Summary
우리는을위한 마우스 모델에서 얇게 - 두개골 대뇌 피질의 창 (TSCW)를 생성하는 방법을 제시
Abstract
광 간섭 단층 촬영 (OCT)는 높은 공간적 - 시간적 해상도 바이오 메디컬 이미징 기술이다. 그 최소한 침략 방식으로 10월는 피부과 안과, 그리고 gastroenterology 1-3에서 널리 사용되었습니다. 얇게 - 두개골 대뇌 피질의 창 (TSCW)를 사용, 우리는 생체 내 이미지 피질을하는 도구로 스펙트럼 도메인 10월 (SD -10 월) 양상을 채용하고 있습니다. 더 다양한 기능을 제공으로 일반적으로, 오픈 - 머리가 신경 이미징에 사용 된 그러나, TSCW의 접근 방식은 덜 침습적이며, neuropathology의 연구에 장기 이미징을위한 효과적인 의미입니다. 여기, 우리는 대뇌 피질의 생체 10월 이미지에서의 마우스 모델에서 TSCW를 만드는 방법을 제시한다.
Introduction
초기 1990 년대의 도입 이후, 10 월은 조직 구조와 기능 2 생물 이미징 용도로 사용되었습니다. 10월는 광섬유 켈슨 간섭계 2,4과 낮은 일관성 광원을 구현하여 backscattered 조명 4 반향 시간 지연을 측정하여 단면 이미지를 생성합니다. 또한 푸리에 도메인 10월 (FD 10 월)로 알려진 SD 10 월은, 첫째 1995 5 소개 및 전통적인 시간 도메인 10월 (TD -10 월)에 비해 우수한 이미징 양상을 제공합니다. SD 10 월에서 참조 암은 높은 속도와 초 고해상도 이미지 획득 6-9의 결과로 고정 유지됩니다.
현재 TSCW 모델은 전통적인 craniotomy 대신에 두 광자 현미경의 생체 뇌 이미징 응용 프로그램에 주로 사용되었습니다. 이러한 TSCW은 추가 IMA을 제공하기 위해 사용자 정의 두개골 판이나 유리 커버 슬립 10-13와 동시에 사용되어왔다안정성을 ging. 우리의 연구에서 우리는 TSCW을 사용하는 경우 다음과 같은 액세서리는 10월 이미징에 필요한 아니라는 것을 관찰했다. 그들은 광학 빔을 방해하고 10월 이미지를 변경 할 수 있으므로 따라서, 두개골 판이나 유리 커버 용지의 부족은 이미지 창 크기의 넓은 범위의 할 수 있습니다.
얇게-두개골 준비 두 광자 현미경 10-13를 사용하여 뇌의 이미징 연구에 도움이 될 입증되었습니다. 우리의 실험에서, 우리는 TSCW을 통해 생체 내 이미지 피질에 SD 10 월 시스템을 사용합니다. 우리의 사용자 정의 SD 10 월 영상 설정은 각각 8 μm 및 20 μm의 축 방향 및 측 방향 해상도의 결과로 97 nm의 대역폭과 1,295 nm의 중심이 superluminescent 다이오드 (SLD), 14로 구성된 광대역, 낮은 간섭 광원을 포함 . 우리의 광학 이미징 장치와 함께, 우리는 TSCW을 통해 이미지가 O에 구조와 기능을 파악하고 시각화에 큰 가능성이 있다는 구상ptically 조밀 한 뇌 조직.
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Protocol
1. 외과 준비
- 6~8주 세 사이의 여성 CD 1 마우스는 우리 실험에 사용되었습니다.
- 케타민과 xylazine 조합 (80 MG / kg ketamine/10 MG / kg xylazine)의 intraperitoneal 주사와 마우스를 마취. ~ 37 ° C.에 최적의 체온을 보장하기 위해 homeothermic 패드에서 마우스를 놓으십시오 지속적인 동물의 반사 신경 (예를 들면, 무딘 집게와 발을 곤란하게) 테스트에 의해 마취의 수준을 모니터링하고 필요한 경우 더 많은 마취를 삽입.
- 인공 눈물의 연고와 함께 두 눈에 기름칠. 면도칼을 사용하여 두피에 머리카락을 제거하고 70 % 알코올 시험을 치루 패드를 사용하여 잔류 머리카락을 제거합니다. 두피 이상 Nair 헤어 제거 크림의 얇은 층을 적용하고 적용하려면 2 분 정도 기다리십시오. 부드럽게 생리를 사용하여 Nair와 나머지 머리는 면봉과 알코올 시험을 치루 패드를 moistened 닦아. 두피는 이제 완전히 사나이 답게해야합니다.
- betadine 면봉 스틱을 사용하여 두피를 소독하고 7 청소0 % 에탄올 사립 패드.
- ~ 37 최적의 체온을 보장하기 위해 수술 커튼에 동물을주의 깊게 포장 ° C와 두개골을 고정 할 수있는 stereotaxic 프레임에 동물을 탑재합니다. 살짝의 안정성을 보장하기 위해 두개골을 누릅니다. 사용 재료의 목록은 표 1에 제공됩니다.
2. 얇게 - 두개골 두피 창 준비
- 눈 사이의 중간 선 지점에 절개를 시작합니다. 귀 사이의 중간 선 지점으로 caudally 계속합니다. 집게가있는 부분 피부를.
- 해부 현미경으로 얇게 할 지역을 찾아 부드럽게 핀셋을 사용하여 근막을 제거합니다. 얇게 대뇌 피질의 창을 만들기 전에 멸균 면봉으로 두개골을 말린다. 우리의 실험에서, 우리는 4 만든 × 4mm는 두개의 창 ~ bregma에 뒤쪽과 측면 1mm를 얇게.
- 빛 한눈에 모션 onl를 사용하여 수술 핸드 드릴에 드릴 비트 크기 0.75 mm를 둥근 카바이드 버를 사용하여 두개골을 썼음 시작Y. 두개골로 직접 압력을 가하지 마십시오. 멸균 생리와 면봉을 사용하여 뼈 먼지를 제거하고 두개골을 과열 방지를 위해 매 20-30 초를 드릴 중지합니다. 생리는 또한 두개골 전체의 열을 사라지고에 도움이됩니다.
- 소형 뼈의 바깥 층이 완전히 제거되면 중간 작은 구멍이 많은 뼈 층은 이제 표시됩니다. 혈관이 작은 구멍이 많은 뼈 계층에서 더 명백만큼 일부 약간의 출혈이있을 수 있습니다. 녹색 돌 버로 전환하여 작은 구멍이 많은 층 더 섬세하므로 특히주의를 사용하여 드릴 계속 진행합니다. 두개골 창 전체 반반 함을 만들 때 녹색 돌 버 적은 뼈 자료를 삭제합니다. 뼈 먼지를 제거하고 두개골을 냉각 가끔 드릴 중지합니다.
- 마지막으로, 두개골이 더 투명하고 뇌에 vasculature 나면 이제 볼 수 있습니다, 연마 버를 사용하여 두개골을 연마 시작합니다. 이 수 두개골을 부드럽게하면서 숱이 더 정확.주세요 SKU의 두께를 확인부드럽게 포셉과에 눌러 붙인다. 두개골이 약간 유연하게 될 때 연마를 중지합니다.
- 얇게 두개골 창이 완전히 부드럽고 반사 및 이미징 (그림 1)에 대한 준비가되어 있어야합니다. 뇌의 고도의 분산 조직의 특성으로 인해, 두개골은 최적 깊이 침투에 대해 최소 55 μm로 얇게해야합니다. 사용 재료의 목록은 표 1에 제공됩니다.
3. 광 결맞음 단층 촬영 영상
- 수술이 완료되면 마취의 적절한 수준을 보장하고 필요한 경우 추가 마취를 관리하는 동물의 호흡 속도와 반사 신경을 확인합니다. stereotaxic 프레임에서 동물을 제거 동물 이미징 역 수술 커튼에 싸여 있으며, 교통 동물 유지.
- 이미지는 반사 표지판을 확인하고 필요한 경우 추가 인공 눈물을 적용하기 전에. 두개골을 확보 할 수있는 stereotaxic 프레임에 동물을 탑재합니다.
- 아래의 장소 동물10월 카메라와 광학 빔 (그림 2)에 따라 위치 TSCW합니다. 두개골과 뇌의 단면도는 이제 (그림 3) 시각화 할 수 있습니다.
- 관심 지역이 위치한되면 데이터 수집이 시작 할 수 있습니다. 영상을 위해, 우리는 4.0 mm의 폭과 이미지 창을 달성하기 위해 갈보 거울을 사용합니다. 2mm의 이미지 깊이는 6 사고 전력 MW과 초점 얇게 두개골 아래의 1mm를 얻은 것입니다. 각 단면적 이미지 당 0.14 초의 수집 속도 2,048 축 스캔으로 구성.
- 뇌의 용적 검사는 XY의 화살 방향으로 빔을 스캔 첫 번째 갈보 거울과 코로나에서 스캔 두 번째 갈보 거울과 스캔을위한 갈보 거울 두 개를 사용하여 2D 단면 일련의 이미지를 수집하여 구할 수 있습니다 방향.
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Representative Results
대뇌 피질 위에 얇게 창을 만든 후 vasculature는 이제 더 시각적으로 눈에 잘 띄는해야합니다 (그림 1)과 (최대 1 ㎜) 깊이 이미징 깊이있게됩니다. 140 μm (그림 1)에서 측정 및 더 큰 광학 선명도를 제공하는 일반 두개골에 비해 오른쪽 피질은 약 55 μm로 얇게되어 있습니다. 또한 10-15 μm로 썼음하면 11 그러나 유리 커버 용지와 두개골 플레이트의 사용 등 필요한는 (그림 1 및 2)의 실험에서 구현되지 않을 수 있습니다. 이 특별한 방법은 우리가 10월 단면 이미지 (그림 3)에서 특정 구조 (대뇌 피질, 코퍼스의 callosum)를 식별 할 수 있습니다. 얇게 해골 (그림 3B) 대 일반 해골 (그림 3A)의 Parasagittal 10월 이미지는 성공적으로 TSCW로 10월 이미지의 결과를 비교 표시됩니다. 또한, 코로나 단면 10월이미지도 중간 선 구조 (그림 3C)를 파악 용이하게 얻어진다. 그림 3의 최대 신호 강도는 노이즈 플로어 위 45dB입니다. 비 얇게 해골 얇게 두개골의 강도 프로파일 비교 TSCW 모델 (그림 4)에서 큰 신호 강도와 깊이 침투을 드러내고있다.
1 그림. TSCW 마우스 모델 인치 4 × 4mm 얇게 두개골 창 (점선 사각형 상자에 표시됨) 다양한 치과 burs를 사용하여 오른쪽 대뇌 반구를 통해 bregma에 뒤쪽과 측면 ~ 1mm 생성됩니다. 오른쪽 피질 (약 55 μm로 얇게) 10월를 사용하여 광학 이미징에 대한보다 깊이 침투을 제공하는 비 얇게 두개골 (왼쪽 피질, 140 μm)보다 훨씬 더 투명합니다. β = bregma, λ = 람다, SS = sagitt알 봉합.
그림 2. 생체 내 TSCW의 10월 이미징은. 얇게 - 해골이있는 마우스 모델은 생체 내 10월 이미징을위한 목표 아래 stereotactic 프레임에 고정되어 있습니다.
그림 3. 생체의 대뇌 피질의 10월 이미지. 정상적인 두개골 아래에있는 피질의 (A) Parasagittal 10월 이미지입니다. 얇게 두개골 아래에있는 피질의 (B) Parasagittal 10월 이미지입니다. 얇게 두개골 (왼쪽)와 정상적인 두개골 (오른쪽)의 (C) 코로나 10월 이미지입니다. 일반 두개골에 비해 뇌의 구조는 TSCW에서 더 시각적으로 명백합니다. 에서 10월 이미지는 이미지 크기 5 생체에 같은 마우스에서 얻은되었습니다0.5 mm × 45dB의 최대 신호 강도와 2mm. β = bregma, CC = 코퍼스의 callosum, SS = 시상 봉합 = 1mm 눈금 바.
4 그림. 정상과 얇게 두개골 사립의 강도 프로파일 비교. TSCW 증가 신호 강도와 깊이 침투를 허용합니다. TSCW 충분한 SNR과 약 1 mm의 이미지 깊이를 달성합니다.
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Discussion
10월와 얇게-두개골 영상은 최근 15, 16, 조사 된 소설 신경 영상 기술이다. 우리의 실험에서, 우리는 생체 내 마우스 모델에서 TSCW을 통해 SD 10 월 영상의 가능성을 보여 주었다. 결과에서 두개골이 약 55 μm로 얇게되어 있고 침투 깊이는 각각의 축 방향 및 측 방향에서 8 μm 및 20 μm의 이미지 해상도로 약 1mm에서 얻어진다. 정상적인 두개골 (그림 4)에 비해 신호 강도 프로파일에서 TSCW을 통해 10월 영상은 신호 강도와 깊이 침투를 증가시킨다. 비교 ~ 10-15 μm의 두개골의 두께에 TSCW있는 두 광자 이미징은 ~ 3 μm 10시 축 해상도로 pial 표면 10, 11, 13 아래 150-250 μm의 이미지 깊이에 도달 할 수의 얇게 두개골 동안 ~이 20 μm 영상 깊이 대뇌 피질 12에서 300-400 μm에게 광고를 노출 할 수 있습니다. 오븐erall, 10 월과 광학 이미징은 mutiphoton 현미경보다 훨씬 깊이 침투을 제공하면서 숱이 과정에서 두꺼운 TSCW을 허용, 유망 이미징 양상으로 증명한다.
시닝가 성공적으로 11, 12, 15, 16, 실시하는 경우 craniotomy 비교가 안 neuroinflammation에 약간의를 제공하는 얇게 - 두개골을 활용하는 등 10월 15일, 16 두 광자 현미경 10-13로 광학 이미징에 유리한 것입니다. 이미지에 대한 craniotomy를 고용하는 것은 뇌에 모욕 한 후 반응 astrocytes의 glial fibrillary 산성 단백질 (GFAP)의 반응 microglia뿐만 아니라 upregulation 될 수 있습니다. 그러나, 얇게 - 두개골 기술을 도입 한 후 영상은 비 활성화 microglia 및 비 반응 astrocytes 10 달러를 암시 약한 GFAP의 immunostaining을 드러내고있다. 이러한 microglia의 형태와 대뇌 피질의 vasculature, C와 대뇌 피질에서 두개골의 숱이 적절한, 특정 구조를 통해는 11-13 구별 할. 그럼에도 불구하고, 광학 이미징을위한 TSCW를 사용하는 단점이 있습니다. 두개골이 올바른 두께로 얇게하거나 두개골이 이미지에 대한 부적절한 숱이 깊이 침투로 인해 거친 표면을 가지고 있지 않은 경우 제한 될 수 있습니다. 가난한 이미징 깊이의 또 다른 단점은 드릴링의 진동으로 인해 하위 경질 막 출혈이 발생할 수 있습니다. 경질 아래 피를 흘리고 것은 어쩔 수 있으므로 10월 이미지에 사용할 수 없습니다 것입니다. 다음과 같은 경우에는, 새로운 동물 모델 실험을 위해 사용되어야합니다.
TSCW을 통해 10월를 사용하여 피질 내 특정 구조를 확인하는 것은 neurodegenerative 질병을 추적하고 뇌 기능의 변화를 연구하는데 도움이 될 수 있습니다. 대뇌 혈액의 흐름을 정량화하는 뇌졸중, 알츠하이머 병 18, 또는 뇌 종양 17 공부에 뇌의 대사 요구를 모니터링에 답으로 이미징 혈액 흐름 도플러 10월 17일, 18을 통해 달성 될 수있다. Axonal그리고 neuronal 변성은 10월 이미지로도 유명하며, 다양한 뇌 질환의 연구를 혜택을 누릴 수 있습니다. 영상으로 신경 세포 axons, 신경 퇴행, 신경 보호 메커니즘, 그리고 신경 수리를 포함하는 망막 신경 섬유 층 (RNFL)이 있지만, 또한 파킨슨 19 여러과 같은 신경 질환의 광학 질환에뿐만 아니라 시각화 할 수 있습니다 경화증 20, 21, 10 월 세분화 기술 20을 통해 망막의 황반 21 망막 층의 두께를 측정하여 자세히 살펴 된 후자.
10월과 신경 영상은 영상 구조와 뇌의 기능에 제한뿐만 아니라. 10월는 생체 이미징 10, 11뿐만 아니라 electrophysiological 및 microinjection 연구 1, 3, 15-17로 stereotactic 절차에 만성에서 도움이 될 수 있습니다. 신경 외과에서, 10 월은 외과 의사가 볼 수 있도록하여 조직 검사 또는 가이드 도구 2로 사용할 수 있습니다뇌 17 내의 특정 해부학 적 기능의 실시간 피드백 이미지. 더 발전으로, 우리는 TSCW와 SD 10 월의 현재 조합이 이러한 intracranial 압력 (ICP) 모니터 22, 자기 공명 영상 (같은 다른 modalities을 적용 할 때 임상의 능력을 진단 신경 결손으로 개선 할 수있는 가능성을 가지고 있다고 생각합니다 MRI) 또는 전산화 축 단층 촬영 장치 (CAT) 1.
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Disclosures
관심 없음 충돌이 선언 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 컨셉 교부금의 UC 발견 증명 의해 NIH (R00 EB007241)에 의해 지원되었다. 저자는 또한이 실험에서 그녀의 도움 재클린 허바드 감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
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