Summary
Los procedimientos simples y reproducibles se describen para hacer tres conjuntos de colágeno estructuralmente distintos de un tipo común disponible en el mercado que monómero de colágeno. Tipo nativo, el espaciamiento fibroso largo o colágeno segmentaria espaciamiento largo puede ser construido mediante la variación de las condiciones a las que los 300 nm de longitud y 1,4 nm de diámetro monómero bloque de construcción está expuesto.
Abstract
Las fibrillas de colágeno están presentes en la matriz extracelular del tejido animal para proporcionar andamiaje estructural y resistencia mecánica. Estas fibrillas de colágeno nativas tienen una periodicidad característica de bandas de ~ 67 nm y se forman in vivo a través del conjunto jerárquico de monómeros de colágeno de tipo I, que son 300 nm de longitud y 1,4 nm de diámetro. In vitro, mediante la variación de las condiciones a las que el bloques monoméricos de construcción están expuestos, estructuras únicas en escalas de longitud que van hasta 50 micrómetros pueden ser construidos, incluyendo no sólo las fibrillas de tipo nativo, pero también espaciamiento largo y fibroso de colágeno segmentaria espaciamiento largo. Aquí, se presenta procedimientos para la formación de las tres estructuras diferentes de colágeno a partir de un monómero de colágeno disponible en el mercado común. Utilizando los protocolos que nosotros y otros han publicado en el pasado para hacer estos tres tipos conducen típicamente a mezclas de estructuras. En particular, las fibrillas anillados eran comúnmente found la hora de tomar colágeno nativo, y fibrillas nativas eran a menudo presentes al tomar colágeno fibroso espacio largo. Estos nuevos procedimientos tienen la ventaja de producir el tipo de fibrillas de colágeno deseado casi exclusivamente. La formación de las estructuras deseadas se verifica mediante formación de imágenes utilizando un microscopio de fuerza atómica.
Introduction
El colágeno es una clase de proteínas estructurales que tienen una estructura de triple hélice formada a partir de tres cadenas polipeptídicas. Estos monómeros helicoidales triples además montar en un modo jerárquico para formar estructuras cada vez más grandes. Existen al menos 28 tipos de colágeno genéticamente distintos que se han identificado 1. Combinados, los colágenos representan el 30% de la proteína total que se encuentra en los animales, con el tipo I de la contabilidad forma predominante de hasta el 90% del total de 2 proteínas de colágeno. El colágeno tipo I se encuentra como estructuras fibrillous en piel, ligamentos, tendones y huesos. Microscopio de fuerza atómica (AFM) y microscopía electrónica (EM) imágenes de tipo I, fibras de colágeno nativo típicamente muestran bandas con un período característico de ~ 67 nm (a menudo denominado D-bandas) 3-5.
Monómero de colágeno de tipo I es una triple helicoidal heterotrímero que consta de dos α1 idénticos (I) y un cadenas α2 (I) de la cadena, cada uno de más de unmiles de aminoácidos de longitud. Es largo y delgado, con dimensiones de 300 nm de longitud y 1,4 nm de diámetro. Monómero de colágeno de tipo I se pueden obtener fácilmente por descomponerse naturalmente formadas estructuras de orden superior 6. Nos 7 y 8-10 muchos otros han demostrado que estos bloques de construcción de monómeros solubles entonces se puede utilizar para reconstruir D-banded fibrillas in vitro (Figura 1).
Además de las fibrillas de colágeno nativas, otras dos estructuras de mayor orden de colágeno se han encontrado para formar in vitro usando el bloque de monómero mismo edificio. Las dos estructuras están espaciando fibroso largo (FLS) y el espaciamiento segmentaria largo (SLS) de colágeno (Figura 1). FLS colágeno es una construcción fibrillous como el colágeno nativo, pero se caracteriza por una mayor periodicidad de bandas de colágeno nativo 11. In vitro, el colágeno FLS se forma cuando el monómero de colágeno se combina con glicoproteína α1-ácido
El objetivo de este manuscrito es presentar procedimientos detallados para la fabricación de fibrillas de colágeno nativas como FLS así SLS y el colágeno que incluso el investigador más inexperto puede reproducir. El uso de materiales avanzados disponibles en el mercado de partida, hemos tratado de hacer que los protocolos tan simples como sea posible y todavía les funciona correctamente. También detalle cómo utilizar un AFM para caracterizar la estructura de colágeno diferentes que se hacen. Este trabajo será beneficioso para los investigadores que deseen estudiar una o más de estas estructuras de colágeno de orden superior y / o los usan como precursores en otras aplicaciones, pero en la actualidad carecen de la experiencia o simplemente no desean trabajar con muestras de tejido.
Protocol
NOTA: El agua usada en todos los protocolos tiene una resistividad> 18 MΩ.cm.
1. Las fibrillas de colágeno nativo
- Combinar 6 l de agua, 20 l de 200 mM Na 2 HPO 4 ajustó a pH 7 con HCl y 10 l de 400 mM de KCl en un tubo de microcentrífuga y se mezcla.
- Añadir 4 l de colágeno monómero (~ 3 mg / ml en HCl 0,01 N) para el tubo de microfuga y se mezcla. La solución debe ser transparente e incolora.
- Colocar el tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla de reacción en un bloque de calor que ha sido precalentada a 37 ° C y se deja durante 3 a 4 horas. En este punto, la solución debe ser ligeramente turbia y contiene principalmente fibras de colágeno nativas.
2. El colágeno fibroso Espaciamiento Long
- Dializar 1 ml de colágeno monómero (~ 3 mg / ml en HCl 0,01 N) utilizando 12-14 kDa membrana MWCO contra 400 ml de agua, cambiando el agua cuatro veces durante un período de 24 horas a temperatura ambiente. El dializado collagmonómero en que no se utiliza de inmediato se puede almacenar a 4 ° C para su uso futuro.
- Combinar 20 l de agua, 20 l de 3 mg / ml α1-glicoproteína ácida en agua y 20 l de monómero de colágeno dializado en un tubo de microcentrífuga. La solución debe ser transparente e incolora.
- Deje el tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 30 min. En este punto, la solución debe ser turbia y contienen fibrillas de colágeno predominantemente de FLS.
3. El colágeno segmentaria Espaciamiento Long
- Combinar 67 l de agua, 60 l de 100 mM de glicina-HCl a pH 3,3 y 40 l de 10 mg / ml ATP en agua en un tubo de microcentrífuga y se mezcla.
- Añadir 33 l de colágeno monómero (~ 3 mg / ml en HCl 0,01 N) para el tubo de microfuga y se mezcla. La solución debe ser transparente e incolora.
- Deje el tubo de microcentrífuga que contiene la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 2 h. En este punto, la solución todavía tiene un aspecto transparente, pero deberíacontienen colágeno principalmente SLS.
4. Caracterización AFM
- Cleave la superficie de una pieza de mica unido a un sustrato AFM cubriendo la superficie de la mica con un trozo de cinta adhesiva y luego retirándola. Compruebe la cinta después para confirmar que toda la capa de mica se escindió con el fin de reducir las irregularidades en la superficie y asegurar que la muestra se retira el viejo si la mica está siendo reutilizada.
- Aplicar 20 ml de la solución de colágeno fibrilar al sustrato de mica recién cortado. Dejar durante 5 min.
- Enjuague suavemente de solución de colágeno fibrilar con agua. Es aconsejable no aplicar el agua directamente sobre el centro del sustrato de mica pero en el borde y para permitir que fluya a través de la muestra.
- Secar la superficie con una ligera corriente de nitrógeno gas. Es aconsejable para dirigir la corriente en el borde y no en el centro del sustrato de mica.
- Bajo un microscopio óptico con un aumento de × 200,las muestras de colágeno nativo y FLS debe mostrar grupos de fibrillas. Colágeno SLS no será visible.
- Las características únicas de los tres diferentes estructuras de colágeno son observables por AFM. Por lo general, las fibrillas de colágeno de imágenes nativas con un AFM en modo de contacto intermitente con sondas de AFM de silicio, mientras FLS y el colágeno SLS fibrillas solemos imagen con un AFM en modo de contacto con nitruro de silicio sondas de AFM. Lo hacemos por falta de tiempo y coste. Sondas de AFM de silicio son generalmente más nítida que de nitruro de silicio sondas de AFM, que los hacen particularmente útiles para la formación de imágenes de la estructura de bandas estrechas de las fibrillas de colágeno nativo. Sin embargo, las sondas de AFM de silicio son mucho más propensos a la contaminación por las muestras de colágeno de nitruro de silicio sondas de AFM y necesitan sustituirse con frecuencia. Por lo tanto, nos reservamos el uso de sondas de AFM de silicio principalmente por fibrillas de colágeno de imágenes nativas donde la resolución es una necesidad mayor y operamos en el modo de contacto intermitente a prolOng su vida de utilidad.
Se recomienda una inicial de 100 × 100 m 2 scan que debe mostrar al menos unos pocos construcciones de colágeno. A partir de ahí, acercar a escanear tamaños de 10 × 10 micras 2 y luego 2 x 2 m 2 para observar la periodicidad de bandas de colágeno nativo y FLS, o sus más finos de un colágeno SLS. También es una buena idea para comprobar al menos otras dos regiones en la muestra de colágeno para verificar que las exploraciones iniciales son representativos.
Representative Results
Colágeno nativo
La mezcla de reacción de 0,3 ~ monómero de colágeno mg / ml en fosfato 100 mM y KCl 100 mM a pH 7 a la izquierda en 37 ° C durante 3-4 horas dará lugar a una solución que contiene fibrillas de colágeno de tipo nativas con clara ~ 67 nm D-bandas, sin fibrillas anillados.
Bajo un microscopio óptico con un aumento de × 200, los montones de fibrillas de varios puede ser normalmente se ve en el sustrato de mica en particular cuando se ven por contraste de interferencia diferencial (DIC) microscopía (Figura 2). En un ejemplo típico, una aleatoria 100 × 100 micras 2 exploración por AFM mostrará generalmente al menos unas pocas fibrillas que son 5-50 micras de largo (Figuras 3A-C). Individual, fibrillas separadas de colágeno pueden ser fácilmente identificados en esta etapa. Con un 512 × 512 scan píxel de la imagen 2, el zoom en un 10 × 10 micras tamaño de escaneo 2 muestra que todas las fibrillas son anillados (Figuras 3d-f 2 Tamaño de escaneado (figuras 3g-i).
Banding periodicidad puede ser determinado midiendo simplemente y promediando la distancia longitudinal entre varios picos o valles. Alternativamente, si el software AFM permite, una Fourier unidimensional transformar a lo largo de una sección transversal longitudinal también se puede utilizar. Figura 4 muestra una imagen de AFM de una altura de fibrillas y una correspondiente sección transversal longitudinal.
FLS colágeno
La mezcla de reacción de 1 mg / ml μ1-glicoproteína ácida y ~ 1 mg / ml de monómero de colágeno en agua se dejó a temperatura ambiente durante 30 min producirá una solución de fibrillas de colágeno FLS.
Los grupos de fibrillas, de manera similar a lo que se observa en el caso del colágeno nativo, se puede ver fácilmente en el sustrato de mica con un microscopio óptico a 200 × magnification. En un ejemplo típico, un azar de 100 × 100 m 2 análisis por AFM suele mostrar por lo menos unas pocas fibrillas. Con un 512 × 512 píxeles 2 tamaño de imagen de exploración, la periodicidad de bandas se puede medir por el zoom en un 10 × 10 m 2 exploración (Figura 5a) o más exactamente con una 5c 2 × 2 m 2 exploración (Figura 5b). Figura muestra una sección transversal longitudinal de una fibrilla FLS.
SLS colágeno
La mezcla de reacción de 2 mg / ml y ATP ~ 0,5 mg / ml de monómero de colágeno en 100 mM de glicina-HCl a pH 3,3 se dejó a temperatura ambiente durante 2 horas producirá una solución de colágeno SLS.
Típicamente, los cristalitos de SLS no serán visibles bajo un microscopio óptico. Un AFM se requiere para confirmar la presencia de cristalitos de SLS. En un ejemplo típico, un azar de 100 × 100 m 2 análisis por AFM por lo general muestran muchospuntos. Ampliación en un 10 × 10 m 2 scan usualmente mostrarán varios cristalitos SLS (Figura 6a). Y un 2 × 2 m 2 análisis (Figura 6b) muestra la estructura más fina de un cristalito SLS.
Figura 1. Las tres formas estructuralmente diferentes de las fibrillas de colágeno que se pueden formar in vitro a partir de monómero de colágeno. AFM imágenes que representan monómero de colágeno y los tres mayores estructuras de colágeno orden todo en la escala del mismo tamaño (2 x 2 m 2).
Figura 2. Imagen digital en ~ 200 × magnificación por microscopía óptica DIC de fibrillas de colágeno nativas en mica (a) sin tocar y (b) thresholded y afilado to resaltar las fibrillas.
Figura 3. AFM imágenes de fibrillas de colágeno nativo sobre mica. AFM de modo de contacto intermitente imágenes de amplitud se muestra.
Figura 4. (A) 0,5 × 1 m 2 el modo de contacto intermitente AFM imagen de altura (escala vertical = 100 nm) y (b) sección transversal longitudinal de una fibrilla de colágeno nativo.
Figura 5. Imágenes de AFM de fibrillas de colágeno FLS sobre mica. (A) 10 × 10 m 2 Contacto con el modo de imagen desviación AFM, (b) 2 × 2 m 2 Contacto con el modo de imagen AFM y desviación longitudinal (c)sección transversal de una fibrilla de colágeno FLS.
Figura 6. Imágenes de AFM de colágeno SLS sobre mica. AFM de modo de contacto intermitente imágenes de amplitud se muestra.
Discussion
Purificó monómero de colágeno es estable a pH bajo y la temperatura y la formación de fibrillas de colágeno nativas esencialmente consiste en elevar el pH y la temperatura de la solución de monómero de colágeno. Procedimientos para la reconstitución de las fibrillas de colágeno en bandas a partir de monómeros han existido durante más de 50 años. El procedimiento que nuestro laboratorio utilizado en nuestros primeros estudios con colágeno hace 15 años 7 se basa en los procedimientos resumidos por Chapman y colaboradores en 1986 10. Las condiciones para la formación de fibrillas de colágeno en ese trabajo anterior fueron 0,18 mg / ml de monómero de colágeno en Na 2 HPO 4 / KH 2 PO 4 (I = 0,2, pH 7,4) a 34 ° C. El inconveniente de este y otros procedimientos que hemos tratado es que hay fibrillas siempre sin anillo formados junto a las fibrillas deseadas en bandas. Nuestras nuevas condiciones son ~ 0,3 mg / ml de colágeno en monómero de fosfato 100 mM y KCl 100 mM a pH 7 a la izquierda en 37 ° C durante 3-4 horas. El procedimiento descrito en este documento difiere en cada aspecto del procedimiento anterior para la fabricación de fibrillas de colágeno nativas. Pero más notablemente, hemos duplicado la fuerza iónica mediante el aumento de la concentración de tampón y la adición de 100 mM KCl. El incremento en los resultados de la fuerza iónica en la formación más consistente de las fibrillas de colágeno exclusivamente en bandas.
En nuestra experiencia, las únicas veces que este procedimiento no ha producido colágeno tipo nativo fue cuando la solución de monómero de colágeno ya había pasado la fecha recomendada por el fabricante de su uso. Cuando ocurre esto, lo que se observa a partir de los rangos menos fibrillas que están anillados a fibrillas muchos todavía observados pero sin anillo predominantemente. Tenga en cuenta que el monómero de colágeno caducada puede a menudo todavía se utiliza con éxito para producir colágeno nativo, pero cuando falla, monómero de nuevo colágeno sin duda debe ser comprado.
FLS fue identificado por primera vez por Highberger et al. 17 en preparaciones de colágeno acreditado a Orekhovich et al. 18. Otros estudios llevó Highberger y Schmitt a la conclusión de que era α1-glicoproteína ácida que promueve la formación de FLS 12. Nos fueron posteriormente capaz de replicar el procedimiento para la fabricación de colágeno FLS mediante la combinación de monómero de colágeno comercialmente disponibles y α1-glicoproteína ácida a pH bajo y lentamente permitiendo que el pH suba por diálisis de la mezcla frente a agua durante 24 hr 11. Presentamos ahora una modificación de dicho procedimiento por diálisis del colágeno contra monómero de agua primero y simplemente se combina con α1-glicoproteína ácida en agua para formar colágeno FLS. Las condiciones para FLS colágeno conjunto descrito aquí son mucho menos tiempo. El monómero de colágeno todavía tiene que ser pre-dializada contra agua, pero se puede hacer en grandes cantidades y después se almacenó a 4 ° C de forma estable hasta que se usa. Este nuevo procedimiento se produce predominantemente FLS fibrillas de colágeno en bandas.
Desde nuestra experiencia, α1-glucoproteína ácidaproteína con un menor contenido combinado de proteínas y agua, y por inferencia más alto contenido de azúcar, es crítico para el éxito de toma de fibrillas de FLS. Por lo general consulte con el fabricante de que el lote glicoproteína α1-ácido que utilizamos tiene un% combinada contenido de proteína y agua de 82 o menos. Y, como con el procedimiento para la síntesis de colágeno nativo, el monómero de colágeno que es demasiado viejo también puede resultar en la falta de producir colágeno FLS. Además, la pureza del agua utilizada para la diálisis es crítica en este procedimiento. Por ejemplo, la diálisis de monómero de colágeno incluso en contra de ~ 8 MΩ.cm en lugar de> 18 resultados MΩ.cm agua en una solución de colágeno que no se formará colágeno FLS.
De los tres tipos de colágeno fibrilar, lo más fácil de hacer es el colágeno SLS. La primera preparación de SLS fue descrito por Schmitt y colaboradores-15. Hemos publicado una adaptación de este procedimiento hace 12 años para la fabricación de colágeno SLS utilizando coll disponible en el mercadoAgen 14. El procedimiento consistía simplemente en la combinación de 2 mg / ml ATP y 0,5 mg / ml de monómero de colágeno en 0,05% (v / v) de ácido acético a pH 3,5, y dejando la mezcla a temperatura ambiente durante la noche.
En nuestra experiencia, el aspecto crítico del conjunto de SLS que debe ser controlado es el pH de la solución de reacción. SLS montada en condiciones más básicas (pH ~ 3.6 a 3.9) resulta en grupos agregados de cristalitos. Condiciones ácidas (pH 2.9 a 3.2 ~) resulta en cristales más finos, más separados que los reunidos en las condiciones ideales de pH 3.3-3.5. PH de reacción fuera de este rango (<2,8 y> 4) no producen ningún colágeno SLS. En el pasado, se ajustó el pH de la mezcla de reacción mediante la adición de ácido acético. Para simplificar el procedimiento aún más, en este manuscrito se introduce un tampón de glicina-HCl para controlar el pH.
Las tres estructuras diferentes de colágeno formadas a partir de los protocolos descritos anteriormente tienen caráctercaracterísticas realistas que sólo se puede discernir por instrumentos capaces de resolución nanométrica. Colágeno nativo y FLS se caracterizan por bandas periodicidades de ~ 67 nm y ~ 270 nm. La dimensión más larga de colágeno SLS es sólo ~ 360 nm. Hemos descrito específicamente cómo utilizar un AFM para caracterizar las tres estructuras diferentes de colágeno. Sin embargo, cualquier operación AFM en modo de contacto o contacto intermitente con cualquier sonda AFM que tiene <10 nm radio también debe ser capaz de imagen de estas estructuras de colágeno. Además, la microscopía electrónica puede ser y ha sido utilizado para caracterizar estas estructuras de colágeno 19.
La principal ventaja de estos procedimientos es que producen predominantemente el colágeno deseado construir. La única otra forma de colágeno que se encuentra en estas reacciones es el monómero de partida, que es a menudo visible en el fondo de las imágenes de AFM. En el caso del colágeno nativo y FLS, que puede ser fácilmente separada de la mayor parte de la unreamonómero CTED por centrifugación repetida y lavado de la nativo resultante o FLS colágeno precipitado con agua.
Hemos presentado procedimientos simples y fiables para la fabricación de FLS nativos, y el colágeno SLS utilizando materiales avanzados, la partida comercialmente disponibles. El monómero de colágeno utilizado en todos estos procedimientos se encuentra comercialmente disponible en una forma purificada. α1-glicoproteína ácida y ATP también son ambos disponibles comercialmente.
Disclosures
No hay conflictos de interés declarado.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias a todos los pasado muchos estudiantes de pregrado, postgrado y postdoctorado que han contribuido con su tiempo y esfuerzo al estudio de la fibrogénesis colágeno en nuestro laboratorio. Las Ciencias Naturales e Ingeniería de Investigación de Canadá ha proporcionado fondos para continuamente nuestros estudios de colágeno.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Type I collagen monomer (~3 mg/ml in 0.01 N HCl) |
Inamed Advanced Biomatrix |
5409 5005-B |
Lot 1261443 (2.9 mg/ml, pH 2.1) Lot 1629346 (3.2 mg/ml, pH 2.1) Lot 6006 (3.2 mg/ml, pH 2.1) |
| ATP | Research Biochemicals International | A-141 | Lot FBJ-1194A |
| α1-acid glycoprotein from bovine plasma | Sigma-Aldrich | G3643 | Lot 051K7440 (89.8%) Lot 011K7410 (82%) Lot 065K7405 (71.2%) Lot 063K7495 (71.9%) Lot 117K7535 (75.9%) (protein + water content) |
| a1-acid glycoprotein from human plasma | Sigma-Aldrich | G9885 | Lot 128H7606 (70.9%) Lot 049K7565V (68%) (protein + water content) |
| mica | Ted Pella | 53 | |
| Pointprobe - Silicon SPM-Sensor | Nanoworld | NHC | Silicon AFM probe that we use for intermittent contact mode |
| Veeco Nanoprobe Tips | Veeco (now Bruker AFM probes) |
NP-S | Silicon nitride AFM probe that we use for contact mode |
References
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