Summary
हम संभावित भ्रष्टाचार अस्वीकृति का ऊंचा जोखिम के बिना प्रत्यारोपण के बाद प्रतिरक्षादमन की वापसी तय करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि एक मूल्यवान नैदानिक परख का वर्णन है. परख विलंबित प्रकार अतिसंवेदनशीलता के सिद्धांतों का उपयोग करता है और प्राप्तकर्ता द्वारा घुड़सवार दोनों दाता विशिष्ट प्रेरक और विनियामक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का सटीक आकलन प्रदान करता है.
Protocol
1. लिम्फोसाइटों की तैयारी
- एसीडी (एसिड साइट्रेट dextrose) नलियों में रक्त ले लीजिए.
- मानक विधियों के अनुसार लिम्फोसाइट पृथक्करण मध्यम उपयोग कर ताजा मानव परिधीय रक्त से PBMC अलग.
- Contaminating प्लेटलेट्स निकालने के लिए पीबीएस के साथ PBMC तीन बार धोएं. प्लेटलेट्स ट्रांस विवो डीटीएच परख के साथ हस्तक्षेप करने के लिए पाए गए. PBMC तैयारी की अधिकतम स्वीकार्य प्लेटलेट संदूषण ≤ 1x10 7 / इंजेक्शन है.
- एक नजर लाल रक्त कोशिका संदूषण है, तो पहली बार धोने के बाद एसीके lysis बफर का उपयोग कर लाल सेल से सेल करते हैं. पीबीएस के साथ 2 बार धोने से एसीके बफर निकालें.
2. इतरप्रतिजन की तैयारी
- ऊपर दिखाए गए प्रक्रिया का उपयोग कर दाता परिधीय रक्त से PBMC अलग.
- 120x10 6 कोशिकाओं / एमएल के एक एकाग्रता (4x10 6 कोशिकाओं / 30 μl) में पीबीएस में Resuspend दाता PBMC.
- प्रोटीन को रोकने के लिए मिश्रण करने के लिए 1 माइक्रोन PMSF जोड़ेंगिरावट.
- एक 2 मिमी जांच sonicator साथ सात 1 सेकंड दालों का उपयोग सेल निलंबन Sonicate. (नोट: सामग्री ठंडा रखें और अत्यधिक बुलबुले से बचने झाग होता है, तो सेल निलंबन एक 2-3 मिनट के लिए बर्फ पर बैठते हैं..)
- एक hemocytometer का उपयोग कोशिकाओं की> 90% के विघटन की जाँच करें.
- प्रशीतित microfuge में 20 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 14,000 rpm पर मिश्रण अपकेंद्रित्र.
- एक नया 2.0 मिलीलीटर सुरक्षित लॉक ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला और प्रोटीन एकाग्रता का निर्धारण.
3. इंजेक्शन के लिए सेल तैयार
- 2.0 मिलीलीटर सुरक्षित ताला ट्यूबों में प्रत्येक इंजेक्शन विभाज्य 7x10 6 PBMC लिए.
- Microfuge में एक मिनट के लिए 6000 rpm पर अपकेंद्रित्र और सतह पर तैरनेवाला हटायें.
- पीबीएस में साथ या एंटीजन बिना कोशिकाओं Resuspend. पीबीएस के साथ 35 μl को इंजेक्शन मात्रा समायोजित करें. निम्नलिखित योजना इंजेक्शन के लिए प्रयोग किया जाता है:
नकारात्मक नियंत्रण: PBMC + पीबीएस
सकारात्मक नियंत्रण: PBMC + टीटी / डीटी (25 और म्यू; / छ इंजेक्शन)
प्रायोगिक विशिष्ट प्रतिजन उत्तर: PBMC + परीक्षण एजी (4-8 ग्राम / इंजेक्शन)
प्रायोगिक विशिष्ट प्रतिजन विनियमन: PBMC + परीक्षण एजी + टीटी / डीटी
4. पूर्व माप, इंजेक्शन, और बाद के माप
- Isoflurane के साथ CB17 SCID माउस anesthetize. एक वसंत लोड कैलीपर का उपयोग कर पीछे लुटेरा मोटाई उपाय. माप साइट लगातार रखने के लिए एक बेंचमार्क प्रदान करने के लिए, एक किनारे पैर की पिछले चलने पैड को छू के साथ, लुटेरा के केंद्र में कैलीपर रखो. गेज पढ़ने स्थिर हो गया है जब लुटेरा मोटाई दर्ज की गई है.
- धीरे धीरे 28 गेज सुई के साथ आधा सीसी इंसुलिन सीरिंज का उपयोग कर चूहों के पैरों के पंजों में subcutaneously सेल निलंबन इंजेक्षन. सुई पैर की उंगलियों की ओर इशारा करते हुए, और उठाव का सामना करना पड़ के साथ इंजेक्शन प्रदर्शन. (नोट: कोई रिसाव सुनिश्चित करें कि वहाँ).
- इंजेक्शन के बाद 18-24 घंटा, लुटेरा सूजन की isoflurane और दोहराने माप के साथ माउस anesthetize.
- Subtrलुटेरा सूजन मूल्य प्राप्त करने के बाद इंजेक्शन मूल्य से पहले इंजेक्शन के लिए प्रत्येक लुटेरा की मोटाई कार्य, 10 -4 इंच की इकाइयों में डेटा व्यक्त करता है. उपचार (PBMC + दाता इतरप्रतिजन, टीटी / डीटी, या दाता इतरप्रतिजन + टीटी / डीटी) से प्राप्त लुटेरा सूजन मूल्यों से नियंत्रण लुटेरा सूजन (PBMC + पीबीएस) घटाकर प्रतिजन विशेष शुद्ध सूजन की गणना. पीबीएस के लिए पृष्ठभूमि प्रतिक्रिया पर ≥ 25x10 -4 इंच के प्रतिजन टीटी / डीटी याद करने के लिए एक सकारात्मक नियंत्रण प्रतिक्रिया वैध माना जा करने के लिए परीक्षण के लिए आवश्यक है.
- निम्न सूत्र का उपयोग प्रत्येक इंजेक्शन का शुद्ध सूजन की तुलना द्वारा दाता एंटीजन की उपस्थिति में याद प्रतिक्रियाओं के निषेध का निर्धारण करते हैं:
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Representative Results
1. टीवी डीटीएच परख का उपयोग कर दाता प्रतिजन विशेष प्रतिक्रिया के लिए गुर्दा प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं का मूल्यांकन
गुर्दा प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में दाता प्रतिक्रियाशील सेलुलर प्रतिरोधक क्षमता का परीक्षण करने के लिए हम दाता एंटीजन अकेले या एक याद प्रतिजन टिटनेस toxoid (टीटी) के साथ साथ इन रोगियों से PBMC इंजेक्शन. एक सकारात्मक नियंत्रण कक्षों टीटी अकेले इंजेक्शन के साथ कर रहे थे. हम प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में देरी प्रकार अतिसंवेदनशीलता की तीन मुख्य पैटर्न (चित्रा 1) का पालन. सभी रोगियों को एजी (टीटी) याद करने के लिए दृढ़ता से जवाब दिया. रोगी # 62 दाता प्रतिजन और दाता प्रतिजन की उपस्थिति में प्रतिजन प्रतिक्रिया को याद करने के लिए एक उल्लेखनीय जुड़े हुए दमन (67%) के लिए एक कमजोर प्रतिक्रिया की विशेषता नियामक पैटर्न से पता चलता है. इस अंग allograft सहिष्णुता के साथ जुड़ा होना पाया गया है कि पैटर्न है. रोगी # 48 दर्शाती दाता को एक कमजोर प्रतिक्रिया की सुविधा है, लेकिन कोई जुड़े हुए दमन (या जुड़ा हुआ दमन <50%) है, जो एक nonregulatory पैटर्न,. यहपैटर्न अक्सर immunosuppressive दवाओं लेने के रोगियों में देखा गया है. हालांकि, अब भी पद प्रत्यारोपण immunosuppressive दवा प्राप्त कुछ रोगियों को अपने डीटीएच प्रतिक्रिया का दाता प्रतिजन से जुड़े दमन प्रदर्शित कर सकता है. रोगी # 8 दर्शाती दाता प्रतिजन के लिए एक उच्च प्रतिक्रिया और नहीं जुड़े हुए दमन की विशेषता दाता अवगत पैटर्न,. यह प्रतिक्रिया नैदानिक मामले के अध्ययन में भ्रष्टाचार अस्वीकृति 8 के साथ जुड़ा हुआ है.
2. गुर्दे प्रत्यारोपण में चिकित्सीय निगरानी में दाता विशिष्ट विनियमन की भूमिका
PBMC ITN507ST अवलोकन परीक्षण में दाखिला विषयों से, ("पहचान और सहिष्णु गुर्दा प्रत्यारोपण के रोगियों की यंत्रवत जांच") टीवी डीटीएच परख और दाता (या दाता का उपयोग कर दाता विशिष्ट अप्रत्यक्ष मार्ग टी प्रेरक और टी विनियामक प्रतिक्रिया के लिए परीक्षण किया गया एचएलए मिलान सरोगेट) प्रतिजन. जैसा कि चित्र 2A में दिखाया गया है, दाता एंटीजन को अप्रत्यक्ष मार्ग टी प्रेरक प्रतिक्रियाओं से पता चलता हैनामांकन समूहों में एक अलग स्पेक्ट्रम, लंबे समय से खारिज कर रहे हैं कि उन लोगों के लिए सहिष्णु हैं कि उन में से मरीजों की चिकित्सीय स्थिति पर्वतमाला के रूप में लुटेरा सूजन बढ़ जाती है. सहिष्णु प्राप्तकर्ताओं से PBMCs कम या खारिज व्यक्तियों से PBMCs जबकि कोई डीटीएच प्रतिक्रियाओं मजबूत सूजन प्रतिक्रियाओं ट्रिगर प्रेरित किया.
प्रतिरक्षा विनियमन गुर्दे allograft स्वीकृति के लिए एक महत्वपूर्ण तंत्र था. चित्रा 2B शो मध्यवर्ती के माध्यम से ज्यादातर की सीमा पर विनियामक प्रतिक्रियाओं में कमी (सहने) का प्रदर्शन लिंक्ड दमन परख करके विरोधी दाता अप्रत्यक्ष मार्ग टी विनियामक प्रतिक्रिया की माप (मोनो और एसआई) कम से कम सहिष्णु (सीआर) के रोगियों के लिए 14.
3. टीवी डीटीएच परख का उपयोग autoimmunity के निगरानी
एक होनहार क्षेत्र autoimmunity के निगरानी में टीवी डीटीएच परख के आवेदन पत्र है. बीओएस की एक प्रक्रिया में छोटे एयरवेज का रोड़ा fibro-obliterativeफेफड़ों प्रत्यारोपित, फेफड़ों प्रत्यारोपण की विफलता का सबसे आम कारण है.
इस प्रक्रिया में कोलेजन टाइप वी करने के लिए सेल की मध्यस्थता प्रतिरक्षा की भूमिका का परीक्षण करके, हम श्वासनलिकाशोथ obliterans सिंड्रोम (बीओएस) के विकास के उच्चतम रिश्तेदार जोखिम अपने में कोलेजन टाइप वी करने के लिए एक सकारात्मक टीवी डीटीएच प्रतिक्रिया विकसित की है जो रोगियों में मनाया गया था पाया परिधीय रक्त.
चित्रा 3 फेफड़ों प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं से PBMCs नहीं, बल्कि स्वस्थ नियंत्रण या कोलेजन चतुर्थ प्रतिक्रियाशील गुडपास्चर सिंड्रोम रोगियों से गुर्दे के प्रत्यारोपण के बाद, अक्सर कोलेजन वी प्रतिक्रियाशील 15 थे.
4. ट्यूमर प्रतिरक्षा विज्ञान में आवेदन
ट्रांस विवो डीटीएच टीकाकरण उपचार के लिए प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों को प्राथमिकता देने के लिए कैंसर अनुसंधान के क्षेत्र में नई संभावनाएं खोल रहा है. विनियामक टी कोशिकाओं को कैंसर के विकास और प्रगति में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के बाद से, हम PBMC की जेट परीक्षण करने के लिए टीवी डीटीएच का इस्तेमाल कियाएक डीएनए वैक्सीन एन्कोडिंग प्रोस्टेटिक एसिड फॉस्फेट (पीएपी) के साथ इलाज के कैंसर के रोगियों से है. हम विशिष्ट प्रतिजन नियामक गतिविधियों के टीकाकरण के जवाब में हासिल किया जा रहा है या नहीं यह निर्धारित करने के लिए प्रतिजन याद करने के लिए प्रतिक्रिया की दर्शक दमन इस्तेमाल किया. हम पीएपी विशेष विनियामक टी कोशिकाओं कुछ प्रोस्टेट कैंसर के रोगियों में अनायास उठता है कि, टीकाकरण के दौरान जारी रहती है और पीएपी विशिष्ट प्रेरक प्रतिक्रियाओं के बाद टीकाकरण का पता लगाने को रोकने पाया. कुछ रोगियों में हम टीकाकरण से पहले पीएपी विशेष विनियमित टी सेल प्रतिक्रिया की पहचान की. पीएपी के लिए विशिष्ट पूर्व मौजूदा विनियामक टी कोशिकाओं टीकाकरण के बाद प्रतिजन विशेष Th1 प्रकार प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया विकसित करने में असमर्थता के साथ जुड़ा हो सकता है. वैकल्पिक रूप से पीएपी के लिए पहले से मौजूद विनियामक टी सेल प्रतिक्रिया कई प्रतिरक्षण निम्नलिखित प्रेरक प्रतिक्रियाओं के विकसित होने की संभावना रोगियों की पहचान करेगा. यह व्यक्ति को प्राथमिकता या बाहर करने के लिए एक साधन के सुझाव है कि शायद ही किसी भी तरह से, इस परख, एक महत्वपूर्ण टिप्पणी प्रदान करता हैप्रतिजन विशेष टीका मूल्यांकन 17 से idual रोगियों.
चित्रा 1. विलंबित प्रकार hypersensitivity के तीन मुख्य पैटर्न (डीटीएच) के उदाहरण गुर्दा प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में पाया. रोगी PBMCs याद प्रतिजन (टीटी), दाता एंटीजन या तो साथ या दाता + याद प्रतिजन दोनों साथ CB17 SCID चूहों के पैरों के पंजों में इंजेक्ट किया गया. दिखाएँ पृष्ठभूमि पर शुद्ध सूजन प्रतिक्रिया है.
चित्रा 2. . अप्रत्यक्ष मार्ग टी सेल विश्लेषण विषयों पांच समूहों में दाखिला: (सहने) चिकित्सकीय सहिष्णु समान जुड़वां, स्टेरॉयड monotherapy(मोनो), मानक प्रतिरक्षादमन (एसआई) और पुराने अस्वीकृति (सीआर) (बी) टीवी डीटीएच परख द्वारा टी प्रेरक प्रतिक्रियाओं (ए) और टी विनियामक प्रतिक्रिया के लिए जांच की गई. सभी पैनलों: प्रत्येक व्यक्तिगत (प्रतीक) का विषय है और समूह चतुर्थकों साथ (क्षैतिज रेखा) औसत से व्यक्तिगत परिणाम दिखाए जाते हैं. समूहों के बीच महत्वपूर्ण अंतर दिखाया जाता है, * पी <0.05, ** पी <0.01 और *** 0.001 <पी, # पी = 0.04, # # = पी 0.03, # # # = पी 0.008.
चित्रा 3. टीवी डीटीएच परख द्वारा कोलेजन टाइप V विशिष्ट autoimmunity के मापन. टीवी डीटीएच प्रतिक्रियाओं सामान्य स्वस्थ नियंत्रण, जीपीएस या फेफड़ों प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं के साथ गुर्दा प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं से प्राप्त PBMCs के द्वारा. सभी 3 समूहों, प्रतिजन याद करने के लिए कर्नल (सकारात्मक प्रतिक्रियाओं (≥ 25x10 -4 इंच शुद्ध सूजन) था मैंमैं), जोड़ कार्टिलेज के लिए विशिष्ट fibrilar कोलेजन, रोगियों या नियंत्रण में एक टीवी डीटीएच जवाब नहीं आया. जीपीएस के साथ गुर्दे प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं कर्नल (चतुर्थ) के लिए प्रतिक्रियाओं सूजन मतलब उठाया था. फेफड़े का प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं कर्नल (चतुर्थ) का जवाब नहीं दिया, लेकिन कर्नल (वी) का जवाब था.
4 चित्रा. ट्यूमर प्रेरित Immunoregulation का आकलन करने के लिए टीवी डीटीएच परख का प्रयोग करें. प्रोस्टेट कैंसर रोगियों से PBMC प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए) प्रोस्टेटिक एसिड फॉस्फेट (पीएपी) के साथ अकेले या याद प्रतिजन टीटी / डीटी के साथ और एक नियंत्रण के रूप में इंजेक्शन थे के साथ या बिना इंजेक्ट किया गया था प्रतिजन टीटी / डीटी याद करते हैं. पीएपी के इंजेक्शन + पीएसए के सह प्रशासन टीटी / डीटी याद प्रतिजन के लिए एक डीटीएच प्रतिक्रिया को दबाने के लिए सक्षम नहीं था के रूप में टीटी / डीटी, पीएपी प्रतिजन विशेष विनियामक कोशिकाओं की पहचान की.
चित्रा 5. टीवी डीटीएच परख के reproducibility. Cryopreserved कोशिकाओं 2007/01/15 पर leukapheresis द्वारा प्राप्त, thawed पीबीएस के साथ धोया, पीबीएस या EBV या P37-ते + EBV (स्वयं पेप्टाइड) या P37-एमए + EBV (दाता पेप्टाइड) के साथ मिलाया गया और पैरों के पंजों में इंजेक्शन. 2008/07/29, 2010/02/23, 2011/09/01, 10/11/2011, 2011/12/15: प्रकोष्ठों निम्नलिखित समय अंक में परीक्षण किया गया.
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Discussion
ट्रांस विवो डीटीएच परख प्रत्यारोपण, कैंसर और autoimmune रोगियों में सेल की मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं का आकलन करने में एक संभावित नैदानिक आवेदन के साथ एक उपन्यास नैदानिक परीक्षण है. यह याद टी प्रेरक प्रतिक्रियाओं की निगरानी में उपयोगी ही नहीं है क्योंकि यह मूल्यवान है, लेकिन यह भी टी विनियामक प्रतिक्रियाओं का पता लगा सकते हैं. मानव डीटीएच विनियमन पता लगाने के लिए एक विश्वसनीय तरीका monotherapy के या सहिष्णुता परीक्षण के लिए उम्मीदवार हैं जो रोगियों में प्रतिरक्षादमन वापसी की सुरक्षा की भविष्यवाणी कर सकते हैं.
टीवी डीटीएच MHC की allorecognition की अप्रत्यक्ष मार्ग का पता लगाने के लिए बहुत संवेदनशील है. हालांकि टीवी डीटीएच बरकरार दाता MHC अणुओं के खिलाफ प्रत्यक्ष alloresponse पता लगाने के लिए संशोधित किया जा सकता है. डीटीएच के दाता प्रतिजन से जुड़े दमन का पता लगाने के लिए, एक दाता एचएलए वर्ग मैं या द्वितीय श्रेणी व्यक्त EBV से LCL में कोशिकाओं रोगी PBMC साथ coinjected किया जा सकता है. EBV से LCL डीटीएच परख में प्रतिजन के एक स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया गया है, कोशिकाओं 10,000 रेड के साथ गामा विकिरणित थे, और 200,000 कोशिकाओं थे सहSCID चूहों की लुटेरा में PBMC के साथ इंजेक्शन.
टीवी डीटीएच के विकास के दौरान हम कई स्थितियों इस परख को प्रभावित कर सकते हैं. सबसे महत्वपूर्ण एक दर्शक दमन का पता लगाने के लिए आवश्यकता है. हम चुनौती साइट और माउस दत्तक मेजबान के immunocompetence दोनों, सह स्थानीय दाता प्रतिजन के जवाब में एक याद डीटीएच का अवरोध का पता लगाने के क्रम में टीवी डीटीएच परीक्षण की संवेदनशीलता को सीमित करने के लिए महत्वपूर्ण कारक हैं जो सबूत मुहैया कराए. PBMC पैरों के पंजों, और न कान में इंजेक्शन, और केवल immunodeficient, असुरक्षित नहीं चूहों 3 में थे जब सहिष्णु प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं से PBMC केवल दर्शक दमन मध्यस्थता.
सभी assays की तरह टीवी डीटीएच परीक्षण ताकत और कमजोरियों है. टीवी डीटीएच परख की जबरदस्त लाभ निम्नलिखित शामिल हैं: 1) बहुत संवेदनशील है और मज़बूती से मानव विनियामक टी कोशिकाओं, 2) का पता लगा सकते हैं कि यह उनके कार्य से विनियामक टी कोशिकाओं का पता लगाता है नहीं द्वारा टीवारिस फेनोटाइप, 3) यह गु -1 और गु -17 प्रेरक प्रतिक्रियाओं 4) कच्चे तेल की सेल lysates दाता प्रतिजन 5) इस परख उच्च reproducibility / स्थिरता (चित्रा 5) प्रस्तुत करता है के लिए रोगियों को सुग्राही बिना नियमन का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, दोनों का पता लगाता है. नुकसान कर रहे हैं: 1) यह इंजेक्शन प्रति PBMC की एक अपेक्षाकृत बड़ी संख्या की आवश्यकता है, 2) तकनीक विशेष रूप से दर्शक दमन परख में, व्यापक प्रशिक्षण की आवश्यकता है.
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Disclosures
इस पांडुलिपि के लेखकों का खुलासा करने के लिए ब्याज की कोई संघर्ष है.
Acknowledgments
लेखकों प्रत्यारोपण प्राप्तकर्ताओं में विनियमित डीटीएच प्रतिक्रिया के बारे में हमारी समझ के विकास के लिए कर रहा हूँ Vanbuskirk के योगदान को स्वीकार करना होगा. इस काम एनआईएच अनुदान PO1AI084853 और R01AI066219-06 समर्थित, और यूरोपीय संघ द्वारा प्रायोजित एक अध्ययन के द्वारा किया गया था.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ACD tube for blood collection | BD | 02-684-26 | |
| Lymphocyte Separation Medium | Cellgro | 25-072-CV | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Cellgro | 21-031-CM | Without calcium & magnesium |
| ACK Lysis Buffer | BioWhittaker | 10-548E | |
| TT/DT or EBV | Sanofi Pasteur Inc./ Meridian Life Science, Inc. | TT/DT 25 μg/injection EBV 8 μg/injection | |
| Protease inhibitor PMSF | Sigma-Aldrich | 78830 | |
| Eosine for cell count | Sigma-Aldrich | E-6003 | |
| Alloantigen | Purified HLA antigens, synthetic allopeptides can be used instead of donor cell-free lysates | ||
| 50 ml sterile centrifuge tubes | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| 10 ml pipettes and pipettor | BD Falcon | 13-675-20 | |
| 2 ml safe-lock tubes | Costar | 3213 | |
| 1000 μl, 100 μl , 10 μl pipettes with sterile tips | |||
| Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
| Full size centrifuge and microfuge | Beckman Coulter/Eppendorf | ||
| 1/2cc or 1cc insulin syringes | Becton Dickinson | 14-826-79 | 28 gauge |
| Vibracell sonicator | Divtech Equipment Co. Sonocs Materials Inc | 2 mm probe | |
| Dial thickness gauge | Mitutoyo, Japan | ||
| SCID mice | Harlan | ||
| Isoflurane | Piramal Healthcare | Inhalant anesthesia |
References
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