Summary
En eksperimentel teknik til behandling af osteochondrale defekter i kaninens knæled beskrives. Implantation af allogene mesenkymale stamceller i osteochondrale defekter giver en lovende udvikling inden for tissue engineering. Fremstillingen af fibrin-celle-blodpropper
Abstract
Behandlingen af osteochondrale artikulær fejl har været en udfordring læger i mange år. En bedre forståelse af samspillet mellem ledbrusk og subchondral knogle i de senere år ført til en øget opmærksomhed på restaurering af hele osteochondralt enheden. I forhold til chondral læsioner regenerering af osteochondrale defekter er langt mere kompleks og et langt større kirurgisk og terapeutisk udfordring. Det beskadigede væv omfatter ikke kun den overfladiske brusk lag, men også den subchondral knogle. For dyb, osteochondralt skader, som det forekommer for eksempel med osteochondrose dissecans den fulde tykkelse af defekten skal udskiftes for at genoprette den fælles overflade 1. Kvalificerede terapeutiske procedurer nødt til at overveje disse to forskellige væv med deres forskellige iboende helbredende potentiale 2.. I de seneste årtier har flere kirurgiske behandlingsmuligheder opstået og har allerede blevet klinisk etableret 3 -6..
Autologe eller allogene osteochondrale transplantater består af ledbrusken og subchondral knogle og tillade udskiftning af hele osteochondralt enhed. Manglerne er fyldt med cylindriske osteochondrale podninger, der har til formål at give en kongruent hyalinbrusk dækket flade 3,7,8. Ulemperne er den begrænsede mængde af tilgængelige poder, donor site morbiditet (for autologe transplantationer), og inkongruens af overfladen og derved anvendelsen af denne metode er særligt begrænset til store defekter.
Nye tilgange inden for tissue engineering åbnet lovende muligheder for regenerativ osteochondral terapi. Implantation af autologe chondrocytter markerede den første celle baseret biologisk metode til behandling af fuld tykkelse brusklæsioner og er nu på verdensplan etableret med gode kliniske resultater, selv 10 og 20 år efter implantation 9,10. Men date, denne teknik er ikke egnet til behandling af alle typer af læsioner, såsom dybe defekter involverer subchondral knogle 11..
Sandwich-teknik kombinerer knogletransplantation med nuværende tilgange i Tissue Engineering 5,6. Denne kombination synes at være i stand til at overvinde de begrænsninger, set i osteochondrale transplantater alene. Efter autolog knogletransplantation til subchondral defekt område, er en membran podes med autologe chondrocytter sutureres ovenfor og letter at matche topologi af implantatet med den beskadigede sted. Selvfølgelig skal den tidligere knoglerekonstruktion ekstra kirurgisk tid og ofte endda en ekstra operation. Hertil kommer, at dato er langsigtede data mangler 12.
Tissue Engineering uden yderligere knogletransplantation formål at genoprette den komplekse struktur og egenskaber af nativ ledbrusk ved chondrogen og osteogene potentiale af de transplanterede celler. However, igen, er det normalt kun brusk væv, der er mere eller mindre regenereres. Yderligere osteochondral skade har brug for en specifik yderligere behandling. For at opnå en regenerering af flerlagsstruktur af osteochondrale defekter, tredimensionale manipuleret væv podet med autologe / allogene celler kan give en god regenerationskapacitet 11.
Udover autologe chondrocytter, synes mesenkymale stamceller (MSC) for at være et attraktivt alternativ til udvikling af en fuld tykkelse bruskvæv. I talrige prækliniske in vitro og in vivo studier har mesenkymale stamceller viste fremragende vævsregeneration potentiale 13,14. Den vigtigste fordel ved mesenkymale stamceller især til behandling af osteochondrale defekter er, at de har kapacitet til at differentiere i osteocytter samt chondrocytter. Derfor er de potentielt give et flerlaget revitalisering af dindvirket.
I de senere år har flere stilladser med osteochondral regenerativ potentiale derfor blevet udviklet og evalueret med lovende foreløbige resultater 1,15-18. Endvidere fibrinklæber som en celle bærer blev en af de foretrukne teknikker i eksperimentel brusk reparation og er allerede med held blevet anvendt i adskillige dyrestudier 19-21 og endda første menneskelige forsøg 22.
Følgende protokol vil demonstrere en eksperimentel teknik til isolering af mesenkymale stamceller fra en kanin knoglemarv, til efterfølgende proliferation i cellekultur og til fremstilling af en standardiseret in vitro-model for fibrin-Cell-blodpropper. Endelig vil en teknik til implantering af forud fastsatte fibrin-celle-blodpropper i kunstige osteochondrale defekter i kaninens knæled blive beskrevet.
Protocol
A. Fremstilling af en Donor Kanin til isolering af mesenchymale stamceller (Surgery Room)
- Celler isoleret fra mandlige New Zealand White (NZW) kaniner ved 4 måneders alderen og cirka 3 kg legemsvægt.
- Narkosen af propofol (10 mg / kg legemsvægt iv), og ofre med natriumpentobarbital (100 mg / kg legemsvægt iv).
- Shave skind fra bagbenene, ryg og mave med en elektrisk Clipper og støvsuge pels.
- Desinficere det barberede område grundigt med 70% ethanol.
- Brug stumpe pincet, skarpe sakse (eller skalpel) og knogler kuttere for vævs-og ledbånd.
- Lave et snit langs den kraniale overflade af benet og kalv.
- Reflect hud og subkutane væv ved enten skarp eller stump dissektion.
- Separate muskler og ledbånd fra skinneben og lårben. Hold nedskæringer så tæt til benet som muligt at gøre en ren dissektion. Må ikke adskille lårben fra skinnebenet på dette tidspunkt.
- Skær thrdybdegående hofteleddet at adskille lederen af lårbenet fra hofteskålen.
- Hæve tibial-femorale kompleks.
- Brug skalpelblad at skrabe eventuelt resterende blødt væv fra knoglerne eller gnid knoglerne med sterile klud væv. På dette tidspunkt er lårben og skinneben stadig er tilsluttet.
- Fjern patella ved skæring, derefter skæres knæleddet ledbånd til at adskille knogler endelig.
- Spray separeret knogler med 70% ethanol, lad lufttørre og placere hver knogle i et 50 ml centrifugerør med celledyrkningsmedium (DMEM + 1% penicillin / streptomycin (Pen / Strep)) for at holde dem fugtige.
- Nu skifter under en steril cellekultur laminar flow hætte.
B. Flushing af kanin MSC fra Bones og ekspansion (Cell Culture Hood)
- Saml knogler fra rør og placere dem i 150 mm skåle ved hjælp af steril pincet.
- Fjern begge ben slutter med en steril sav og flytte brikker til nye 150 mm skåle.
- Fyld en 10 ml sprøjte med medium (DMEM), vedhæfte en 18 gauge nål og indsætte i åbningen af knoglemarven.
- Derefter skylles marvhuleareal med medium til at skylle knoglemarven i skålen. Bagefter skylles fra den anden ende, hvis det er muligt. Hvis det er nødvendigt, save mere fra enderne. Hvis knogle skulle bryde, bare skylles indersiden af knoglen.
- Aspirer cellemedium suspensionen i sprøjten og skyl knoglemarven indtil suspensionen er frit flydende gennem knoglemarven hulrum og ingen yderligere knoglemarven blodpropper vises.
- Når knoglemarv er blevet indsamlet fra alle knogler, forstyrre marv klumper ved at passere gennem en 18 gauge kanyle: Fyld sprøjten med påsat nål og tvinge ud i medium.
- Bagefter foretage suspensionen gennem en celle filter i et 50 ml rør. For at forhindre celletab, vask dyrkningsskål 2x med 10 ml medium og filtrere så godt.
- Centrifuger suspensionen ved 500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur.
- Fjern supernatanten og resuspender celle pellet i 10 ml medium (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Separate blodceller fra perifert blod mononukleære celler (PBMC) og mesenchymale stamceller (MSC) ved hjælp af en Biocoll Adskillelse Solution.
- Fyld 5 ml Biocoll Adskillelse opløsning i en 15 ml rør og forsigtigt tilsættes 5 ml af celle-suspensionen på toppen og der centrifugeres ved 800 xg i 20 minutter ved stuetemperatur (uden bremse).
- Mulige resultater se figur 1: Bliver tættere end Biocoll, røde blodlegemer sediment op til bunden, mens PBMC og mesenchymale stamceller forbliver ved grænsefladen.
- Fjern forsigtigt grænseflade i et 15 ml rør og vaskes med 5 ml PBS.
- Centrifugeres som beskrevet i trin 22, resuspender i 5 ml PBS og gentag 2-3x.
- Derefter centrifugeres igen ved 350 xg i 10 minutter ved stuetemperatur (med bremse).
- Resuspender i 10 ml medium og tælle celler i et hæmocytometer.
- Plate celler ved en indledende podningstæthed på cirka 5 x 10 6 i 150 mm skåle.
- Efter 2-3 dage, reflytte ikke-adhærente celler. Du har måske til at skylle med PBS først for at fjerne celle debris. Tilføj frisk komplet medium (DMEM + 10% føtalt kalveserum (FCS) + 1% Pen / Strep) bagefter.
- Feed celler hver 3-4 dage (figur 2).
- Efter 5-10 dage, passage cellerne for første gang.
C. Fremstilling af fibrinkoagulater in vitro
- På dagen for implantation, frigive vedhæftende celler fra kolber / tallerkener med en 3 min eksponering til 0,25% trypsin-EDTA. Stop trypsinbehandling ved tilsætning komplet medium.
- Distribuere celler i en 50 ml Falcon-rør og vaskes to gange med PBS.
- Bestemme cellelevedygtighed og tal ved trypanblåt-farvning.
- Tilføj 50.000 celler / mikrocentrifugerør og indsamle pellets ved centrifugering ved 500 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Forbered en Mastermixen for mindst én mere blodprop efter behov.
- Resuspender cellepelleten i 17 pi PBS og bland 25 ul af fibrinogenkomponent af tissuCOL-kit med denne 17 pi MSC suspension.
- Tag en steril plade med forborede huller (3x3.6 mm) i overensstemmelse med borehullerne in vivo (figur 3).
- Først pode 4 pi thrombinopløsning (500 IE / ml) i et hul, efterfulgt af øjeblikkelig tilsætning af 42 pi fibrinogen-celle-suspension og igen 4 pi thrombinopløsning på toppen. Bland ikke suspensionen for at undgå koagulation i pipettespidsen. Først vil 50 gl volumen af pipetterede fibrinogen-celle-suspensionen rage kanten af de forborede huller uden at smelte på grund af overfladespændingen. Men efter fuldstændig koagulation (efter 60 min) koagel kontraherende og passer ind i den præ-borede hul.
- Fjern blodprop omhyggeligt ved hjælp af en stump pincet og anbringes i et mikrocentrifugerør med PBS. Forbered 2 blodpropper / dyr.
- Tag blodpropper kirurgi rum.
D. Implantation af allogene mesenchymstamceller i fibrinkoagulater
- Narkosen til kanin (NZW, mandlig, 3,5-4,0 kg legemsvægt, 5-6 måneder gamle) ved intravenøs injektion af propofol (10 mg / kg legemsvægt).
- Shave knæet skal opereres med en elektrisk clipper og vakuum pels. Alle de procedurer nævnt før udføres i en operation præparat plads til at undgå forurening af sterilt miljø operationsstuen.
- Efter intubation, opretholde anæstesi med 1,5 mg / kg / min propofol og 0,05 mg / kg / min fentanyl intravenøst. Overvåg anæstesi ved hjælp kapnografi, pulsoximetri og puls.
- Desinficere barberet knæ grundigt og dækker resten af kanin med en steril forbinding.
- Palpere knæskallen og udføre en hud incision medialt for knæskallen.
- Åbn knæleddet ved en medial parapatellar arthrotomi under sterile betingelser. Prøv at undgå at skære alle små overfladiske blodkar.
- Fortrænge knæskallen lateralt (Figur 4).
- Efter inspeIndsatsen af knæleddet for eventuelle samtidige brusk læsioner eller fælles anomalier, skal du oprette to osteochondrale defekter (3 mm dyb, figur otte-formet) i trochlearille med steril luft opererer boremaskine (3,6 mm i diameter) med en stop-enhed (figur 5).
- Rengør de fejl og skyl dem med sterilt saltvand.
- Forud for implantation fylde 20 ul fibrinklæber i defekterne og distribuere dem jævnt på bunden af defekten.
- Derefter implantere blodpropper prespasset ind ottetal-formede defekt.
- Efter koagulation, flyt patella inden trochlearille og bøje og strække knæet et par gange.
- Fortrænge patella lateralt igen, og kontrollere, om fibrinogen-celle-blodpropper er stadig på plads.
- Udskift patella igen og afslutte operationen med sårlukning i lag med en enkelt knap suturer (4-0 Vicryl) og en kontinuerlig kutan sutur (4-0 Monocryl) (begge med resorberbar suturmateriale).
- Endelig forsegle såret med en spray dressing gennemtrængelig for vanddamp.
- For postoperativ pleje, er såret kontrolleres dagligt i 7 dage. Kaninerne modtager for postoperativ analgesi Carprofen 4 mg / kg sc hver 24 timer (4 dage) og buprenorphin 0,03 mg / kg sc hver 12 timer (i 2,5 dage). En stabilisering af knæet (f.eks forbinding) er ikke nødvendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den beskrevne kirurgisk teknik tillader en vellykket isolering og implantation af allogene mesenkymale stamceller i en kunstig osteochondralt defekt. Forsøgsopstillingen resulterede i en vellykket integration af implantatet ind i den omgivende brusk.
Defekten blev fyldt med helingsvæv med lignende biomekaniske egenskaber og lignende holdbarhed sammenlignet med den omgivende brusk. Fibrin-celle-klump blev fremstillet in vitro på en steril plade med forborede huller, der havde den samme størrelse som den osteochondrale defekt (figur 3). Som en følge heraf var der ingen kløfter mellem den implanterede fibrinkoagulat og den omgivende brusk, hvilket ville være en risikofaktor for tidlig degeneration eller delaminering (figur 6). En basal heling af helingsvæv blev sikret, fordi subchondral knogle blev trængt, og derfor arbejdede mod et klipning. Et andet vigtigt aspekt var Stiffness af helingsvæv, bør der svarer til den raske omgivende bruskvæv at undgå en øget belastning på det og en eventuel tidlig degeneration. I vores foreløbige eksperimenter (data ikke vist) viste vi, at efter 12 ugers en tilstrækkelig stivhed allerede kunne opnås. Endvidere blev et intakt og homogen overflade af transplantatet fundet, hvilket reducerede forskydningsspænding og eventuel implantat skader (figur 6).
Figur 1. Adskillelse af blodceller og plasma fra PBMC'er og MSC hjælp Biocoll Adskillelse Solution.
Figur 2. Monolag af mesenkymale stamceller (New Zealand White kanin) efter 5 dage i kultur.
Figur 3. Sterile plade med forborede huller (3x3.6 mm) den øverste ene er fyldt med en fibrin-celle-størkne.
Figur 4.. Åbnet knæled efter mediale parapatellar artrotomi.
Figur 5. Osteochondrale defekter (3 mm dyb, 3 mm i diameter, ottetals-formet) i trochlearille.
Figur 6.. Åbnede knæled 12 uger efter implantation af to fibrin-Cell-blodpropper i to borede osteochondrale defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I de seneste år, muligheden for at behandle komplekse artikulær osteochondrale defekter - blev med Tissue Engineering tilgange mere og mere attraktiv - såsom dem, der skyldes osteochondritis dissecans, osteonekrose og traumer. I de tidligere nævnte patologiske enheder, udvider vævsskader subchondral knogle og involverer to væv er kendetegnet ved forskellige iboende helbredende kapacitet 1.. Der er en stigende interesse i rollen som subchondral knogle for patogene processer osteochondral artikulær skade 11,23. De funktionelle betingelser for ledbrusk og dens understøttende knogle er tæt forbundet. Skader af begge væv påvirke den mekaniske miljø samt den homeostatiske balance af hele samlingen 24. Ændringer i osteochondrale enhed gennem mekanisk forstyrrelse af fælles beslutningsforslag, løs krop dannelse, mekanisk slid i de involverede rum og nedslidning afmodstående overflader kan føre til en hurtigere indsættende og udvikling af slidgigt 1,11. Derfor bør vævsteknologiske metoder til regenerering af osteochondrale defekter være ledsaget af en passende restaurering af den underliggende subchondral knogle med henblik på at fremme en effektiv union med omgivende værtsvævene 2.. Mesenkymale stamceller synes at være en ideel celle kilde til at levere disse særlige krav osteochondrale reparation. Protokollen fremhæver fremme af knogle-og bruskvæv restaurering af potentielt inducere den selektive differentiering af de transplanterede mesenkymale stamceller i osteogene og chondrogene afstamninger.
I forhold til chondrocytter, har mesenkymale stamceller flere store fordele: de kan let isoleres fra knoglemarv, synovialis og fedtvæv uden nogen større donorsiden sygelighed. Mesenkymale stamceller ikke differentiere under in vitro ekspansion ogDerfor kan kulturen-udvidet i stort tal for at behandle store ledbrusken defekter. Desuden synes de at være immunosuppressive og - som svar på passende stimuli - kan differentiere til chondrocytter og osteocyter 25,26. En anden bemærkelsesværdig fordel af mesenkymale stamceller viser deres hypoimmunity, hvilket betyder, at allogene mesenkymale stamceller kan anvendes uden nogen tegn på afstødning reaktion 27.. Derfor kan en celle-pulje fra en eller to donordyr være tilstrækkeligt for alle eksperimenter. Dette reducerer driftstid og yderligere skade på dyrene.
Adskillige forsøg viste lovende resultater ved hjælp af fibrinklæber til osteochondral reparation 19,20. Normalt har podning af fibrinogen-celle-suspension med thrombinopløsning blevet beskrevet som en fremgangsmåde udført in situ direkte i de kunstige osteochondral læsioner. Efter en kort periode af præ-koagulation (efter et par minutter) Operationen er normalt færdig ved flytning af patella og sårlukning.
I flere pilotforsøg, fandt vi ud af, at en tilstrækkelig koagulation af den fibrin-celle suspension det tager mere end 60 min In situ -. Under operationen - det er næppe muligt at vente mere end 60 min for hele koagulation. Desuden ved anvendelse af en steril plade med forborede huller simulerer osteochondral læsioner, var det muligt at vise, at mængden af fibrinklæber, som blev brugt til naturligvis fylde defekten fuldstændigt, ikke var nok skyldes krympning af hærdning blodprop . Dette kræver en større mængde af fibrinklæber på forhånd for at opnå en kongruent og fuldstændige fyldning af defekten. Udførelse udarbejdelsen af blodprop in vitro er det muligt let at justere konstruktionen formen til den ønskede størrelse af det borede defekt og derfor fylde osteochondrale defekt helt og kongruent.
Derudover enn in vitro forberedelse af cellen blodpropper forhindrer lækage af klæbemidlet, men (efter kun et par minutter) ikke fuldstændigt hærdet fibrin-celle-suspension. Derfor kan det sikres, at den oprindeligt planlagte volumen vil forblive i defekten og vil begynde med brusk integration og remodellering.
Den beskrevne teknik tillader en standardiseret metode til eksperimentel stamcelleforskning inden for osteochondral reparation. Protokollen giver en reproducerbar måde at isolere mesenchymstamceller for at re-indpode dem senere i osteochondrale brusk defekter i kaninens knæled. Autologe chondrocyter er allerede implanteret i osteochondrale defekter i en fibrin-celle-modellen 19. Anvendelse af en in vitro-model af blodprop præparat samt mesenkymale stamceller i stedet for chondrocytter synes at være en mere fordelagtig og lovende ny fremgangsmåde for ombygning og reparation af osteochondral læsioner.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af den tyske Research Association (tilskud HE 4578/3-1), og delvist af FP7 EU-projekt "GAMBA" nMP3-SL-2010 til 245.993.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
References
- Kon, E., et al. Novel nano-composite multilayered biomaterial for osteochondral regeneration: a pilot clinical trial. The American Journal of Sports Medicine. 39, 1180-1190 (2011).
- Kon, E., et al. Orderly osteochondral regeneration in a sheep model using a novel nano-composite multilayered biomaterial. Journal of Orthopaedic Research: Official Publication of the Orthopaedic Research Society. 28, 116-124 (2010).
- Hangody, L., et al. Autologous osteochondral grafting--technique and long-term results. Injury. 39, 32-39 (2008).
- Marcacci, M., et al. Arthroscopic autologous osteochondral grafting for cartilage defects of the knee: prospective study results at a minimum 7-year follow-up. The American Journal of Sports Medicine. 35, 2014-2021 (2007).
- Ochs, B. G., et al. Remodeling of articular cartilage and subchondral bone after bone grafting and matrix-associated autologous chondrocyte implantation for osteochondritis dissecans of the knee. The American Journal of Sports Medicine. 39, 764-773 (2011).
- Aurich, M., et al. Autologous chondrocyte transplantation by the sandwich technique. A salvage procedure for osteochondritis dissecans of the knee. Unfallchirurg. 110, 176-179 (2007).
- Williams, R. J. 3rd, Ranawat, A. S., Potter, H. G., Carter, T., Warren, R. F. Fresh stored allografts for the treatment of osteochondral defects of the knee. The Journal of Bone and Joint Surgery. American Volume. 89, 718-726 (2007).
- Szerb, I., Hangody, L., Duska, Z., Kaposi, N. P.
- Brittberg, M., et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med. 331, 889-895 (1994).
- Peterson, L., Vasiliadis, H. S., Brittberg, M., Lindahl, A. Autologous chondrocyte implantation: a long-term follow-up. Am. J. Sports Med. 38, 1117-1124 (2010).
- Gomoll, A. H., et al. The subchondral bone in articular cartilage repair: current problems in the surgical management. Knee Surg. Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 434-447 (2010).
- Steinhagen, J., et al. Treatment of osteochondritis dissecans of the femoral condyle with autologous bone grafts and matrix-supported autologous chondrocytes. Int. Orthop. 34, 819-825 (2010).
- Guo, X., et al. Repair of large articular cartilage defects with implants of autologous mesenchymal stem cells seeded into beta-tricalcium phosphate in a sheep model. Tissue Eng. 10, 1818-1829 (2004).
- Centeno, C. J., et al. Increased knee cartilage volume in degenerative joint disease using percutaneously implanted, autologous mesenchymal stem cells. Pain Physician. 11, 343-353 (2008).
- Niederauer, G. G., et al. Evaluation of multiphase implants for repair of focal osteochondral defects in goats. Biomaterials. 21, 2561-2574 (2000).
- Nagura, I., et al. Repair of osteochondral defects with a new porous synthetic polymer scaffold. J. Bone. Joint Surg. Br. 89, 258-264 (2007).
- Schlichting, K., et al. Influence of scaffold stiffness on subchondral bone and subsequent cartilage regeneration in an ovine model of osteochondral defect healing. The American Journal of Sports Medicine. 36, 2379-2391 (2008).
- Schagemann, J. C., et al. Cell-laden and cell-free biopolymer hydrogel for the treatment of osteochondral defects in a sheep model. Tissue Engineering. Part A. 15, 75-82 (2009).
- Vogt, S., et al. The influence of the stable expression of BMP2 in fibrin clots on the remodelling and repair of osteochondral defects. Biomaterials. 30, 2385-2392 (2009).
- Schillinger, U., et al. A fibrin glue composition as carrier for nucleic acid vectors. Pharm. Res. 25, 2946-2962 (2008).
- Ahmed, T. A., Giulivi, A., Griffith, M., Hincke, M. Fibrin glues in combination with mesenchymal stem cells to develop a tissue-engineered cartilage substitute. Tissue Engineering. Part A. 17, 323-335 (2011).
- Haleem, A. M., et al. The Clinical Use of Human Culture-Expanded Autologous Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Transplanted on Platelet-Rich Fibrin Glue in the Treatment of Articular Cartilage Defects: A Pilot Study and Preliminary Results. Cartilage. 1, 253-261 (2010).
- Pape, D., Filardo, G., Kon, E., van Dijk, C. N., Madry, H. Disease-specific clinical problems associated with the subchondral bone. Knee Surg Sports Traumatol. Arthrosc. 18, 448-462 (2010).
- Shirazi, R., Shirazi-Adl, A. Computational biomechanics of articular cartilage of human knee joint: effect of osteochondral defects. Journal of Biomechanics. 42, 2458-2465 (2009).
- Jorgensen, C., Gordeladze, J., Noel, D. Tissue Engineering through autologous mesenchymal stem cells. Curr. Opin. Biotechnol. 15, 406-410 (2004).
- Chen, F. H., Tuan, R. S. Mesenchymal stem cells in arthritic diseases. Arthritis Res. Ther. 10, 223 (2008).
- Le Blanc, K., Tammik, C., Rosendahl, K., Zetterberg, E., Ringden, O. HLA expression and immunologic properties of differentiated and undifferentiated mesenchymal stem cells. Exp. Hematol. 31, 890-896 (2003).
