Summary
Twee technieken kunnen worden gebruikt om dit model te stellen: injectie van een kankercel suspensie in de blindedarmkeutels muur of transplantatie van een stukje van subcutane tumor op de blindedarm. Dit model is handig voor het bestuderen van de natuurlijke progressie van colorectale kanker en testen van nieuwe therapeutische middelen tegen colorectale kanker.
Abstract
Het traditionele subcutane tumor model is minder dan ideaal voor het bestuderen van colorectale kanker. Orthotope muismodellen van colorectale kanker, die kankercellen groeien in hun natuurlijke plaats kenmerk, repliceren de menselijke ziekte met high-fidelity. Twee technieken kunnen worden gebruikt om dit model vast te stellen. Beide technieken zijn vergelijkbaar en vereisen muis verdoving en laparotomie voor blootstelling van de blindedarm. Een techniek betreft injectie van een colorectale kanker celsuspensie in de blindedarmkeutels muur. Kankercellen worden eerst gekweekt in cultuur, geoogst wanneer subconfluent en voorbereid als een enkele celsuspensie. Een klein volume van de cellen wordt langzaam geïnjecteerd om lekkage te voorkomen. De andere techniek bestaat transplantatie van een stukje onderhuidse tumor op de blindedarm. Een muis met een eerder vastgestelde onderhuidse colorectale tumor is gedood en de tumor wordt verwijderd met behulp van steriele techniek. De tumor stuk is verdeeld in kleine stukjes voor transplantatie naar een andere muis. Voorafgaand aan de transplantatie, is de blindedarmkeutels muur lichtjes beschadigd tumorcellen infiltratie mogelijk te maken. De tijd om het ontwikkelen van primaire tumoren en levermetastasen zal variëren afhankelijk van de techniek, cellijn, en gebruikt muizensoorten. Dit orthotope muis model is handig voor het bestuderen van de natuurlijke progressie van colorectale kanker en testen van nieuwe therapeutische middelen tegen colorectale kanker.
Protocol
I. celpreparaat
- Colorectale kanker cellen worden gekweekt in cultuur en geoogst wanneer subconfluent.
- Een enkele celsuspensie wordt bereid in een fosfaat gebufferde zoutoplossing en op ijs bewaard.
II. Tumor Voorbereiding
- Een muis met een eerder vastgestelde onderhuidse colorectale tumor is gedood.
- De subcutane tumor wordt verwijderd met behulp van steriele techniek en verdeeld in 2-3 mm stukken
- De tumor stukken worden bewaard in fosfaat gebufferde zoutoplossing op ijs.
III. Muis Voorbereiding
Opmerking: In ons laboratorium hebben we gebruik van inhalatie isofluraan om de muis te verdoven, als alternatief, kan men gebruiken injecteerbare anesthetica om hetzelfde effect te bereiken
- De diepte van de anesthesie wordt beoordeeld op basis teen knijpen. Er mag geen te trekken reflex met teen knijpen.
- Antibiotica kunnen gegeven worden op dit punt.
- De verdoofde muis, die voorheen was geschoren, goed gepositioneerd.
- De buik is voorbereid met een Betadine-oplossing.
- De buik en chirurgische site zijn gedrapeerd in een steriele manier.
IV. Laparotomie
- Een kleine inkeping gemaakt in de huid
- De buikwand musculatuur is gegrepen en opgetild
- De buikholte wordt ingevoerd en een blad van de schaar wordt gebruikt om weg te duwen van de intra-abdominale inhoud
- De incisie wordt uitgebreid tot 2-3 cm
V. Blootstelling van de blindedarm
- De blindedarm met zijn blinde einde zakje is geïdentificeerd en exteriorized
- De blindedarm is geïsoleerd van de rest van de muis met behulp van een pre-cut, steriel gaasje
- Warm zoutoplossing wordt gebruikt om de blindedarm vochtig te houden
VI. Injectie van cellen in de blindedarmkeutels Muur
- A 27 G of fijnere naald wordt gebruikt om een 50 ul volume van de cellen te injecteren in de blindedarmkeutels muur
- De naald wordt verwijderd
- De plaats van injectie is geïnspecteerd om geen lekkage zorgen
- De blindedarm is teruggekeerd naar de buikholte
VII. Transplantatie van Tumor op de blindedarm
Opmerking: In aanvulling op het injecteren van cellen in de blindedarmkeutels muur, een alternatieve benadering is van de tumor transplantatie op de blindedarm
- Een cijfer van 8 steek wordt geplaatst op de blindedarm met 6-0 of 7-0 middelgrote hechting
- De cecal muur is licht beschadigd
- Vervolgens wordt de tumor stuk geplaatst
- De steek is vastgebonden
- De blindedarm is teruggekeerd naar de buikholte
VIII. Muis buikwand Sluiting en herstel
- De muis buikwand wordt gesloten met behulp van drie onderbroken steken met behulp van 3-0 of 4-0 middelgrote hechting
- Als alternatief kan men gebruik maken van een eenvoudige rijgsteek
- Post-operatieve pijnstillers en een vloeistof bolus kan worden gegeven op dit punt
- De muis is toegestaan om te herstellen van anesthesie.
Opmerking: Bij inhalatie-anesthetica Dit duurt meestal 30 seconden
IX. Resultaten - Primaire Tumor en levermetastasen
Primaire Tumor - getoond in situ (A) en met tekenen van neovascularisatie (B), op H & E kleuring, tumoren zijn lokaal invasief (C)
Levermetastasen - getoond ex vivo (D)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hoewel de muis onderhuidse tumor modellen zijn eenvoudig vast te stellen en te controleren, is het duidelijk dat dit model niet kan repliceren de oorspronkelijke anatomische site van colorectale kanker. Door het verschil in micro-omgeving, hebben colorectale kankercellen groeien onder de huid is aangetoond dat hun fenotype te veranderen en bijna altijd geen vooruitgang en metastaseren 1,2. In feite kan de tumor respons op de behandeling sterk variëren, afhankelijk van de vraag of kankercellen worden geïmplanteerd in een ectopische (subcutaan) versus orthotope locatie 3. Orthotope muismodellen van colorectale kanker, die kankercellen groeien in hun natuurlijke plaats kenmerk, repliceren de menselijke ziekte met high-fidelity. De twee technieken om dit model tot stand hebben unieke voordelen en nadelen. Injectie van een celsuspensie in de blindedarmkeutels muur introduceert colorectale kanker cellen, die zijn eerder in een groeiende in-vitro-omgeving en zijn misschien wel homogeen. Cellen kunnen een verminderde invasieve of metastatisch potentieel na een aantal passages in cultuur. Transplantatie van een stukje onderhuidse tumor introduceert een meer heterogene populatie van kankercellen die zijn vastgesteld in vivo. Echter, tumoren bevatten stromale cellen en hebben vaak necrotische delen dat de samenhang van dit model (persoonlijke communicatie, I. Fidler, MD Anderson) kunnen beïnvloeden. Vanuit een technisch oogpunt, is ons laboratorium gevonden dat de injectie van een celsuspensie in de blindedarmkeutels muur is moeilijker en draagt de risico's van intraluminale injectie en lekkage na de injectie. Interessant is dat een orthotopische muismodel van rectale kanker is beschreven dat niet de muis laparotomie 4 vereisen. Muizen zijn verdoofd en het rectale slijmvlies is verzakt met digitale druk. Een klein volume van colorectale kanker cellen in enkele celsuspensie is submucosaal geïnjecteerd. Primaire, invasieve rectale kanker te ontwikkelen in muizen al een week na de injectie, maar geen van de muizen ontwikkelen levermetastasen en de auteurs geen commentaar geven op de frequentie van de long metasases.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Afdeling Heelkunde, Universiteit van Californië, San Francisco
Raymond Shaheen, MD
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture media and components | will vary depending on cell line used | ||
| Phosphate Buffered Saline | BioWhittaker | 17-512F | also sold by a number of other vendors |
| 15 mL centrifuge tubes, polypropylene | Corning | 430790 | |
| 6 well plates with lid | BD Biosciences | 353046 | |
| Iris forceps, straight, serrated tips | World Precision Instruments, Inc. | 15914 | best to have a pair of these instruments |
| Iris dissecting scissors, straight, sharp | World Precision Instruments, Inc. | 14393 | |
| Needle Holder (regular) | World Precision Instruments, Inc. | 14109 | |
| Needle Holder (Castroviejo) | World Precision Instruments, Inc. | 14137 | |
| Cidex Plus | World Precision Instruments, Inc. | 7364 | instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex |
| 6-0 or 7-0 suture | for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| 3-0 or 4-0 suture | for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF | ||
| Anesthetic machine / Isoflurane | J.A. Baulch and Associates | 3206 | also sold by a number of other vendors |
| Heating Pad, disposable, 6" x 6" | Prism Technologies | 20419 | |
| Tape, orange, 13 mm x 13 m | Fisher Scientific | 15901F | for restraining anesthetized mouse |
| Pro-Cord/Cordless Trimmer | Oster Professional Products | 78997-010 | for shaving mouse fur |
| Betadine | Fisher Scientific | 19-027132 | may also be purchased at any medical supply store |
| 2 x 2 gauze, 3-ply | Johnson & Johnson | 7635 | may also be purchased at any medical supply store |
| Sterile Field, Barrier, 16" x 29" | Johnson & Johnson | 0905 | may also be purchased at any medical supply store |
| Cotton tipped applicators, 6" | Fisher Scientific | 14-960-3Q | may also be purchased at any medical supply store |
| Syringe, 10 cc, Luer lock tip | BD Biosciences | 309604 | |
| Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip | BD Biosciences | 309602 | |
| 27 1/2 G needle | BD Biosciences | 305109 | |
| 30 G needle | BD Biosciences | 305106 |
References
- Heijstek, M. W., Kraneburg, O., Rinkes Borel, I. H. Mouse models of colorectal cancer and liver metastases. Dig Surg. 22, 16-25 (2005).
- Kobaek-Larsen, M., Thorup, I., Diederichsen, A., Fenger, C., Hoitinga, M. R. Review of colorectal cancer and its metastases in rodent models: comparative aspects with those in humans. Comp Med. 50, 16-26 (2000).
- Wilmanns, C., Fan, D., O'Brian, C. A., Bucana, C. D., Fidler, I. J. Orthotopic and ectopic organ environments differentially influence the sensitivity of murine colon carcinoma cells to doxorubicin and 5-fluorouracil. Int J Cancer. 52, 98-104 (1992).
- Kashtan, H., Rabau, M., Mullen, J. B., Wong, A. H. C., Roder, J. C., Shiptz, B., Stern, H. S., Gallinger, S. Intra-rectal injection of tumor cells: a novel animal model of rectal cancer. Surg Oncol. 1, 251-256 (1992).
