Summary
Utilizzando luciferasi e sistemi di imaging in vivo (IVIS) come un nuovo mezzo per identificare terminazioni malattia prima sviluppi clinici verificarsi. IVIS ci ha permesso di visualizzare in tempo reale l'invasione di virus encefalitiche più giorni, fornendo un modello di malattia più accurato per lo studio futuro. E ci ha anche permesso di identificare le caratteristiche potenziali di protezione di antivirali e vaccini più veloce rispetto ai modelli animali attualmente utilizzati. La capacità di utilizzare singoli animali più intervalli di tempo multipli assicura condizioni di polizia, i costi ridotti, e morbilità generale per gli animali utilizzati garantire un mezzo più umane e più scientifico di studio della malattia.
Abstract
Progressi moderni in tecnologia di imaging incoraggiare l'ulteriore sviluppo e perfezionamento nel modo in cui si compie la ricerca virale. Inizialmente proposto da Russel e Burch nel 3R Hume (sostituzione, riduzione, perfezionamento), l'utilizzo di modelli animali nella ricerca scientifica è costantemente sotto pressione per individuare nuove metodologie per ridurre l'uso degli animali, migliorando la precisione scientifica e velocità. Una sfida importante per principi di Hume tuttavia, è come garantire gli studi sono statisticamente accurate, riducendo la morbilità della malattia degli animali e numeri complessivi. Studi di efficacia vaccino attualmente richiedono un gran numero di animali per essere considerato statisticamente significativo e spesso comportano elevata morbilità e mortalità endpoint per l'identificazione di protezione immunitaria. Abbiamo utilizzato in vivo imaging sistemi (IVIS) in combinazione con un enzima bioluminescente lucciola per monitorare progressivamente l'invasione del sistema nervoso centrale (CNS) da un mentophalitic virus in un modello murino. Tipicamente, la malattia progredisce in modo relativamente lento, tuttavia replicazione del virus è rapido, soprattutto nel SNC, e può portare ad un spesso, esito letale. A seguito di infezione intranasale dei topi con TC83-Luc, un ceppo attenuato equina venezuelana, virus dell'encefalite modificate per esprimere un gene di luciferasi, siamo in grado di visualizzare la replicazione del virus all'interno del cervello, almeno tre giorni prima della comparsa dei sintomi clinici di malattia. Utilizzando invasione del SNC come endpoint chiave encephalitic sviluppo della malattia, siamo in grado di identificare rapidamente terapeutico e protezione del vaccino contro TC83-Luc infezione prima che i sintomi clinici si sviluppano. Con la tecnologia IVIS siamo in grado di dimostrare il test rapido e preciso di terapie farmacologiche e di vaccini, riducendo il numero degli animali e la morbilità.
Protocol
1. Preparazione degli animali
- Animal arrivo: All'arrivo al livello animale biosicurezza 2 (ABSL2) servizi, consentire che gli animali un minimo di 2 giorni per acclimatarsi al nuovo ambiente. Dopo questo periodo di riposo, al controllo degli animali per valutare la loro salute e in generale l'aspetto fisico.
- Quando si utilizza reporter fluorescenti è importante mettere tutti i soggetti animali su una dieta di erba medica libero di limitare la quantità di autofluorescenza GI e segnale di fondo.
- Shave animali: Per migliorare il segnale bioluminescente rilevato dal cranio durante l'esposizione; radere le teste di tutti gli animali. Anestetizzare gli animali con una miscela di ossigeno e gas vaporizzato isoflurano. Una volta che gli animali sono completamente anestetizzati, utilizzare tagliatori elettrici a radersi la testa. Una volta finito con rasatura, riportare gli animali nelle loro gabbie e osservare per un completo recupero dagli effetti dell'anestesia.
- Bio Medic datiSystems (BMDS) inserimento transponder (che si terrà dopo la rasatura dei topi, mentre gli animali sono completamente anestetizzati): Per un mezzo meno invasivo per monitorare la temperatura di un impianto pre-programmato BMDS transponder wireless per via sottocutanea nella regione dorsale di ogni topo. Questi transponder permettere di identificare wireless e registrazione della temperatura. Dopo l'impianto del transponder, applicare un veterinario qualità del tessuto adesivo alla ferita.
- Collezione di base: prima infezione, registrare una temperatura basale e il peso per tutti gli animali. Prelevare il sangue per la riduzione della placca prova di neutralizzazione (PRNT) analisi attraverso retro-orbitali (RO) spurgo, mentre i topi sono sotto anestesia. Dopo il prelievo del sangue, applicare pomata antibiotica veterinaria occhio per ridurre il potenziale infezione batterica secondaria. Questa raccolta di base deve essere completato con considerazione il numero di volte che gli animali sono sottoposti in anestesia da stress sui topi. Future collezioni RO should essere completato dopo l'imaging, mentre il mouse è ancora sotto anestesia. Il sangue raccolto da un massimo RO dovrebbe essere di circa 200 pl.
- Infezione: topi posto sotto anestesia come descritto in precedenza. Inoculare per via intranasale utilizzando una dose di 5x10 6 a 5x10 7 pfu TC83-luciferasi in un volume totale di 40 microlitri diluito soluzione tampone fosfato (PBS) attraverso infezione intranasale. A seguito di infezione, posizionare i topi all'interno della loro gabbia di alloggiamento e osservare il recupero.
2. Animal Imaging
Disclaimer: Mantenere topi all'interno della loro unità abitativa, l'armadio biosicurezza (BSC), o la scatola di contenimento XIC in ogni momento. Le BSC approvati per questo protocollo sono una classe di tipo II B1 o B2.
- Iniettare tutti gli animali con 10 ml per grammo di peso corporeo di intraperitoneale (IP) luciferina ad una concentrazione di 15 mg / ml.
- I topi trattati con Ampligen devono essere injecteIP d alla dose di 12,5 mg / kg di peso corporeo al messaggio infezione -4 ore o 48 ore dopo l'infezione in base al loro gruppo.
- Prima dell'iniezione con luciferina, separare i topi in gruppi di tre per garantire un posizionamento adeguato all'interno del XIC-3 scatola di contenimento.
- Per tutte imaging, utilizzano unguento oculare / lubrificante per impedire l'essiccazione della cornea durante tutta la procedura.
- Aprire il software LivingImage e premere Inizializza per preparare la casella di imaging, auto risparmio di serie, tempo di esposizione di auto (tempo di esposizione su auto è una nuova funzione del software LivingImage 3.2 e successivi), vedi campo C, e filtro per aprire; campo di vista si basa sul numero di topi sei imaging; e il filtro può essere ottimizzato come necessario per progetti imaging.
- Verificare che i filtri dell'aria a carbone non è scaduto, il serbatoio è pieno di ossigeno, e il serbatoio viene riempito isoflurano. Mettere piccole strisce di nastro isolante nel XIC-3 icasella di consolazione che aiuta a ridurre il movimento degli animali durante l'esposizione.
- Iniettare i topi con IP luciferina come descritto nella sezione 2.1 e posto all'interno della camera di induzione isoflurano (con coperchio aperto) per 3-5 min.
- Dopo 5 min, chiudere il coperchio della camera di induzione e avviare il flusso di isoflurano. L'anestetico viene utilizzata a circa 3-5% del valore di frequenza di flusso di ossigeno di circa 2,0 L / min. Una volta completamente inconscio attendere un ulteriore 30 sec e trasferire i topi al XIC-3 box di isolamento. Assicurarsi che l'armadio biosicurezza stati utilizzati consente per la sicurezza evacuazione di isoflurano poiché tale procedura comporterà la perdita di isoflurano dalla camera di induzione (l'unità IVIS contiene i propri contenitori passivi Fiera e la XIC-3 scatola di contenimento si collega direttamente alla in / out prese garantire contenute flusso anestetico).
- Trasferire i topi basate su chip / numero del gruppo nel XIC-3 box di isolamento con il connettore isoflurano allegato und aprire. Posizionare i topi in modo che sono previste in decubito sternale con la testa delicatamente appoggiate sulle strisce di nastro.
- Pulire la scatola XIC contenimento con etanolo, le mani a spruzzo e il fondo del XIC-3 con CaviCide, e trasferire alla camera IVIS imaging. Ricollegare l'anestesia alla scatola di contenimento, una volta dentro l'unità di riproduzione.
- Dopo 10 minuti dopo l'iniezione di luciferina, l'immagine dei topi attraverso il software di immagine vivente.
- A seguito di imaging iniziale con un filtro aperto, avviare una DLIT 3-Dimensional immagini utilizzando l'analisi di sequenza guidata di installazione Immagine per bioluminescente luciferasi lucciola. Questo processo di imaging avrà min 4-5 e deve essere eseguita da un campo di vista rilevante per il numero di topi desiderati.
- Ex-vivo analisi è possibile necroscopia seguente e raccolta del cervello. Mettere il cervello su una piastra di Petri sterile, gocciolamento 50-100 ml di magazzino luciferina sulla parte superiore, e il luogo all'interno del imaging box.
- Finalizzare una seconda immagine aperta filtro a 15-17 minuti dopo l'infezione al termine di imaging DLIT. Assicurarsi che l'analisi di sequenza è spento e il campo di vista e impostazioni del filtro Vengono ripristinati i valori precedenti.
3. I topi di ritorno e analisi dei dati
- Spegnere il vaporizzatore isoflurano e trasferire il recipiente di contenimento XIC torna al mobile biosicurezza.
- Mettere i topi indietro all'interno della loro unità abitativa, chiudere il coperchio superiore, spruzzare l'esterno con un disinfettante appropriato e rimetterlo sul rack custodia.
- Assicurarsi che i topi hanno pienamente recuperato dall'anestesia.
- Ripetere la procedura di cui sopra come l'esperimento è necessario fino a quando l'imaging è stata completata.
- Disinfettare il BSC, spegnere l'apparecchio e trasferire tutti i dati in una posizione laboratorio esterno per ulteriori analisi.
- Analizzare i dati e generare 3 immagini tridimensionali basate su IVIS risultati utinalizzare il software LivingImage.
- Assicurarsi che l'immagine sia orientato correttamente e illuminazione / bilanciamento del colore è impostato. All'interno della tavolozza degli strumenti le opzioni includono Regolazione immagine, correzioni, informazioni sull'immagine, e Strumenti ROI.
- Utilizzare forme ROI per identificare i punti di forza del segnale specifici basati su posizione.
- Ricostruire la topografia della superficie per evidenziare il corpo del mouse, inizializzare ricostruzione 3D DLIT, e utilizzare in forma lineare per impostare la mappa organo alla ricostruzione topografica.
- Ulteriori analisi titolazione virale può essere completato attraverso la raccolta di sangue e di organi. Titolazione in questo studio è stato completato attraverso l'omogeneizzazione del tessuto cerebrale nella modificato aquile medio (MEM). L'omogenato è stato diluito serialmente e abbiamo infettato una piastra ben 6 di cellule Vero per 1 ora. Le cellule sono state coperte con una sovrapposizione agarose/2xMEM 1,5% ed incubate per 2 giorni a 37 gradi. Cellule sono state fissate con formalina al 10% per 30 minuti e trattata concristallo viola.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Con un virus geneticamente modificato, TC83-luciferasi, abbiamo visto un aumento di potenza del segnale bioluminescente la replicazione del virus si sposta dalla regione nasale nel SNC centrali (Figura 1). A causa dell'elevato tasso di replicazione virale, ci aspettiamo di vedere un alto livello di segnale bioluminescente (Figura 2A) dipendenti dal vettore e la risposta immunitaria degli animali al vettore. Ci aspettiamo che questo aumento del segnale di continuare ad un picco, tra 5-7 giorni dopo l'infezione, in combinazione con picco di replicazione virale all'interno del SNC (Figura 2B). Seguendo il segnale e di picco virale, ci aspettiamo di vedere una diminuzione del segnale sia dovuto ad una diminuzione nella replicazione virale e causa di una perdita del gene della luciferasi. Con questi valori di segnale ci aspettiamo di essere in grado di quantificare la carica virale basato sulla forza del segnale, fornendo un metodo in vivo per calcolare accuratamente progressivamente crescente carico virale in un animale specif singola ic a TC83-luciferasi.
Utilizzando questo modello come un mezzo per analizzare vaccini e trattamenti antivirali, ci aspettiamo di essere in grado di rilevare una differenza tra trattamenti efficaci basato su una riduzione nel segnale bioluminescente. Nel nostro caso, contro TC83-luciferasi, possiamo utilizzare Ampligen IP (a Toll-like receptor 3 agonista) o vaccinazione tre settimane prima infezione, per ridurre significativamente infezione virale e segnale bioluminescente tutto lo studio (Figura 3). Tale diminuzione può essere direttamente correlata ad una diminuzione della carica virale nel SNC (dati non mostrati). Come un modo per sviluppare pienamente e visualizzare la tecnologia, IVIS software LivingImage è capace di fare tre immagini tridimensionali del segnale bioluminescente (Figura 4), che permette di identificare facilmente posizioni di elevata replicazione virale basato sulla profondità del tessuto e composizione.
/ "Alt =" 4429/4429fig1.jpg Figura 1 "fo: content-width =" 5in "fo: src =" / files/ftp_upload/4429/4429fig1highres.jpg "/>
Figura 1. IVIS Imaging di TC83-luciferasi tre topi C57BL / 6 sono stati infettati attraverso sfida intranasale con TC83-luciferasi e con immagini a 2, 4, 6, e 8 giorni dopo l'infezione (DPI). Le immagini sono state formulate in seguito a iniezione luciferina IP con una lunghezza di esposizione automatica e filtro aperto. Clicca qui per ingrandire la figura .
Figura 2. Entrambi i ceppi di topi avevano simile intensità del segnale bioluminescente dopo iniezione di luciferina IP con un ritardo di 10 minuti dopo l'iniezione prima di imaging è stato completato (A). Carica virale nel cervello (pfu / grammo di tessuto) mostra una forte correlazione tutta l'infezione al segnale biolumiescent (B).
Figura 3. Confronto Trattamento Utilizzando IVIS. Trattamento comarison dopo TC83-luciferasi infezione nei topi C3H/HeN. Topi immunizzati con sottocutanea TC83 23 giorni prima dell'esposizione con TC83-Luciferase presentato alcun segnale bioluminescente (A). Topi trattati Ampligen IP a infezione hr -4 e 48 dopo (B) hanno mostrato livelli ridotti rispetto ai topi che ricevono nessun trattamento (C).
Figura 4. 3-dimensionale di imaging ricostruzione. Utilizzando 3-Dimensional ricostruzione abbiamo visualizzato la posizione picco di TC83-luciferasi infezione utilizzando lo strumento DLIT ricostruzione di LivingImage. Siamo in grado di localizzare la profondità e la posizione del segnale primario nel SNC utilizzando questo technique.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Anche se questo protocollo riguarda gli aspetti di imaging per l'analisi in vivo, è importante riconoscere il vettore bioluminescente come un fattore chiave per gli studi futuri. L'utilizzazione di TC83, un ceppo di vaccino attenuato VeeV, come vettore per l'espressione della luciferasi assicura che grandi quantità dell'enzima si producono a causa della elevata velocità di replicazione del virus nel SNC come precedentemente descritto 1-4. Mentre l'aggiunta di un secondo promotore subgenomico ei risultati gene della luciferasi in ulteriore attenuazione del virus ricombinante rispetto al tipo selvatico TC83, questa attenuazione non sembra modificare il decorso clinico della malattia entro i primi 6 giorni di infezione 5. Prevediamo vedere una perdita del gene luciferasi attraverso la replicazione del virus nel tempo, ma questo non è visto più tardi nello sviluppo della malattia. Sviluppo di vettori patogeni, virali e batteriche, conferma le potenzialità e l'efficienzadi IVIS e luciferasi in più campi di ricerca patogeno 6-9.
Il processo di imaging in sé ha alcuni punti critici che devono essere completate prima di uno studio completo può essere implementato. Una prima analisi della forza bioluminescenti del vettore dovrebbe essere finito in uno studio pilota contenente un gruppo minimo di animali. La posizione prevista in vivo di accumulo luciferasi dovrebbe essere noto in anticipo a causa del vettore utilizzato, ma l'intensità del segnale atteso deve essere determinato prima di iniziare uno studio di grandi dimensioni. Con il nuovo software l'analisi tempo di esposizione non è così necessario a causa della funzione di rilevamento automatico di esposizione ora integrato nel software, ma un ritardo basato sulla iniezione di luciferina sarà ancora bisogno di essere determinato. Anche con tutti questi calcoli di segnale, il rilevamento bioluminescente può ancora essere limitato a causa di profondità vettore e pigmento animale generale e pelliccia. Si consiglia vivamente la rasatura di befor animaliimmagini e comincia a guadagnare il segnale più forte possibile.
Anche tenendo conto di attenuazione vettoriale e produzione di enzimi, crediamo di aver progettato un modello accurato e più efficiente utilizzo luciferasi quindi potrebbe essere generato con un sistema standard molecola fluorescente per l'analisi in vivo. Bioluminescenza non è limitata da avere una sorgente di luce di avvio, che inizialmente deve passare attraverso il tessuto risultante in una perdita di segnale. Inoltre non hanno i problemi di alta auto fluorescenti sfondo visto con i topi sulla loro pelliccia e perfino dalla loro dieta. Il rischio di tossicità dal substrato luciferina viene facilmente controllato attraverso un'adeguata filtrazione e dosaggio, rendendo bioluminescente altrettanto sicuri per l'animale. Entrambi i sistemi bioluminescenti fluorescenti e possono drasticamente ridurre l'utilizzo degli animali a causa l'analisi in vivo che sarà importante per le ricerche future a causa del mutato atteggiamento politico verso la ricerca sugli animali e l'adesione in seguito alla Humelettronici di 3R (sostituzione, riduzione, perfezionamento) verso l'uso degli animali 10.
Per la nostra applicazione della patogenesi virale e di efficacia antivirale, nella modellazione vivo è più efficiente rispetto ai sistemi attuali 11,12 per diverse ragioni. Siamo in grado di rilevare particolari passaggi chiave per lo sviluppo della malattia, invasione CNS 1 nel caso di TC83, prima di qualsiasi malattia clinica si sviluppa. Dalla rilevazione invasione iniziale, siamo in grado di visualizzare più volte in un singolo animale la diffusione e replicazione del virus fornendo un mezzo più accurati di studiare la progressione della malattia 5. Il modello che abbiamo progettato è anche più sicuro per i ricercatori a causa della ridotta esigenza di sacrificio e di raccolta di organi, la capacità di rilevare i principali punti di progressione della malattia prima che la malattia clinica può portare a irritabilità degli animali, e, specifico per il nostro sistema, siamo in grado di completare questi studi in un vettore virale attenuato nel ABSL2 invece del ABSL3utilizzando un agente di selezione.
Gli studi sulle malattie futuri utilizzano sempre bioluminescente modellazione IVIS. Avanzamenti nella moderne tecniche di biologia molecolare e della clonazione permettere l'inserimento di un gene di luciferasi rapido ed economico in entrambi vettori virali e batteriche. La capacità di sviluppare topi transgenici che esprimono un gene di luciferasi dipendente promotore fornisce anche un altro sistema per studio bioluminescente. Infine, di recente sviluppo sonde bioluminescenti come sonda Infiammazione Calibri RediJect reagisce con mieloperossidasi che consente la visualizzazione in vivo di reazione infiammatoria fagocita. Queste nuove tecnologie combinate con la crescente efficienza delle telecamere e software rende bioluminescente IVIS un sistema efficace per la ricerca futura in diversi campi di studio.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Istituto di Scienze Translational UTMB-sovvenzione del NIH 1UL1RR029876-01 e Alisha Prather per il suo aiuto con l'editing video di questo manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| D-Luciferin | |||
| Isoflurane | |||
| Xenogen IVIS System (Spectrum) | Caliper Life Sciences | ||
| XGI-8-gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences | ||
| XIC-3 Containment Box | Caliper Life Sciences | ||
| LivingImage 4.0 Software | Caliper Life Sciences | ||
| Telemetry/identification chips | Bio Medic Data Systems | IPTT-300 | Animal ID and Temperature |
| BD Integra 1ml TB syringe with 26 g x 3/8” needle | Fisher Scientific | 305279 | |
| Vet Bond tissue adhesive | Fisher Scientific | NC9259532 | |
| Vetropolycin Ophthalmic Ointment | Webster Veterinary Products | 78444656 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline 1X | Invitrogen | 14190-144 | |
| BMDS Chip Reader | Bio Medic Data Systems | DAS-7007S | |
| DAS-HOST Software | Bio Medic Data Systems | Used to download probe information |
References
- Steele, K. E., et al. Comparative Neurovirulence and Tissue Tropism of Wild-type and Attenuated Strains of Venezuelan Equine Encephalitis Virus Administered by Aerosol in C3H/HeN and BALB/c Mice. Veterinary Pathology Online. 35, 386-397 (1998).
- Ludwig, G. V., et al. Comparative neurovirulence of attenuated and non-attenuated strains of Venezuelan equine encephalitis virus in mice. Am. J. Trop. Med. Hyg. 64, 49-55 (2001).
- Charles, P. C., Walters, E., Margolis, F., Johnston, R. E. Mechanism of Neuroinvasion of Venezuelan Equine Encephalitis Virus in the Mouse. Virology. , 208-662 (1995).
- Volkova, E., Gorchakov, R., Frolov, I. The efficient packaging of Venezuelan equine encephalitis virus-specific RNAs into viral particles is determined by nsP1-3 synthesis. Virology. 344, 315-327 (2006).
- Patterson, M., et al. Rapid, non-invasive imaging of alphaviral brain infection: Reducing animal numbers and morbidity to identify efficacy of potential vaccines and antivirals. Vaccine. 29, 9345-9351 (2011).
- Cook, S. H., Griffin, D. E. Luciferase Imaging of a Neurotropic Viral Infection in Intact Animals. J. Virol. 77, 5333-5338 (2003).
- Contag, P. R., Olomu, I. N., Stevenson, D. K., Contag, C. H.
- Osorio, J. E., Iams, K. P., Meteyer, C. U., Rocke, T. E. Comparison of Monkeypox Viruses Pathogenesis in Mice by In Vivo Imaging. PLoS ONE. 4, e6592 (2009).
- Luker, G. D., Prior, J. L., Song, J., Pica, C. M., Leib, D. A. Bioluminescence Imaging Reveals Systemic Dissemination of Herpes Simplex Virus Type 1 in the Absence of Interferon Receptors. J. Virol. 77, 11082-11093 (2003).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , (1959).
- Kuehne, R. W., Pannier, W. L., Stephen, E. L. Indirect mouse model for the evaluation of potential antiviral compounds: results with Venezuelan equine encephalomyelitis virus. Antimicrob. Agents Chemother. 11, (1977).
- Lukaszewski, R. A., Brooks, T. J. G. Pegylated Alpha Interferon Is an Effective Treatment for Virulent Venezuelan Equine Encephalitis Virus and Has Profound Effects on the Host Immune Response to Infection. J. Virol. 74, 5006-5015 (2000).
