المشقوق طبقة كاملة من الميكا من أجل الحد من المخالفات على السطح وضمان أن تتم إزالة عينة من العمر إذا كان يتم إعادة استخدام الميكا.
- تطبيق 20 ميكرولتر من الحل ليفية الكولاجين لالركيزة الميكا المشقوق حديثا. يترك لمدة 5 دقائق.
- شطف قبالة بلطف حل ليفية الكولاجين بالماء. فإنه من المستحسن عدم تطبيق مباشرة على المياه وسط الركيزة الميكا ولكن على حافة والسماح لها بالتدفق عبر العينة.
- يجف السطح تحت تيار لطيف من غاز النيتروجين. فإنه من المستحسن أن توجيه تيار على حافة وليس في مركز الركيزة الميكا.
- تحت المجهر الضوئي في التكبير × 200،ينبغي أن العينات الأصلية الكولاجين وFLS تظهر كتل من الألياف. سوف SLS الكولاجين لا تكون مرئية.
- يمكن ملاحظة خصائص فريدة من ثلاثة هياكل مختلفة من الكولاجين AFM. عموما، نحن ييفات الكولاجين الصورة الأصلية مع AFM في وضع الاتصال المتقطع باستخدام السيليكون تحقيقات AFM، في حين FLS والكولاجين SLS ييفات نحن عادة صورة مع AFM في وضع الاتصال باستخدام السيليكون نيتريد تحقيقات AFM. ونحن نفعل ذلك لأن من الوقت واعتبارات التكلفة. السيليكون تحقيقات AFM وعادة ما تكون أكثر حدة من نيتريد السيليكون تحقيقات AFM، مما يجعلها مفيدة بشكل خاص للتصوير في أضيق النطاقات هيكل من الألياف الكولاجين الأصلية. ومع ذلك، السيليكون تحقيقات AFM هي أكثر عرضة للتلوث عن طريق عينات من الكولاجين نيتريد السيليكون تحقيقات AFM وتحتاج إلى استبدال كثير من الأحيان. ولذلك، فإننا نحتفظ استخدام السيليكون AFM تحقيقات في الغالب لييفات الكولاجين الأصلية التصوير حيث القرار هو أكبر الضرورة ونعمل في وضع الاتصال المتقطع لprolاونج من عمر جدوى.
نوصي أولية 100 × 100 ميكرون 2 المسح الذي ينبغي أن تظهر على الأقل يبني الكولاجين قليلة. من التكبير، وهناك في لمسح أحجام 10 × 10 ميكرون 2 ثم 2 × 2 ميكرومتر 2 إلى مراقبة دورية النطاقات الكولاجين الأصلية وFLS، أو ملامح أدق من الكولاجين SLS. بل هو أيضا فكرة جيدة للتحقق من اثنين على الأقل من مناطق أخرى على عينة الكولاجين للتحقق من أن المسح الأولي تمثل.
Representative Results
الكولاجين الأصلية
خليط التفاعل قدره 0.3 ~ مونومر الكولاجين ملغ / مل في الفوسفات 100 ملم و 100 ملم على بوكل الرقم الهيدروجيني 7 غادر في 37 درجة مئوية لمدة ساعة 3-4 سوف تسفر محلول يحتوي على الألياف الكولاجين الأصلي نوع واضحة ~ 67 نانومتر D-النطاقات، دون الألياف unbanded.
تحت المجهر الضوئي في التكبير × 200، يمكن كتل من الألياف عدة ينظر عادة على الركيزة الميكا خاصة عندما شاهدوا على النقيض من التدخل الفرق (DIC) المجهر (الشكل 2). في عينة نموذجية، 100 × عشوائية سوف تفحص 100 ميكرون 2 من AFM عادة ما تظهر على الاقل الألياف القليلة التي هي ميكرون 5-50 طويلة (أرقام 3A-C). الفردية، يمكن ييفات الكولاجين مفصولة التعرف عليها بسهولة في هذه المرحلة. مع 512 × 512 بكسل مسح الصورة 2، التكبير إلى 10 × 10 ميكرون حجم 2 يبين المسح الضوئي التي تجمعت جميع الألياف (أرقام 3D-F 2 (أرقام 3G-I).
يمكن ربط دورية يحددها قياس ببساطة وبلغ متوسط المسافة الطولية بين عدة قمم أو الوديان. بدلا من ذلك، إذا كان البرنامج يسمح AFM، وهو أحد الأبعاد تحويل فورييه على طول المقطع العرضي الطولي يمكن أن تستخدم أيضا. ويبين الشكل 4 صورة ارتفاع ليفية AFM والمقابلة طولية المقطع العرضي.
FLS الكولاجين
سوف خليط التفاعل من 1 بروتين سكري الحمضية μ1 ملغ / مل و~ 1 مونومر الكولاجين ملغ / مل في الماء ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة تسفر عن حل لييفات الكولاجين FLS.
يمكن كتل من الألياف، على غرار ما لوحظ في حالة الكولاجين الأصلية، ينظر اليه بسهولة على الركيزة الميكا تحت المجهر الضوئي في 200 م ×agnification. في عينة نموذجية، وعشوائية 100 × 100 ميكرون 2 المسح بواسطة AFM عادة ما تظهر على الاقل الألياف قليلة. مع 512 × 512 بكسل حجم 2 صورة المسح الضوئي، يمكن قياس وتيرة النطاقات من التكبير إلى 10 × 10 ميكرون 2 المسح الضوئي (الشكل 5A) أو بدقة أكثر مع 5C الشكل 2 × 2 ميكرومتر 2 المسح الضوئي (الشكل 5B). يظهر طولية المقطع العرضي ليفية FLS.
SLS الكولاجين
سوف خليط التفاعل من 2 ملغ / مل ATP و~ 0.5 ملغ / مل من مونومر الكولاجين في 100 العازلة جليكاين، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 3،3 ملم على ترك في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة تسفر عن حل الكولاجين SLS.
عادة، سوف crystallites SLS لا تكون مرئية تحت المجهر الضوئي. مطلوب AFM لتأكيد وجود crystallites SLS. في عينة نموذجية، وعشوائية 100 × 100 ميكرون 2 المسح بواسطة AFM عادة ما تظهر العديد منالنقاط. والتكبير في فحص 10 × 10 2 ميكرومتر عادة ما تظهر عدة SLS crystallites (الشكل 6A). و2 × 2 ميكرومتر 2 المسح الضوئي (الشكل 6B) يبين هيكل أدق من الكريستال SLS.
الشكل 1. والأشكال الثلاثة مختلفة هيكليا من الألياف الكولاجين التي يمكن تشكيلها في المختبر من مونومر الكولاجين. الصور التي تصور AFM مونومر الكولاجين الكولاجين وثلاثة هياكل النظام أعلى على مقياس كل نفس الحجم (2 × 2 ميكرومتر 2).
الشكل 2. الرقمية في صورة ~ التكبير × 200 بواسطة المجهر الضوئي من مدينة دبي للإنترنت الألياف الكولاجين الأصلية على الميكا (أ) لم يمسها و (ب) وشحذ ر thresholdedس تسليط الضوء على الألياف.
الشكل 3. الصور AFM من الألياف الكولاجين الأصلية على الميكا. وتظهر متقطعة الاتصال AFM وضع الصور السعة.
الشكل 4 (أ) 0.5 × 1 ميكرومتر 2 الوضع اتصال متقطع AFM صورة ارتفاع (المقياس العمودي = 100 نانومتر) و (ب) طولية المقطع العرضي ليفية الكولاجين الأصلية.
الشكل 5. الصور AFM من الألياف الكولاجين FLS على الميكا. (أ) 10 × 10 ميكرون 2 اتصل انحراف AFM وضع الصور، (ب) 2 × 2 ميكرومتر 2 اتصل انحراف AFM وضع الصور والطولية (ج)المقطع العرضي ليفية الكولاجين FLS.
الشكل 6. الصور AFM الكولاجين SLS على الميكا. وتظهر متقطعة الاتصال AFM وضع الصور السعة.
Discussion
تنقية مونومر الكولاجين هو مستقر في انخفاض الرقم الهيدروجيني ودرجة الحرارة وتشكيل الكولاجين الألياف الأصلي ينطوي أساسا رفع درجة الحموضة ودرجة حرارة الكولاجين حل مونومر. وقد وجدت إجراءات لإعادة تشكيل الكولاجين الألياف النطاقات من مونومرات لأكثر من 50 عاما. تلخيص الإجراء الذي مختبرنا المستخدمة في دراساتنا الأولى مع الكولاجين قبل 15 عاما واستند 7 على الإجراءات التي تشابمان وزملاء العمل في 1986 10. وكانت الظروف لتشكيل الكولاجين لييف في هذا العمل في وقت سابق 0.18 مغ / مل من الكولاجين في مونومر نا 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0.2، ودرجة الحموضة 7.4) المخزن المؤقت في 34 ° C. والعيب في هذه وغيرها من الإجراءات التي حاولنا أن هناك الألياف unbanded دائما إلى جانب تشكيل لييفات النطاقات المطلوب. شروطنا الجديدة ~ 0.3 ملغ / مل من الكولاجين في مونومر الفوسفات 100 ملم و 100 ملم على بوكل الرقم الهيدروجيني 7 غادر في 37 درجة مئوية لمدة ساعة 3-4. اإلجراءاتوصف dure هنا يختلف في كل جانب من جوانب من الإجراء في وقت سابق لصنع الألياف الكولاجين الأصلية. ولكن معظم بشكل ملحوظ، ونحن قد تضاعفت قوة الأيونية عن طريق رفع تركيز العازلة وبإضافة 100 ملي بوكل. الزيادة في نتائج القوة الأيونية في تشكيل أكثر اتساقا من الألياف الكولاجين النطاقات حصرا.
في تجربتنا، وكان مرات فقط أن هذا الإجراء لم تنتج الكولاجين نوع الأصلية عندما حل مونومر الكولاجين بعد موعد أوصت الشركة المصنعة للاستخدام. وعندما يحدث هذا، لوحظ ما يتراوح بين أقل الألياف التي unbanded جميع لاحظ العديد من الألياف ولكن لا يزال يغلب عليها الطابع unbanded. نلاحظ أن منتهية الصلاحية مونومر الكولاجين وغالبا ما يزال استخدامها بنجاح لجعل الكولاجين الأصلية، ولكن عندما فشل في ذلك يتعين شراؤها جديدة مونومر بالتأكيد أن الكولاجين.
كان أول من عرف من FLS Highberger وآخرون 17 في التحضيرات الكولاجين لحساب Orekhovicح وآخرون 18. أدى إجراء المزيد من الدراسات وHighberger شميت أن نستنتج أن كان بروتين سكري الحمضية α1 تعزز تشكيل FLS 12. كنا في وقت لاحق قادرة على تكرار الإجراء لصنع الكولاجين من خلال الجمع بين FLS المتاحة تجاريا مونومر الكولاجين وبروتين سكري الحمضية α1 في انخفاض الرقم الهيدروجيني ودرجة الحموضة مما يسمح ببطء ليرتفع بنسبة dialyzing الخليط ضد الماء لمدة 24 ساعة 11. نقدم الآن تعديل هذا الإجراء من قبل dialyzing المونمر الكولاجين ضد الماء أولا والجمع ببساطة مع α1 بروتين سكري الحمضية في الماء لتكوين الكولاجين FLS. شروط FLS الكولاجين الجمعية الموصوفة هنا هي اقل بكثير من مضيعة للوقت. ومونومر الكولاجين لا تزال بحاجة إلى أن تكون قبل مدال ضد المياه، ولكن يمكن أن يتم ذلك في معظم وتخزينها ثم في 4 درجات مئوية حتى ستابلي استخدامها. هذا الإجراء الجديد غلة FLS في الغالب ييفات الكولاجين النطاقات.
من تجربتنا، α1 الحمضية غليكوالبروتين مع البروتين والماء أقل مجتمعة، وفقا للمحتوى الاستدلال أعلى السكر، أمر بالغ الأهمية لصنع الألياف FLS بنجاح. ونحن عادة تحقق مع الشركة المصنعة أن الكثير بروتين سكري الحمضية α1 التي نستخدمها ومجتمعة نسبة البروتين والماء من 82٪ أو أقل. ويمكن كما هو الحال مع الإجراء لتخليق الكولاجين الأصلية، مونومر الكولاجين ما هو قديم جدا يؤدي أيضا إلى عدم إنتاج الكولاجين FLS. وبالإضافة إلى ذلك، على نقاء المياه المستخدمة لغسيل الكلى أمر بالغ الأهمية في هذا الإجراء. على سبيل المثال، غسيل الكلى من مونومر الكولاجين حتى ضد ~ 8 MΩ.cm بدلا من> الماء MΩ.cm 18 نتيجة في حل الكولاجين التي لن تشكل الكولاجين FLS.
ثلاثة أنواع من الكولاجين ليفية، وأسهل لجعل هو SLS الكولاجين. ووصف أقرب إعداد SLS بواسطة شميت وزملاء العمل-15. نشرنا على التكيف من هذا الإجراء قبل 12 عاما لصنع الكولاجين باستخدام SLS كول المتاحة تجارياآجا 14. الإجراء ينطوي ببساطة الجمع بين 2 ملغ / مل و 0.5 ATP ملغ / مل من الكولاجين في مونومر 0.05٪ (V / V) حامض الخليك في درجة الحموضة 3.5، وترك الخليط في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
في تجربتنا، وجانبا مهما من الجمعية SLS التي يجب أن يسيطر هو الرقم الهيدروجيني للمحلول التفاعل. SLS تجميعها في ظروف أكثر الأساسية (درجة الحموضة 3،6-3،9 ~) النتائج المجمعة في كتل من crystallites. أكثر حمضية الظروف (درجة الحموضة 2،9-3،2 ~) النتائج في crystallites أرق، وأكثر من فصل تلك التي جمعت تحت الظروف المثالية من درجة الحموضة 3،3-3،5. بالوسط رد فعل خارج هذا النطاق (<2.8 و> 4) لا تسفر عن أي الكولاجين SLS. في الماضي، نحن تعديل الرقم الهيدروجيني للخليط التفاعل عن طريق إضافة حمض الخليك. لتبسيط الإجراء إلى أبعد من ذلك، في هذه المخطوطة قدمنا منطقة عازلة جليكاين، حمض الهيدروكلوريك للسيطرة على الرقم الهيدروجيني.
ثلاثة هياكل مختلفة الكولاجين تكونت من البروتوكولات المذكورة أعلاه لها طابعلا يمكن إلا أن ميزات istic يمكن تمييزها عن طريق الصكوك قادرة على قرار نانومتر. وتتميز الكولاجين الأصلية وFLS من النطاقات دوريات من 67 نانومتر ~ و ~ نانومتر 270. أطول البعد الكولاجين SLS هو مجرد ~ نانومتر 360. وقد وصفت ونحن على وجه التحديد كيفية استخدام AFM لوصف ثلاثة هياكل الكولاجين مختلفة. ومع ذلك، فإن أي AFM التشغيل على اتصال متقطع أو وضع أي اتصال مع التحقيق AFM وجود <دائرة نصف قطرها 10 نانومتر تكون ايضا قادرة على صورة هذه الهياكل الكولاجين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون الإلكترون المجهري واستخدمت لوصف هذه الهياكل الكولاجين 19.
والميزة الرئيسية لهذه الإجراءات هو أنها تنتج في الغالب بناء الكولاجين المطلوب. الشكل الوحيد أخرى من الكولاجين التي وجدت في ردود الفعل هذه هو مونومر انطلاق، التي غالبا ما تكون وضوحا في الخلفية من الصور AFM. في حالة الكولاجين الأصلية وFLS، يمكن انهما انفصلا بسهولة من معظم unreaالمديرية مونومر بواسطة الطرد المركزي المتكررة وغسل الأم أو الناتجة FLS بيليه الكولاجين بالماء.
قدمنا إجراءات بسيطة وموثوق بها لجعل الأم، والكولاجين FLS SLS باستخدام المتقدمة، متوفرة تجاريا المواد الأولية. ومونومر الكولاجين المستخدمة في كل هذه الإجراءات هي متاحة تجاريا في شكل منقى. α1 بروتين سكري الحمضية وATP هي أيضا وكلاهما متاح تجاريا.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
نود أن نشكر جميع الماضي الجامعية كثيرة، طلاب الدراسات العليا وما بعد الدكتوراه الذين ساهموا وقتهم وجهدهم لدراسة تكون الألياف الكولاجين في مختبرنا. قدمت العلوم الطبيعية والهندسة مجلس البحوث كندا باستمرار تمويل دراسات الكولاجين لدينا.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
| ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
| α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
| a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
| mica | Ted Pella | 53 | |
| Pointprobe - Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
| Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |
References
- Kadler, K. E., Baldock, C., Bella, J., Boot-Handford, R. P.
- Abraham, L. C., Zuena, E., Perez-Ramirez, B., Kaplan, D. L. Guide to Collagen Characterization for Bio Studies. J. Biomed. Mat. Res. 87B, 264-285 (2008).
- Baselt, D. R., Revel, J. -P., Baldeschwieler, J. D. Subfibrillar Structure of Type I Collagen Observed by Atomic Force Microscopy. Biophys. J. 65, 2644-2655 (1993).
- Petruska, J. A., Hodge, A. J. A Subunit Model for Tropocollagen Macromolecule. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 51, 871-876 (1964).
- Smith, J. W.
- Gross, J., Highberger, J. H., Schmitt, F. O. Extract of collagen from connective tissue by neutral salt solutions. PNAS. 41, 1-7 (1955).
- Gale, M., Pollanen, M. S., Markiewicz, P., Goh, M. C. Sequential assembly of collagen revealed by atomic force microscopy. Biophys. J. 68, 2124-2128 (1995).
- Wood, G. C., Keech, M. K. The formation of fibrils from collagen solutions. Biochem. J. 75, 588-597 (1960).
- Williams, B. R., Gelman, R. A., Poppke, D. C., Piez, K. A.
- Holmes, D. F., Capaldi, M. J., Chapman, J. A. Reconstitution of collagen fibrils in vitro; the assembly process depends on the initiating procedure. Int. J. Biol. Macromol. 8, 161-166 (1986).
- Paige, M. F., Rainey, J. K., Goh, M. C. Fibrous long spacing collagen ultrastructure elucidated by atomic force microscopy. Biophysical Journal. 74, 3211-3216 (1998).
- Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. The interaction of mucoprotein with soluble collagen; an electron microscope study. PNAS. 37, 286-291 (1951).
- Ghadially, F. N. Ultrastructural pathology of the cell and matrix. , 3rd Edition, Butterworths. London. (1988).
- Paige, M. F., Goh, M. C. Ultrastructure and assembly of segmental long spacing collagen studied by atomic force microscopy. Micron. 74, 355-361 (2001).
- Schmitt, F. O., Gross, J., Highberger, J. H. A new particle type in certain connective tissue extracts. PNAS. 39, 459-470 (1953).
- Bruns, R. R., Hulmes, D. J. S., Therrien, S. F., Gross, J. Procollagen segment-long-spacing crystallites: their role in collagen fibrillogenesis. PNAS. 76, 313-317 (1979).
- Highberger, J. H., Gross, J., Schmitt, F. O. Electron microscope observations of certain fibrous structures obtained from connective tissue extracts. JACS. 72, 3321-3322 (1950).
- Orekhovich, V. N., Tustanovsky, A. A., Orekhovich, K. D., Plotnikova, N. E.
- Lin, A. C., Goh, M. C. Investigating the ultrastructure of fibrous long spacing collagen by parallel atomic force and transmission electron microscopy. Proteins. 49, 378-384 (2002).
