Summary
Uma técnica experimental para o tratamento de defeitos osteocondrais na articulação do joelho do coelho é descrito. A implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para defeitos osteocondrais proporciona um desenvolvimento promissor no campo da engenharia de tecidos. A preparação de fibrina de célula-coágulos
Protocol
A. Preparação de um coelho de Doadores para o isolamento de células tronco mesenquimais (Room Cirurgia)
- As células são isoladas Nova Zelândia Branco (NZW) coelhos machos em idade de 4 meses e cerca de 3 kg de peso corporal.
- Induzir a anestesia de propofol (10 mg / kg de peso corporal iv) e sacrificam com pentobarbital de sódio (100 mg / kg de peso corporal iv).
- Barbear pele de membros posteriores, costas e barriga com um cortador elétrico e aspirar o pêlo.
- Desinfectar a área raspada cuidadosamente com etanol a 70%.
- Use uma pinça sem corte, tesouras afiadas (ou bisturi) e cortadores de ossos para o tecido e ligamentos.
- Faça uma incisão ao longo da superfície craniana da perna e panturrilha.
- Refletir pele e tecido subcutâneo por qualquer dissecção cortante ou contundente.
- Músculos separados e ligamentos de tíbia e fêmur. Mantenha cortes tão perto do osso possível para fazer uma dissecação limpa. Não separe fêmur da tíbia neste momento.
- Corte through da articulação do quadril para separar a cabeça do fêmur do acetábulo.
- Eleve o complexo tíbio-femoral.
- Use a lâmina de bisturi para raspar qualquer tecido mole restante dos ossos ou esfregar os ossos com tecidos de pano estéreis. Neste ponto, do fémur e da tíbia ainda estão ligados.
- Remover patela por corte, em seguida, corte os ligamentos da articulação do joelho para ossos separados, finalmente.
- Spray de ossos separados com etanol a 70%, deixar secar ao ar e colocar cada osso para um tubo de centrífuga de 50 ml com meio de cultura celular (DMEM + 1% de penicilina / estreptomicina (pen / estrep)) para mantê-los húmidos.
- Agora mude em uma cultura de células capela de fluxo laminar estéril.
B. Flushing de Coelho MSC a partir de ossos e Expansão (Cultura capa de celular)
- Recolher os ossos a partir de tubos e colocá-los em 150 pratos mm usando uma pinça estéril.
- Retire duas extremidades ósseas com uma serra estéril e peças mudar para Nova milímetros pratos 150.
- Encha uma seringa de 10 ml com medium (DMEM), coloque uma agulha de calibre 18 e inserir na abertura da medula óssea.
- Em seguida, enxágüe cavidade medular com meio para liberar a medula óssea para o prato. Depois, enxaguar partir da outra extremidade, se possível. Se necessário, viu fora mais das extremidades. Se o osso deve quebrar, basta lavar o interior do osso.
- Aspirar o meio de suspensão de células para dentro da seringa e enxaguar a medula óssea repetidamente até que a suspensão é de flutuação livre, através da cavidade da medula óssea e não mais de medula óssea coágulos aparecer.
- Uma vez que a medula óssea foi coletada a partir de todos os ossos, romper os aglomerados de medula, passando por uma agulha de calibre 18: encher a seringa com agulha acoplada e forçar a saída em média.
- Em seguida, filtrar a suspensão através de um filtro de células num tubo de 50 ml. A fim de evitar a perda de células, lava prato de cultura 2x com 10 ml de meio e filtrar bem.
- Centrifugar a suspensão a 500 xg durante 5 min à TA.
- Remover o sobrenadante e ressuspender célula pellet em 10 ml de meio (DMEM + 1% de Pen / Strep).
- Células do sangue em separado do sangue células mononucleares periféricas (PBMC) e células-tronco mesenquimais (MSC) usando uma solução de separação Biocoll.
- Encha 5 ml de solução de separação Biocoll num tubo de 15 ml e adiciona cuidadosamente 5 ml de suspensão de células no topo e centrifugar a 800 xg durante 20 min à temperatura ambiente (sem travagem).
- Resultados possíveis veja a Figura 1: Sendo mais denso que Biocoll, as células vermelhas do sangue de sedimentos para o fundo, enquanto as células-tronco mesenquimais de PBMC e permanecer na interface.
- Retire cuidadosamente da interface em um tubo de 15 ml e lavar com 5 ml PBS.
- Centrifugar como descrito no passo 22, ressuspender em 5 ml de PBS e repetir 2-3x.
- Depois, centrifugar novamente a 350 xg durante 10 min à temperatura ambiente (com travão).
- Ressuspender em 10 ml de meio e contagem de células num hemocitómetro.
- As células em placas a uma densidade de sementeira inicial de aproximadamente 5 x 10 6 em 150 milímetros pratos.
- Depois de 2-3 dias, remover as células não aderentes. Pode ser necessário enxaguar com PBS primeiro, a fim de remover os detritos celulares. Adicionar meio completo fresco (DMEM + 10% de soro fetal de vitelo (FCS) + 1% de Pen / Strep) depois.
- Alimentar as células a cada 3-4 dias (Figura 2).
- Depois de 5-10 dias, as células de passagem para a primeira vez.
C. Preparação de coágulos de fibrina in vitro
- No dia da implantação, as células aderentes libertar a partir de frascos / pratos por 3 minutos de exposição a 0,25% de tripsina-EDTA. Parar a tripsinização adicionando meio completo.
- Distribua as células em um tubo de 50 ml falcon e lavá-los duas vezes com PBS.
- Determinar a viabilidade celular e os números de tripan coloração azul.
- Adicionar 50.000 células / tubo de microcentrífuga e recolher pelotas por centrifugação a 500 xg durante 5 min à TA. Prepare um mastermix para pelo menos mais um coágulo, conforme necessário.
- Ressuspender o sedimento celular em 17 ul de PBS e 25 ul de misturar o componente de fibrinogénio TISSUCOL-17 Kit com esta suspensão MSC mL.
- Aqui uma placa estéril com orifícios pré-perfurados (3x3.6 mm) de acordo com os furos in vivo (Figura 3).
- Primeiro, inocular 4 ul solução de trombina (500 UI / ml) para um orifício, seguida pela adição imediata de 42 ul de fibrinogénio à suspensão de células e novamente 4 ul de solução de trombina de topo. Não misturar a suspensão para evitar a coagulação na ponta da pipeta. Em primeiro lugar, o volume de 50 ul da pipetado fibrinogénio células suspensão irá sobressair o aro dos orifícios pré-perfurados, sem fusão, devido à tensão superficial. No entanto, depois de concluída a coagulação (após 60 min), o coágulo é contrair e se encaixa no furo pré-furado.
- Remover o coágulo com cuidado usando uma pinça sem corte e coloque em um tubo de microcentrífuga com PBS. Preparar dois coágulos / animal.
- Pegue os coágulos para a sala de cirurgia.
D. Implantação de alogênico Células-Tronco Mesenquimais em coágulos de fibrina
- Para induzir a anestesia de coelho (NZW, macho, 3,5-4,0 kg de peso corporal, de 5-6 meses de idade) por injecção intravenosa de propofol (10 mg / kg de peso corporal).
- Raspar o joelho a ser operado com um cortador elétrico e vácuo da pele. Todos os procedimentos nomeados antes são realizados em uma sala de preparação de uma cirurgia para evitar a contaminação do ambiente estéril da sala de cirurgia.
- Após entubação, manter a anestesia com 1,5 mg / kg / min de propofol e de 0,05 mg / kg / min de fentanil intravenosamente. Monitorar anestesia usando capnografia, oximetria de pulso e freqüência cardíaca.
- Desinfetar o joelho completamente raspada e cobrir o resto do coelho com uma compressa esterilizada.
- Palpar a patela e realizar uma incisão medial à patela.
- Abrir a articulação do joelho por uma artrotomia parapatelar média sob condições estéreis. Evite cortar qualquer pequenos vasos sanguíneos superficiais.
- Deslocar lateralmente a patela (Figura 4).
- Depois de inspecção da articulação do joelho por quaisquer lesões de cartilagem concomitantes ou anomalias articulares, criar dois defeitos osteocondrais (3 mm de profundidade, figura em forma de oito), no sulco troclear com um ar furadeira operacional estéril (3,6 milímetros de diâmetro) com um dispositivo de paragem (Figura 5).
- Limpe os defeitos e lavá-los com soro fisiológico estéril.
- Antes da implantação, encher 20 ul de cola de fibrina para os defeitos e distribuí-las uniformemente sobre o fundo do defeito.
- Em seguida, implantar os coágulos press-montado na figura defeito em forma de oito.
- Após a coagulação, mudar a patela no sulco troclear e dobrar e esticar o joelho algumas vezes.
- Deslocar a patela lateralmente mais uma vez e verificar se células-coágulos de fibrinogênio ainda estão no local.
- Substitua a patela novamente e terminar a operação com o fechamento da ferida em camadas com suturas um único botão (4-0 Vicryl) e uma sutura cutânea contínua (4-0 Monocryl) (ambos com fio absorvívelde material).
- Finalmente, selar a ferida com um spray de limpeza permeável ao vapor de água.
- Para os cuidados pós-operatórios, a ferida é verificada por dia durante 7 dias. Os coelhos recebem por analgesia pós-operatória Carprofeno 4 mg / kg sc a cada 24 h (durante 4 dias) e buprenorfina 0,03 mg / kg sc a cada 12 h (durante 2,5 dias). A estabilização do joelho (por exemplo, limpeza) não é necessária.
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Representative Results
A técnica cirúrgica descrita permite o isolamento e implantação de células estaminais mesenquimais alogénicas para um defeito osteocondral artificial. A configuração experimental resultou em uma integração bem sucedida do implante na cartilagem ao redor.
O defeito foi cheio com tecido de reparação com propriedades biomecânicas semelhantes e durabilidade semelhantes em comparação com a cartilagem circundante. A fibrina dos coágulos de células foi preparado in vitro sobre uma placa estéril com orifícios pré-perfurados, que tinham o mesmo tamanho do defeito osteocondral (Figura 3). Como resultado, não havia fissuras entre o coágulo de fibrina e implantado cartilagem ao redor, o que seria um factor de risco para a degeneração prematura ou delaminação (Figura 6). Uma cura basal do tecido de reparação foi assegurada porque o osso subcondral foi penetrado e, portanto, funciona contra cisalhamento. Outro aspecto importante foi a stiffness do tecido de reparação, que deve coincidir com o tecido de cartilagem saudável circundante para evitar um aumento da carga sobre ela e uma possível degeneração prematura. Nas nossas experiências preliminares (dados não mostrados), mostraram que, após 12 semanas, a uma rigidez suficiente já poderia ser alcançado. Além disso, uma superfície intacta e homogénea do transplante foi encontrado, o que reduziu tensão de cisalhamento e possíveis danos do implante (Figura 6).
Figura 1. Separação de células do sangue e de plasma de PBMCs e MSCs usando Biocoll Solution separar.
Figura 2. Monocamada de células-tronco mesenquimais (Nova Zelândia Branco coelho) após 5 dias em cultura.
Figura 3. Placa estéril com furos pré-perfurados (3x3.6 mm) no topo está sendo preenchido com um fibrina de célula-coágulo.
Figura 4. Inaugurado articulação do joelho após artrotomia patelar medial.
Figura 5. Defeitos osteocondrais (3 mm de espessura, 3 mm de diâmetro, figura em forma de oito) na ranhura troclear.
Figura 6. Inaugurado articulação do joelho 12 semanas após a implantação de duas células-coágulos de fibrina em dois defeitos osteocondrais perfurados.
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Discussion
Nos últimos anos, a possibilidade de tratar complexos articulares defeitos osteocondrais - tais como os resultantes de osteocondrite dissecante, osteonecrose e trauma - com abordagens de engenharia de tecidos tornou-se mais e mais atraente. Nas entidades patológicas mencionadas anteriormente, danos no tecido se estende para o osso subcondral e envolve dois tecidos caracterizados por diferentes capacidades intrínsecas de cura 1. Há um interesse crescente no papel do osso subcondral para os processos patogénicos de dano articular osteocondral 11,23. As condições funcionais da cartilagem articular e do seu osso de suporte estão intimamente ligados. Lesões de tecido ou afectar negativamente o meio mecânico, bem como o equilíbrio homeostático da totalidade do conjunto 24. Alterações na unidade osteocondral por meio de ruptura mecânica de movimento articular, formação do corpo solto, desgaste mecânico no compartimento envolvido e atrito desuperfícies opostas podem levar a um início mais precoce e desenvolvimento de osteoartrite 1,11. Portanto, as aproximações de engenharia de tecidos para a regeneração de defeitos osteocondrais deve ser acompanhada por uma adequada restauração do osso subcondral subjacente, a fim de reforçar a união efectiva com os tecidos do hospedeiro circundante 2. Células-tronco mesenquimais parece ser uma fonte de células ideal para fornecer esses requisitos específicos de reparo osteocondral. O protocolo destaca a promoção da restauração do tecido do osso e cartilagem, potencialmente induzir a diferenciação selectiva das células estaminais mesenquimais transplantados em linhagens osteogénicas e condrogénica.
Em comparação com os condrócitos, as células estaminais mesenquimais, têm várias vantagens importantes: eles podem ser facilmente isoladas a partir de medula óssea e do tecido adiposo synovialis sem qualquer maior morbidade lado dador. As células estaminais mesenquimais não diferenciam durante expansão in vitro eportanto, podem ser expandidas em cultura para o tratamento de um grande número de defeitos da cartilagem articular grandes. Além disso, eles parecem ser imunossupressora e - em resposta a estímulos apropriados - podem diferenciar em condrócitos e osteócitos 25,26. Outra vantagem notável de células estaminais mesenquimais exibe sua hypoimmunity, o que significa que as células estaminais mesenquimais alogénicas podem ser utilizadas, sem qualquer sinal da reacção de rejeição 27. Portanto, um pool de células a partir de um ou dois animais dadores podem ser suficientes para todos os experimentos. Isto reduz o tempo de funcionamento e dano adicional aos animais.
Vários experimentos mostraram resultados promissores utilizando cola de fibrina para o reparo osteocondral 19,20. Normalmente, a inoculação do fibrinogénio à suspensão de células com uma solução de trombina tem sido descrito como um procedimento feito in situ, directamente nas lesões osteocondrais artificiais. Após um curto período de tempo de pré-coagulação (após alguns minutos) A operação é geralmente concluído até mudar a patela e fechamento da ferida.
Em vários testes-piloto, descobrimos que suficiente para a coagulação da fibrina de célula-suspensão que leva mais de 60 minutos In situ -. Durante a operação - que dificilmente é possível esperar mais de 60 min para toda a coagulação. Além disso, através da utilização de um prato com buracos de estéril pré-perfurados simulando as lesões osteocondrais, foi possível demonstrar que a quantidade de cola de fibrina, o qual foi utilizado para preencher completamente o defeito, obviamente, não foi suficiente, devido ao encolhimento do coágulo endurecimento . Isto requer um maior volume de cola de fibrina com antecedência, a fim de atingir um enchimento congruente e completa do defeito. Realizando a preparação do coágulo, in vitro, é possível ajustar facilmente a forma construto para o tamanho apropriado do defeito perfurado e portanto, encher o defeito osteocondral totalmente e de forma congruente.
Além disso, umn na preparação in vitro de células dos coágulos impede uma fuga do adesivo, mas (depois de apenas alguns minutos) não completamente endurecido fibrina de célula-suspensão. Portanto, pode-se garantir que o volume inicialmente prevista vai ficar no defeito e começará com a integração da cartilagem ea remodelação.
A técnica descrita permite um método normalizado para a pesquisa de células estaminais experimental no campo da reparação osteocondral. O protocolo fornece uma maneira reprodutível para isolar células-tronco mesenquimais, a fim de re-implantar-los mais tarde em defeitos osteocondrais cartilagem da articulação do joelho do coelho. Condrócitos autólogos já foram implantadas em defeitos osteocondrais de fibrina num modelo de célula-19. Utilizando um modelo in-vitro de preparação de coágulo, bem como células estaminais mesenquimatosas, em vez de condrócitos parece ser uma abordagem nova e mais vantajosa promissor para a remodelação e reparação de lesões osteocondrais.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este projeto foi financiado pela Associação Alemã de Pesquisa (concessão HE 4578/3-1) e parcialmente pelo FP7 UE-Project "GAMBA" NMP3-SL-2010-245993.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
References
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