Modelo de ratón ortotópico de cáncer colorrectal

Summary

Dos técnicas se pueden utilizar para establecer este modelo: la inyección de una suspensión de células de cáncer en la pared del ciego o el trasplante de un trozo de tumor subcutáneo en el ciego. Este modelo es útil para el estudio de la evolución natural del cáncer colorrectal y ensayo de nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer colorrectal.

Abstract

El modelo tradicional por vía subcutánea tumor es menos que ideal para estudiar el cáncer colorrectal. Ortotópico modelos de ratón de cáncer colorrectal, que cuentan con las células cancerosas que crecen en su ubicación natural, reproducir enfermedades humanas con alta fidelidad. Dos técnicas se pueden utilizar para establecer este modelo. Ambas técnicas son similares y requieren de anestesia del ratón y la laparotomía para la exposición del ciego. Una técnica consiste en la inyección de una suspensión de células cancerosas de colon en la pared del ciego. Las células cancerosas son los primeros en cultivo, cosecha cuando subconfluentes y preparada como una suspensión de células individuales. Un pequeño volumen de las células se inyectaron lentamente para evitar fugas. La otra técnica consiste en el trasplante de un trozo de tumor subcutáneo en el ciego. Un ratón con un tumor establecido con anterioridad por vía subcutánea colorrectal es la eutanasia y el tumor se extirpa mediante una técnica estéril. La pieza del tumor se divide en trozos pequeños para el trasplante a otro ratón. Antes del trasplante, la pared del ciego está ligeramente dañado para facilitar la infiltración de células tumorales. El tiempo necesario para el desarrollo de los tumores primarios y metástasis hepáticas pueden variar dependiendo de la técnica, la línea celular, y las especies de ratón utilizada. Este modelo de ratón ortotópico es útil para estudiar la evolución natural del cáncer colorrectal y ensayo de nuevos agentes terapéuticos contra el cáncer colorrectal.

Protocol

I. Preparación de la célula

1. Las células de cáncer colorrectal en un cultivo y cosecha, cuando subconfluentes.
2. Una suspensión de células individuales se prepara en tampón fosfato salino y mantener en hielo.

II. Preparación del tumor

1. Un ratón con un tumor establecido con anterioridad por vía subcutánea colorrectal es la eutanasia.
2. El tumor se elimina por vía subcutánea mediante una técnica estéril y se divide en trozos 2-3 mm
3. Las piezas de tumor se mantienen en solución salina de fosfato en el hielo.

III. Preparación del ratón

Nota: En nuestro laboratorio utilizamos isoflurano inhalado para anestesiar el ratón, como alternativa, se puede utilizar anestésicos inyectables para lograr el mismo efecto

1. La profundidad de la anestesia se evaluó mediante una pizca dedo del pie. No debe haber retirar reflejo con el sujetador del pie.
2. Se pueden administrar antibióticos en este momento.
3. El ratón anestesiado, el cual fue previamente afeitado, está colocada adecuadamente.
4. El abdomen está preparado con una solución de betadine.
5. El abdomen y el lugar de la cirugía están cubiertas de una manera aséptica.

IV. Laparotomía

1. Una pequeña incisión se hace en la piel
2. La musculatura de la pared abdominal es agarrado y levantado
3. La cavidad abdominal se introduce y una sola hoja de la tijera se utiliza para empujar el contenido intra-abdominal de distancia
4. La incisión se extiende a 2-3 cm

V. La exposición del ciego

1. El ciego con su bolsa de poner fin a ciegas se identifica y se exterioriza
2. El ciego está aislado del resto del ratón utilizando una pre-cortado, gasa estéril
3. Solución salina caliente se utiliza para mantener la humedad del ciego

VI. La inyección de células en la pared del ciego

1. A 27 G o una aguja fina se utiliza para inyectar un volumen de 50 l de las células en la pared del ciego
2. Se retira la aguja
3. El sitio de la inyección es inspeccionado para asegurar que no se escape
4. El ciego es devuelto a la cavidad abdominal

VII. Trasplante de un tumor en el ciego

Nota: Además de la inyección de células en la pared del ciego, una alternativa es el trasplante del tumor en el ciego

1. Una figura de ocho punto se coloca en el ciego con 6-0 o 7-0 suturas de tamaño
2. La pared del ciego está ligeramente dañado
3. A continuación, la pieza tumor se localice
4. El punto está atado
5. El ciego es devuelto a la cavidad abdominal

VIII. Cierre de la pared abdominal del ratón y la recuperación

1. La pared abdominal del ratón se cierra con tres puntos de sutura interrumpida con 3-0 o 4-0 suturas de tamaño
2. Alternativamente, se puede utilizar una puntada simple funcionamiento
3. Post-operatorio analgésicos y un bolo se puede dar en este momento
4. El ratón se le permite recuperarse de la anestesia.

Nota: Con los anestésicos inhalados esto normalmente toma 30 segundos

IX. Resultados - tumor primario y metástasis hepáticas

Del tumor primario - se muestra in situ (A) y con evidencia de neovascularización (B), en la tinción H & E, los tumores son localmente invasivos (C)

Metástasis hepática - muestra ex vivo (D)

Discussion

Aunque los modelos de ratón de tumores subcutáneos son fáciles de establecer y supervisar, está claro que este modelo no se puede replicar el sitio anatómico original de cáncer colorrectal. Debido a la diferencia en el microambiente de las células de cáncer colorrectal que crecen bajo la piel se ha demostrado que un cambio de fenotipo y casi siempre fallan en el progreso y la metástasis ^1,2. De hecho, la respuesta del tumor a la terapia puede variar enormemente dependiendo de si las células cancerosas se implantan en un embarazo ectópico (subcutánea) versus ubicación ortotópico ^3. Ortotópico modelos de ratón de cáncer colorrectal, que cuentan con las células cancerosas que crecen en su ubicación natural, reproducir enfermedades humanas con alta fidelidad. Las dos técnicas para establecer este modelo tiene ventajas y desventajas. La inyección de una suspensión de células en la pared del ciego introduce células de cáncer colorrectal que han sido cada vez mayor en un entorno en vitro y son sin duda homogénea. Las células pueden haber reducido el potencial invasor o metastásico, tras varios pasajes de la cultura. El trasplante de un trozo de tumor subcutáneo presenta una población más heterogénea de las células cancerosas que se han establecido en vivo. Sin embargo, los tumores contienen células del estroma y con frecuencia tienen porciones necróticas que pueden afectar a la consistencia de este modelo (comunicación personal, I. Fidler, el MD Anderson). Desde un punto de vista técnico, nuestro laboratorio ha descubierto que la inyección de una suspensión de células en la pared del ciego es más difícil y conlleva los riesgos de la inyección intraluminal y la fuga después de la inyección. Curiosamente, un modelo de ratón ortotópico de cáncer de recto se ha descrito que no requiere ratón laparotomía ^4. Los ratones son anestesiados y el prolapso de la mucosa rectal es con la presión digital. Un pequeño volumen de células de cáncer colorrectal en suspensión de células individuales se inyecta por vía submucosa. Primaria, los cánceres invasores del recto se desarrollan en ratones tan pronto como una semana después de la inyección, sin embargo, ninguno de los ratones desarrollan metástasis en el hígado y los autores no hizo comentarios sobre la frecuencia de metasases pulmón.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture media and components			will vary depending on cell line used
Phosphate Buffered Saline	BioWhittaker	17-512F	also sold by a number of other vendors
15 mL centrifuge tubes, polypropylene	Corning	430790
6 well plates with lid	BD Biosciences	353046
Iris forceps, straight, serrated tips	World Precision Instruments, Inc.	15914	best to have a pair of these instruments
Iris dissecting scissors, straight, sharp	World Precision Instruments, Inc.	14393
Needle Holder (regular)	World Precision Instruments, Inc.	14109
Needle Holder (Castroviejo)	World Precision Instruments, Inc.	14137
Cidex Plus	World Precision Instruments, Inc.	7364	instruments should be autoclaved periodically, but may also be sterilized by soaking in Cidex
6-0 or 7-0 suture			for cecum; courtesy of Department of Surgery, UCSF
3-0 or 4-0 suture			for abd wall; courtesy of Department of Surgery, UCSF
Anesthetic machine / Isoflurane	J.A. Baulch and Associates	3206	also sold by a number of other vendors
Heating Pad, disposable, 6" x 6"	Prism Technologies	20419
Tape, orange, 13 mm x 13 m	Fisher Scientific	15901F	for restraining anesthetized mouse
Pro-Cord/Cordless Trimmer	Oster Professional Products	78997-010	for shaving mouse fur
Betadine	Fisher Scientific	19-027132	may also be purchased at any medical supply store
2 x 2 gauze, 3-ply	Johnson & Johnson	7635	may also be purchased at any medical supply store
Sterile Field, Barrier, 16" x 29"	Johnson & Johnson	0905	may also be purchased at any medical supply store
Cotton tipped applicators, 6"	Fisher Scientific	14-960-3Q	may also be purchased at any medical supply store
Syringe, 10 cc, Luer lock tip	BD Biosciences	309604
Syringe, 1 cc, tuberculin, slip tip	BD Biosciences	309602
27 1/2 G needle	BD Biosciences	305109
30 G needle	BD Biosciences	305106