Summary
Cecum पर cecal या चमड़े के नीचे ट्यूमर का एक टुकड़ा की दीवार प्रत्यारोपण में एक कैंसर कोशिका निलंबन के इंजेक्शन: दो तकनीकों इस मॉडल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस मॉडल कोलोरेक्टल कैंसर के प्राकृतिक प्रगति का अध्ययन करने और कोलोरेक्टल कैंसर के खिलाफ नया चिकित्सात्मक एजेंटों के परीक्षण के लिए उपयोगी है.
Abstract
पारंपरिक उपचर्म ट्यूमर मॉडल से कम कोलोरेक्टल कैंसर के अध्ययन के लिए आदर्श है. कोलोरेक्टल कैंसर के Orthotopic माउस मॉडल है, जो कैंसर कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक स्थान में बढ़ रही सुविधा, उच्च निष्ठा के साथ मानव रोग को दोहराने. दो तकनीकों के लिए इस मॉडल स्थापित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. दोनों तकनीकों के समान हैं और cecum के जोखिम के लिए माउस संज्ञाहरण और laparotomy की आवश्यकता है. एक तकनीक cecal दीवार में कोलोरेक्टल कैंसर सेल निलंबन के इंजेक्शन शामिल है. कैंसर की कोशिकाओं को पहली बार संस्कृति में बड़े हो रहे हैं, काटा subconfluent जब और एक एकल कक्ष निलंबन के रूप में तैयार किया. कक्षों की एक छोटी मात्रा धीरे - धीरे इंजेक्शन के रिसाव से बचने के. अन्य तकनीक cecum पर चमड़े के नीचे ट्यूमर का एक टुकड़ा का प्रत्यारोपण शामिल है. एक पहले से स्थापित उपचर्म कोलोरेक्टल ट्यूमर के साथ एक माउस और euthanized है और ट्यूमर बाँझ तकनीक का उपयोग करने के लिए निकाल दिया जाता है. ट्यूमर टुकड़ा दूसरे माउस को प्रत्यारोपण के लिए छोटे टुकड़ों में विभाजित है. प्रत्यारोपण करने से पहले, cecal दीवार हल्के ट्यूमर सेल घुसपैठ की सुविधा क्षतिग्रस्त है. प्राथमिक ट्यूमर और जिगर metastases के विकास के समय तकनीक, सेल लाइन, और माउस इस्तेमाल किया प्रजातियों के आधार पर अलग अलग होंगे. इस orthotopic माउस मॉडल कोलोरेक्टल कैंसर के प्राकृतिक प्रगति का अध्ययन करने और कोलोरेक्टल कैंसर के खिलाफ नया चिकित्सात्मक एजेंटों के परीक्षण के लिए उपयोगी है.
Protocol
I. सेल तैयार
- कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं संस्कृति में बड़े हो रहे हैं और काटा subconfluent जब.
- एक एकल कक्ष निलंबन फॉस्फेट में तैयार है खारा buffered और बर्फ पर रखा.
द्वितीय. ट्यूमर तैयारी
- एक पहले से स्थापित उपचर्म कोलोरेक्टल ट्यूमर के साथ एक माउस euthanized है.
- चमड़े के नीचे ट्यूमर बाँझ तकनीक का उपयोग कर निकाल दिया जाता है और 2-3 मिमी टुकड़ों में विभाजित
- ट्यूमर टुकड़े फॉस्फेट में रखा जाता है बर्फ पर खारा buffered.
III. माउस तैयार
नोट: हमारी प्रयोगशाला में हम के लिए माउस anesthetize isoflurane साँस उपयोग, वैकल्पिक रूप से, एक इंजेक्शन anesthetics का उपयोग करने के लिए एक ही प्रभाव को प्राप्त कर सकते हैं
- संज्ञाहरण की गहराई पैर के अंगूठे चुटकी का उपयोग मूल्यांकन किया है. वहाँ कोई पैर के अंगूठे चुटकी के साथ पलटा वापस लेने चाहिए.
- एंटीबायोटिक्स इस बिंदु पर दी जा सकती है है.
- anesthetized माउस, जो पहले मुंडा था ठीक से तैनात है.
- पेट एक betadine समाधान के साथ तैयार है.
- पेट और शल्य साइट एक बाँझ फैशन में लिपटी हैं.
चतुर्थ. Laparotomy
- एक छोटा सा निक त्वचा में किया जाता है
- पेट की दीवार मांसलता समझा है और ऊपर उठा लिया
- उदर गुहा में प्रवेश किया है और कैंची की एक एकल ब्लेड अंतर पेट सामग्री धक्का दूर करने के लिए प्रयोग किया जाता है
- चीरा 2-3 सेमी करने के लिए बढ़ाया है
Cecum के वी. एक्सपोजर
- अपने अंधे समाप्त होने के पाउच के साथ cecum की पहचान की है और exteriorized
- cecum माउस के एक पूर्व में कटौती, बाँझ धुंध का उपयोग कर आराम से अलग है
- गर्म खारा cecum नम रखने के लिए प्रयोग किया जाता है
छठी. कक्ष के Cecal दीवार में इंजेक्शन
- एक 27 जी या महीन सुई cecal दीवार में कक्षों की एक 50 μL मात्रा इंजेक्षन करने के लिए प्रयोग किया जाता है
- सुई हटा दिया है
- इंजेक्शन साइट के लिए कोई रिसाव सुनिश्चित करने के लिए निरीक्षण किया है
- cecum उदर गुहा में लौट रहा है
सातवीं. ट्यूमर के cecum पर ट्रांसप्लांटेशन
नोट: cecal दीवार में कोशिकाओं को इंजेक्शन के अलावा, एक वैकल्पिक दृष्टिकोण cecum पर ट्यूमर प्रत्यारोपण
- 8 सिलाई का एक आंकड़ा 6-0 या 7-0 आकार सीवन का उपयोग cecum पर रखा गया है
- cecal दीवार क्षतिग्रस्त हल्के है
- फिर, ट्यूमर टुकड़ा तैनात है
- सिलाई नीचे बंधा हुआ है
- cecum उदर गुहा में लौट रहा है
आठवीं. माउस पेट दीवार क्लोजर और रिकवरी
- माउस पेट की दीवार तीन बाधित 3-0 या 4-0 आकार सीवन का उपयोग कर टांके का उपयोग करने के लिए बंद कर दिया है
- वैकल्पिक रूप से, एक सरल चल रहे सिलाई का उपयोग कर सकते हैं
- पोस्ट ऑपरेटिव दर्दनाशक दवाओं और इस बिंदु पर एक तरल पदार्थ सांस दी जा सकती है है
- माउस संज्ञाहरण से उबरने की अनुमति दी है.
नोट: साँस anesthetics के साथ यह आमतौर पर 30 सेकंड लेता है
ग्यारहवीं. प्राथमिक ट्यूमर और जिगर की मेटास्टेसिस परिणाम -
प्राथमिक ट्यूमर - बगल में दिखाया (ए) और neovascularization के सबूत (बी) के साथ, एच एंड ई धुंधला पर, ट्यूमर स्थानीय स्तर पर आक्रामक रहे हैं (सी)
जिगर metastases - दिखाया पूर्व vivo (D)
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Discussion
हालांकि माउस उपचर्म ट्यूमर मॉडल स्थापित करने और निगरानी के लिए आसान कर रहे हैं, यह स्पष्ट है कि इस मॉडल में कोलोरेक्टल कैंसर के मूल शारीरिक साइट नकल नहीं कर सकते. Microenvironment में अंतर के कारण, कोलोरेक्टल कैंसर कोशिकाओं को त्वचा के नीचे बढ़ रहा है उनके phenotype परिवर्तन और लगभग हमेशा 1,2 करने के लिए प्रगति और metastasize करने में विफल करने के लिए दिखाया गया है. वास्तव में, उपचार के लिए ट्यूमर प्रतिक्रिया नाटकीय रूप से भिन्न है कि कैंसर की कोशिकाओं को एक अस्थानिक (चमड़े के नीचे) बनाम orthotopic 3 स्थान में प्रत्यारोपित कर रहे हैं पर निर्भर कर सकते हैं . कोलोरेक्टल कैंसर के Orthotopic माउस मॉडल है, जो कैंसर कोशिकाओं को उनके प्राकृतिक स्थान में बढ़ रही सुविधा, उच्च निष्ठा के साथ मानव रोग को दोहराने. दो तकनीकों इस मॉडल स्थापित करने में अद्वितीय फायदे और नुकसान है. Cecal दीवार में एक सेल निलंबन इंजेक्शन कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं को जो पहले किया गया है इन विट्रो वातावरण में एक में बढ़ती परिचय और यकीनन सजातीय हैं. कक्ष संस्कृति में कई मार्ग के बाद आक्रामक या metastatic क्षमता कम हो सकता है. चमड़े के नीचे ट्यूमर का एक टुकड़ा का प्रत्यारोपण कि vivo में स्थापित किया गया है कैंसर की कोशिकाओं के एक अधिक विषम जनसंख्या का परिचय. हालांकि, ट्यूमर stromal कोशिकाओं होते हैं और अक्सर परिगलित भाग है जो इस मॉडल (निजी संचार, मैं Fidler, एमडी एंडरसन) की निरंतरता को प्रभावित कर सकता है. एक तकनीकी दृष्टि से, हमारी प्रयोगशाला में पाया गया है कि cecal दीवार में एक सेल निलंबन के इंजेक्शन और अधिक कठिन है और intraluminal इंजेक्शन और इंजेक्शन के बाद रिसाव के जोखिम रहता है. दिलचस्प है, मलाशय के कैंसर के एक orthotopic माउस मॉडल का वर्णन किया गया है कि माउस laparotomy 4 की आवश्यकता नहीं है . चूहे anesthetized हैं और मलाशय mucosa डिजिटल दबाव के साथ prolapsed है. एकल कक्ष निलंबन में कोलोरेक्टल कैंसर की कोशिकाओं की एक छोटी मात्रा submucosally इंजेक्शन है. प्राथमिक, आक्रामक मलाशय के कैंसर चूहों में इंजेक्शन के बाद एक सप्ताह के रूप में जल्दी के रूप में विकसित, तथापि, चूहों में से कोई भी जिगर metastases के विकास और लेखकों फेफड़ों metasases की आवृत्ति पर कोई टिप्पणी नहीं की.
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Acknowledgments
सर्जरी विभाग, विश्वविद्यालय कैलिफोर्निया, सैन फ्रांसिस्को
रेमंड शाहीन, एमडी
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
