Summary
Ein experimentelles Verfahren für die Behandlung von osteochondralen Defekten in das Kaninchen Kniegelenk beschrieben. Die Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in osteochondralen Defekten stellt eine viel versprechende Entwicklung auf dem Gebiet des Tissue Engineering. Die Herstellung von Fibrin-Gerinnsel-Zelle
Protocol
A. Herstellung einer Donor Kaninchen zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen (Chirurgie Zimmer)
- Die Zellen werden von männlichen New Zealand White (NZW) Kaninchen im Alter von 4 Monaten und ca. 3 kg Körpergewicht isoliert.
- Induce Narkose durch Propofol (10 mg / kg Körpergewicht iv) und opfern mit Natrium-Pentobarbital (100 mg / kg Körpergewicht iv).
- Shave Fell von Hinterbeine, Rücken und Bauch mit einem elektrischen Haarschneider und absaugen Fell.
- Desinfizieren Sie die rasierte Fläche gründlich mit 70% Ethanol.
- Mit stumpfen Pinzette, scharfe Schere (oder Skalpell) und Knochen-Fräser für Gewebe und Bänder.
- Einen Einschnitt entlang der Schädelbasis Oberfläche des Beines und Kalb.
- Reflect Haut und des subkutanen Gewebes durch entweder scharf oder stumpf.
- Separate Muskeln und Bänder von Schienbein und Oberschenkelknochen. Halten Schnitten als dicht am Knochen wie möglich, um eine saubere Zerlegung machen. Nicht trennen Oberschenkelknochen von Tibia zu diesem Zeitpunkt.
- Cut through das Hüftgelenk, um den Kopf des Oberschenkelknochens aus der Gelenkpfanne zu trennen.
- Elevate die Tibia-Femur komplex.
- Verwenden Sie das Skalpell abkratzen alle verbleibenden Weichteile von den Knochen oder reiben die Knochen mit sterilen Tuch Gewebe. An diesem Punkt werden Femur und Tibia noch angeschlossen.
- Entfernen Patella durch Schneiden, dann schneiden Kniegelenk Bänder zu trennen Knochen schließlich.
- Spray getrennt Knochen mit 70% Ethanol, der Luft trocknen lassen und legen jeden Knochen in einen 50 ml Zentrifugenröhrchen mit Zellkulturmedium (DMEM + 1% Penicillin / Streptomycin (Pen / Strep)), um sie feucht.
- Jetzt unter einem sterilen Zellkultur Laminarströmungshaube wechseln.
B. Flushing von Kaninchen MSC aus Knochen und Expansion (Cell Culture Hood)
- Sammle Knochen von Rohren und legen Sie sie in 150 mm-Schalen mit einer sterilen Pinzette.
- Entfernen Sie beide Knochen endet mit einer sterilen Säge und bewegen, um neue Stücke 150 mm Gerichte.
- Füllen Sie eine 10 ml Spritze mit medium (DMEM), legen eine 18-Gauge-Nadel und stecken Sie in die Öffnung des Knochenmarks.
- Dann spülen Markhöhle mit mittlerer bis das Knochenmark in die Schüssel zu spülen. Anschließend, aus dem anderen Ende spülen, wenn möglich. Falls erforderlich, absägen mehr von den Enden. Wenn Knochen brechen sollte, nur spülen Sie das Innere des Knochens.
- Saugen Zellmedium Suspension in der Spritze und spülen Sie das Knochenmark so oft, bis Suspension frei schwimmenden durch das Knochenmark Hohlraum und ohne weitere Knochenmark-Klumpen erscheinen.
- Sobald Knochenmark wurde aus allen Knochen gesammelt worden, die Knochenmark Klumpen, indem sie durch eine 18-Gauge-Nadel stören: füllen Spritze mit Nadel und verdrängen in Medium.
- Danach, filtern die Suspension durch einen Filter in eine Zelle 50 ml Tube. Um Zellen zu verhindern, waschen Kulturschale 2x mit 10 ml Medium und zu filtern sowie.
- Zentrifuge Suspension bei 500 xg für 5 min bei RT.
- Überstand entfernen und resuspendieren Zelle Pellet in 10 ml Medium (DMEM + 1% Pen / Strep).
- Separate Blutzellen aus peripheren mononukleären Blutzellen (PBMC) und mesenchymale Stammzellen (MSC) mit einem Biocoll Trennlösung.
- Füllen Sie 5 ml Biocoll Trennlösung in einen 15-ml-Tube und vorsichtig 5 ml Zell-Suspension auf und Zentrifuge bei 800 xg für 20 min bei RT (ohne Bremse).
- Mögliche Ergebnisse siehe Abbildung 1: Sein dichter als Biocoll, rote Blutkörperchen Sediment auf den Boden, während PBMC und mesenchymalen Stammzellen an der Schnittstelle zu bleiben.
- Entfernen Sie vorsichtig Schnittstelle in einen 15-ml-Tube und wäscht mit 5 ml PBS.
- Zentrifuge wie in Schritt 22 beschrieben, resuspendieren in 5 ml PBS und 2-3x wiederholen.
- Dann wieder Zentrifuge bei 350 xg für 10 min bei RT (mit Bremse).
- Resuspendieren in 10 ml Medium und zählen Zellen in einer Zählkammer.
- Teller Zellen bei einer anfänglichen Aussaatdichte von ca. 5 x 10 6 in 150 mm-Schalen.
- Nach 2-3 Tagen wiederbewegen nicht haftenden Zellen. Möglicherweise müssen Sie mit PBS erste Spülung, um Zelltrümmer zu entfernen. In frischem Vollmedium (DMEM + 10% Fetal Calf Serum (FCS) + 1% Pen / Strep) danach.
- Füttern Zellen alle 3-4 Tage (Abbildung 2).
- Nach 5-10 Tagen Durchgang die Zellen für die erste Zeit.
C. Herstellung von Fibringerinnseln in vitro
- Am Tag der Implantation, lassen anhaftenden Zellen aus den Kolben / Geschirr von einem 3-min Exposition gegenüber 0,25% Trypsin-EDTA. Stoppen Trypsinierung indem Vollmedium.
- Verteilen Sie Zellen in einem 50 ml Falcon-Röhrchen und waschen Sie sie zweimal mit PBS.
- Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen und Zahlen von Trypanblaufärbung.
- In 50.000 Zellen / Mikrozentrifugenröhrchens und sammeln Pellets durch Zentrifugation bei 500 xg für 5 min bei RT. Bereiten Sie eine mastermix für mindestens eine weitere Gerinnsel nach Bedarf.
- Zellpellet in 17 ul PBS und mischen Sie 25 ul der Fibrinogen-Komponente von TISSUCOL-Kit mit diesem 17 ul MSC Suspension.
- Nehmen Sie eine sterile Platte mit Vorbohrungen (3x3.6 mm) in Übereinstimmung mit den Bohrungen in vivo (Abbildung 3).
- Zuerst impfen 4 ul Thrombin-Lösung (500 IU / ml) in einem Loch, durch sofortige Zugabe von 42 ul Fibrinogen-Zell-Suspension und wieder 4 ul Thrombin-Lösung an der Spitze gefolgt. Mischen Sie nicht die Aussetzung zu vermeiden Blutgerinnung in der Pipettenspitze. Zunächst wird die 50 ul Volumen des pipettierten Fibrinogen-Zell-Suspension der Rand der vorgebohrten Löcher ohne Schmelzen aufgrund der Oberflächenspannung vorstehen. Jedoch nach vollständiger Gerinnung (nach 60 min) das Gerinnsel zusammenzieht und passt in das vorgebohrte Loch.
- Entfernen Sie das Gerinnsel vorsichtig mit einem stumpfen Pinzette und in einen Mikrozentrifugenröhrchens mit PBS. Bereiten 2 Blutgerinnsel / Tier.
- Nehmen Sie die Klumpen an den Operationssaal.
D. Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln
- Induce Anästhesie, Kaninchen (NZW, männlich, 3,5-4,0 kg Körpergewicht, 5-6 Monate alt) durch iv-Injektion von Propofol (10 mg / kg Körpergewicht).
- Rasur das Knie auf mit einem elektrischen Haarschneider und Vakuum das Fell betrieben werden. Alle Verfahren genannt werden, bevor in einer Operation Herstellung Raum, um eine Verunreinigung der sterilen Umgebung des Operationssaals vermeiden durchgeführt.
- Nach der Intubation Aufrechterhaltung der Narkose mit 1,5 mg / kg / min Propofol und 0,05 mg / kg / min Fentanyl intravenös. Überwachen Anästhesie mit Kapnographie, Pulsoximetrie und Pulsfrequenz.
- Desinfizieren Sie die Knie rasiert gründlich und decken den Rest der Kaninchen mit einem sterilen Verband.
- Ertasten Sie die Patella und führen Sie einen Hautschnitt medial der Patella.
- Öffnen Sie das Kniegelenk durch eine medial parapatellaren Arthrotomie unter sterilen Bedingungen. Versuchen Sie zu vermeiden Schneiden alle kleinen oberflächlichen Blutgefäße.
- Anschließend verdrängt man das Patella seitlich (Abbildung 4).
- Nach InSpektion des Kniegelenks für jegliche begleitende Knorpelschäden oder gemeinsamen Anomalien, erstellen Sie zwei osteochondralen Defekten (3 mm tief, Achter-Form) in der Trochleagrube mit steriler Luft Betriebsleistung Bohrer (3,6 mm Durchmesser) mit einem Stopp-Gerät (Abbildung 5).
- Reinigen Sie die Mängel und spülen Sie sie mit steriler Kochsalzlösung.
- Vor der Implantation füllen 20 ul Fibrinkleber in die Defekte und verteilt sie gleichmäßig auf dem Boden der fehlerhaften Stelle.
- Dann implantieren Blutgerinnsel im Preßsitz in der Acht-förmigen Defekt.
- Nach Gerinnung, verlagern die Kniescheibe im Trochleagrube und beugen und strecken das Knie ein paar mal.
- Anschließend verdrängt man das Patella seitlich noch einmal und überprüfen Sie, ob Fibrinogen-Zell-Klumpen sind noch an Ort und Stelle.
- Ersetzen Sie die Patella wieder und beenden Sie den Vorgang mit Wundverschluss in Schichten mit einzelnen Knopf Nähte (4-0 Vicryl) und eine kontinuierliche Hautnaht (4-0 Monocryl) (beide mit resorbierbares NahtmaterialMaterial).
- Schließlich versiegeln die Wunde mit einem Spray Dressing wasserdampfdurchlässig.
- Für die postoperative Versorgung wird die Wunde täglich für 7 Tage überprüft. Die Kaninchen erhalten zur postoperativen Analgesie Carprofen 4 mg / kg sc alle 24 h (für 4 Tage) und Buprenorphin 0,03 mg / kg sc alle 12 h (2,5 Tage). Eine Stabilisierung des Knies (z. B. Verband) ist nicht erforderlich.
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Representative Results
Die beschriebene Operationstechnik ermöglicht eine erfolgreiche Isolierung und die Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in einer künstlichen osteochondralen Defekt. Der experimentelle Aufbau ergab eine erfolgreiche Integration des Implantates in den umgebenden Knorpel.
Der Defekt wurde durch Reparatur Gewebe mit ähnlichen biomechanischen Eigenschaften und ähnliche Haltbarkeit im Vergleich zum umgebenden Knorpel gefüllt. Das Fibrin-Clot-Zellen wurde in vitro an einer sterilen Platte mit vorgebohrten Löchern, die die gleiche Größe wie die osteochondralen Defekt (Abbildung 3) vorbereitet hatte. Als Ergebnis gab es keine Spalten zwischen dem implantierten Fibringerinnsels und dem umgebenden Knorpel, der ein Risikofaktor für vorzeitigen Degeneration oder Ablösung (Abbildung 6) wäre. Eine basale Heilung der Reparatur Gewebe wurde sichergestellt, da der subchondrale Knochen durchdrungen war, und damit gegen eine Blechschere gearbeitet. Ein weiterer wichtiger Aspekt war die stiffness der Reparatur Gewebe, sollte das passen die gesunde umliegende Knorpelgewebe eine erhöhte Belastung auf sie und einen möglichen vorzeitigen Degeneration zu vermeiden. In unseren Vorversuchen (Daten nicht gezeigt) zeigten wir, dass nach 12 Wochen eine ausreichende Steifigkeit bereits erreicht werden konnte. Darüber hinaus wurde eine intakte und homogene Oberfläche des Transplantats gefunden, die Schubspannung reduziert und mögliche Schäden Implantat (Abbildung 6).
Abbildung 1. Trennung von Blutzellen und Plasma von PBMCs und MSCs mit Biocoll Trennlösung.
Abbildung 2. Monolayer von mesenchymalen Stammzellen (New Zealand White Kaninchen) nach 5 Tagen in Kultur.
Abbildung 3. Sterile Platte mit Vorbohrungen (3x3.6 mm) die oberste mit einem Fibrin-Zell-Gerinnsel gefüllt.
Abbildung 4. Eröffnet Kniegelenk nach medial parapatellaren Arthrotomie.
Abbildung 5. Osteochondralen Defekten (3 mm tiefe, 3 mm Durchmesser, Acht-Form) in der Trochlea.
Abbildung 6. Eröffnet Kniegelenk 12 Wochen nach Implantation von zwei Fibrin-Zell-Klumpen in zwei gebohrt osteochondralen Defekten.
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Discussion
In den letzten Jahren, die Möglichkeit der Behandlung von komplexen Gelenk osteochondralen Defekten - wurde mit Tissue Engineering Ansätze mehr und mehr attraktiv - wie jene, die aus ÖD, Osteonekrose und Trauma. In den zuvor genannten pathologischen Entitäten erstreckt Gewebeschäden an der subchondralen Knochens und umfasst zwei Geweben von verschiedenen intrinsischen Kapazitäten Heilung 1 gekennzeichnet. Es gibt ein zunehmendes Interesse an der Rolle des subchondralen Knochen für den pathogenen Prozessen osteochondraler Gelenkschäden 11,23. Die funktionellen Bedingungen des Gelenkknorpels und die unterstützenden Knochen sind fest verbunden. Verletzungen der beiden Gewebe nachteilig auf die mechanischen Umgebung sowie die Homöostase Gleichgewicht des gesamten Gelenk 24. Veränderungen in der Knorpel-Knochen-Einheit durch mechanische Zerstörung der gemeinsamen Bewegung, Körper lose Formation, mechanischen Verschleiß in den beteiligten Fach-und Abriebgegenüberliegenden Flächen kann zu einem früheren Beginn und Entwicklung der Arthrose 1,11 führen. Daher sollte das Tissue Engineering Ansätze zur Regeneration von osteochondralen Defekten durch eine ausreichende Wiederherstellung der darunterliegenden subchondralen Knochen begleitet werden, um die wirksame Verbindung mit umgebenden Wirtsgewebe 2 zu verbessern. Mesenchymale Stammzellen scheinen ein idealer Zellquelle diese spezifischen Anforderungen von osteochondralen Reparatur bereitzustellen. Das Protokoll betont die Förderung der Knochen-und Knorpelgewebe Restaurierung durch potenziell induzieren die selektive Differenzierung der transplantierten mesenchymalen Stammzellen in osteogene und chondrogene Linien.
Im Vergleich zu Chondrozyten, haben mesenchymalen Stammzellen mehrere wichtige Vorteile: sie können leicht aus Knochenmark, Fettgewebe synovialis und ohne größere Donorseite Morbidität isoliert werden. Mesenchymalen Stammzellen nicht während der in vitro Expansion und DifferenzierungDaher kann in Kultur in großer Zahl großer Gelenkknorpeldefekte behandeln. Darüber hinaus scheinen sie immunsuppressive und - in Reaktion auf entsprechende Reize - kann in Chondrozyten und Osteozyten 25,26 differenzieren. Ein weiterer bemerkenswerter Vorteil von mesenchymalen Stammzellen zeigt ihre hypoimmunity, was bedeutet, dass allogenen mesenchymalen Stammzellen ohne Anzeichen von Abstoßungsreaktionen 27 verwendet werden können. Daher kann eine Zell-Pool aus einem oder zwei Spendertieren ausreichend für alle Versuche. Dies reduziert den Betrieb Zeit und zusätzliche Schäden für die Tiere.
Mehrere Experimente zeigten vielversprechende Ergebnisse mit Fibrinkleber für osteochondrale Reparatur 19,20. Üblicherweise wird die Impfung der Fibrinogen-Zell-Suspension mit Thrombin Lösung als ein Verfahren in situ durchgeführt beschrieben wurden, direkt in den künstlichen osteochondralen Läsionen. Nach einer kurzen Zeit des Pre-Gerinnungszeit (nach einigen Minuten) Der Betrieb ist in der Regel durch die Verlagerung der Patella und Wundverschluss beendet.
In mehreren Pilotversuchen, fanden wir heraus, dass für eine ausreichende Gerinnung des Fibrin-Zell-Suspension es mehr als 60 min dauert In situ -. Während der Operation - es ist kaum möglich, mehr als 60 min für ganze Blutgerinnung warten. Darüber hinaus kann durch Verwendung eines sterilen Platte mit vorgebohrten Löchern Simulation der osteochondralen Läsionen, war es möglich zu zeigen, dass die Menge an Fibrinkleber, die verwendet werden, um den Defekt zu füllen offensichtlich vollständig war, nicht genug durch Schrumpfung der Härtung Gerinnsel . Dies erfordert ein höheres Fibrinkleber im Voraus, um eine kongruente und vollständige Füllung des Defekts zu erreichen. Darstellende der Vorbereitung des Gerinnsels in vitro ist es möglich, einfach die Form Konstrukt auf die entsprechende Größe des gebohrten Defekt und deshalb füllen die osteochondralen Defekt vollständig und deckungsgleich.
Zusätzlich kann einn in vitro Herstellung der Zelle Klumpen verhindert eine Leckage des Klebstoffs jedoch (nach einigen Minuten) nicht vollständig gehärtet Fibrin-Zell-Suspension. Daher kann gewährleistet werden, dass die ursprünglich geplante Volumen wird in den Defekt zu bleiben und wird mit Knorpel Integration und Umbau beginnen.
Die beschriebene Technik ermöglicht eine standardisierte Methode für experimentelle Stammzell-Forschung auf dem Gebiet der Knochen-Knorpel zu reparieren. Das Protokoll sieht eine reproduzierbare Weise, mesenchymale Stammzellen zu isolieren, um wieder zu implantieren sie später in osteochondralen Knorpelschäden des Kaninchens Kniegelenk. Autologe Chondrozyten wurden bereits in osteochondralen Defekten in einem Fibrin-Zell-Modell 19 implantiert worden. Mit einem in vitro-Modell der Gerinnsel Vorbereitung sowie mesenchymale Stammzellen anstelle von Chondrozyten scheint ein vorteilhafter und vielversprechenden neuen Ansatz für Umbau und Reparatur von osteochondralen Läsionen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (Zuschuss HE 4578/3-1) und teilweise durch das FP7 EU-Projekt "GAMBE" NMP3-SL-2010-245993 finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Biochrom AG | F 0415 | |
| FCS | PAN Biotech GmbH | 0401 | |
| Propofol | Fresenius Kabi | ||
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom AG | A 2210 | 1,000 units/10 μg/μl in 0.9% NaCl |
| PBS Dulbecco (1X) | Biochrom AG | L1815 | |
| Ethanol (70%) | Merck KGaA | 410230 | |
| Trypan Blue Solution (0.4%) | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| Biocoll Separation Sol. | Biochrom AG | L6115 | Isotonic solution Density: 1,077 g/ml |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Invitrogen GmbH | 25300-054 | |
| Fentanyl | DeltaSelectGmBH | 1819340 | |
| NaCl solution (0.9%) | BBraun | 8333A193 | |
| Syringes (Injekt) | BBraun | 4606108V | |
| Needles (Sterican) | BBraun | 4657519 | |
| Forceps (blunt/sharp) | Aesculap | ||
| Scissors | Aesculap | ||
| Scalpels | Feather Safety Razor Co | 02.001.30.022 | |
| Pipettes research | Eppendorf | ||
| Bone Cutter | Aesculap | ||
| Tissue culture dishes 100 mm/150 mm | TPP AG | 93100/93150 | Growth area 60.1 mm2/147.8 mm2 |
| Tissue culture flasks 25/75 mm2 | TPP AG | 90025/90075 | 25 mm2, 75 mm2 |
| Centrifuge Tubes (50 ml) | TPP AG | 91050 | Gamma-sterilized |
| CO2 Incubator | Forma Scientific Inc. | ||
| Cell culture laminar flow hood Hera Safe | Heraeus Instruments | ||
| Sterile saw | Aesculap | ||
| Centrifuge Megafuge 2.0 R | Heraeus Instruments | ||
| Hemocytometer | Brand GmbH+Co KG | 717810 | Neubauer |
| Air operated power drill | Aesculap | ||
| TISSUCOL-Kit 1.0 ml Immuno | Baxter | 2546648 | |
| Fibers (4-0 Monocryl, 4-0 Vicryl) | Ethicon | ||
| Spray dressing (OpSite) | Smith&Nephew | 66004978 | Permeable for water vapor |
References
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