Summary
Apresenta-se um método de criação de uma janela diluído crânio-cortical (TSCW) em um modelo de rato para
Abstract
Tomografia de coerência óptica (OCT) é uma técnica de imagem biomédica com resolução espacial-temporal. Com a sua abordagem minimamente invasiva outubro tem sido amplamente utilizado em oftalmologia, dermatologia, gastroenterologia e 1-3. Usando uma janela diluído crânio-cortical (TSCW), empregamos espectral-domínio outubro modalidade (SD-OCT) como uma ferramenta para a imagem do córtex in vivo. Comumente, uma abertura de caveira foi usada para neuroimagem, pois proporciona uma maior versatilidade, no entanto, uma abordagem TSCW é menos invasivo e é um meio eficaz para imagiologia de longa duração em estudos neuropatologia. Aqui, apresentamos um método de criação de um TSCW em um modelo de camundongo in vivo para outubro de imagem do córtex cerebral.
Introduction
Desde a sua introdução no início dos anos 1990, OCT tem sido amplamente utilizado para a imagiologia biológica da estrutura e função do tecido 2. Outubro gera imagens transversais através da medição de atraso de eco de tempo de 4 a luz retrodifundida pela implementação fonte de luz baixa coerência com um interferómetro de Michelson fibra óptica 2,4. SD-outubro, também conhecido como domínio de Fourier outubro (FD-OCT), foi introduzido pela primeira vez em 1995 5 e oferece uma modalidade de imagem superior em comparação com o tradicional domínio do tempo outubro (TD-OCT). Em SD-OCT, o braço de referência é mantido estacionário, resultando em uma alta velocidade e de aquisição de imagem ultra-alta resolução 6-9.
Presentemente, os modelos TSCW têm sido largamente utilizados para aplicações em imagiologia do cérebro in vivo de dois fotões microscopia no lugar de uma craniotomia tradicional. Estes TSCW foram usados simultaneamente com uma placa de crânio personalizado ou uma lamínula de vidro 10-13 para fornecer ima adicionalging estabilidade. Nos nossos estudos, observou-se que os acessórios tais como estes não são necessários para outubro de imagem quando um TSCW é usado. Portanto, a ausência de uma placa de crânio ou lamelas de vidro permite uma gama mais ampla de tamanho de janela de imagem uma vez que podem interferir com o feixe óptico e alterar imagens outubro
A preparação diluída crânio tem provado ser vantajoso em estudos de imagem do cérebro utilizando dois fotões microscopia 10-13. Em nossos experimentos, nós utilizamos um sistema SD-OCT para a imagem do córtex in vivo através de um TSCW. Nosso costume SD-outubro de configuração de imagem contém uma banda larga, fonte de luz de baixa coerência consiste em dois diodos superluminescent (SLD) centradas em 1295 nm com uma largura de banda de 97 nm, resultando em uma resolução axial e lateral de 8 m e 20 um, respectivamente 14 . Com o nosso dispositivo de imagem óptica, prevemos que a imagem através de um TSCW tem um grande potencial na identificação e visualização de estruturas e funções no ctecido cerebral ptically denso.
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Protocol
1. Preparação cirúrgico
- CD 1 fêmea ratos com idades entre 6-8 semanas foram utilizados nas nossas experiências.
- Anestesiar o rato com uma injecção intraperitoneal de uma combinação de cetamina e xilazina (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg de xilazina). Posicione o mouse sobre uma almofada de homeotérmicos para garantir a temperatura corporal ideal em ~ 37 ° C. Monitorar continuamente o nível de anestesia, testando os reflexos do animal (por exemplo, apertando o pé com uma pinça sem corte) e injetar mais anestesia quando necessário.
- Lubrifique os dois olhos com uma pomada de lágrima artificial. Remova os cabelos no couro cabeludo utilizando uma lâmina de barbear e depilar residual utilizando almofadas de preparação de 70% de álcool. Aplique uma fina camada de Nair creme de depilação sobre o couro cabeludo e esperar 2 min para que ela tenha efeito. Limpe cuidadosamente afastado cabelo Nair e restantes utilizando solução salina umedecido cotonetes e almofadas de preparação de álcool. Couro cabeludo deve agora ser completamente sem pêlos.
- Desinfetar couro cabeludo usando um betadine vara cotonete e limpe com 7Almofadas prep 0% de etanol.
- Cuidadosamente enrole o animal em campos cirúrgicos para garantir a temperatura corporal ideal de ~ 37 ° C e montar o animal sobre uma armação estereotáxica para imobilizar o crânio. Bata levemente o crânio para garantir a sua estabilidade. A lista de materiais utilizados são fornecidas na Tabela 1.
2. Diluído crânio-Preparação Janela Cortical
- Iniciar a incisão na linha média, no ponto entre os olhos. Continuar caudalmente ao ponto da linha média entre as orelhas. Parte da pele com fórceps.
- Localizar a área a ser diluído sob um microscópio de dissecação e retire cuidadosamente a fáscia usando uma pinça. Seque o crânio com cotonetes estéreis antes de criar a janela diluído cortical. Em nossos experimentos, nós criamos um 4 × 4 mm diluído janela craniana ~ 1 mm posterior e lateral para bregma.
- Comece diluindo o crânio com uma rodada carbide com tamanho de broca 0,75 milímetros em uma broca cirúrgica com onl leve movimento radicaly. Não aplique pressão directa sobre o crânio. Pare de perfuração cada seg 20-30 para remover o pó de osso utilizando solução salina estéril e cotonetes e para evitar o superaquecimento do crânio. A solução salina irá também ajudar na dissipação do calor em todo o crânio.
- Uma vez que a camada externa do osso compacto é completamente removido a camada de osso esponjoso do meio deve ser agora visíveis. Pode haver algum sangramento leve como vasos sanguíneos são mais evidentes na camada de osso esponjoso. Mudar para uma broca de pedra verde e continuar a perfuração utilizando cuidado extra como a camada esponjosa é mais delicada. A broca de pedra verde irá remover o material menos osso ao criar uniformidade em toda a janela craniano. Pare a perfuração de vez em quando para remover o pó de osso e para arrefecer o crânio.
- Finalmente, quando o crânio tornou-se mais transparente e vasculatura do cérebro é agora visível, iniciar o polimento do crânio utilizando uma broca de polimento. Isso permitirá uma mais precisa desbaste enquanto alisando o crânio. Verifique magreza do skull batendo nele com uma pinça. Parar de polimento quando o crânio fica ligeiramente flexível.
- A janela craniana diluído deve agora ser completamente liso e reflector e prontos para imagiologia (Figura 1). Devido à natureza dos tecidos altamente espalhamento do cérebro, do crânio deve ser diluído até, pelo menos, 55 mm para a penetração de profundidade óptima. A lista de materiais utilizados são fornecidas na Tabela 1.
3. Tomografia de coerência óptica
- Após a cirurgia está completa, verificar a taxa de animal respiração e reflexos para assegurar um nível adequado de anestesia e administrar anestesia adicional se necessário. Remover animal da armação estereotáxica, manter animais envolvido em panos cirúrgicos, e animais de transporte para a estação de imagiologia.
- Antes de imagem para verificar os sinais reflexos e aplicar lágrima artificial adicional se necessário. Montar animal sobre a armação estereotáxica para fixar o crânio.
- Coloque o animal sobOutubro câmara ea posição do TSCW sob o feixe óptico (Figura 2). Uma vista em corte transversal do crânio e no cérebro podem agora ser visualizada (Figura 3).
- A aquisição de dados pode começar uma vez que área de interesse está localizada. Para os fins de imagem, usamos espelhos Galvo para alcançar uma janela de imagem com uma largura de 4,0 mm. Uma profundidade de 2 mm de imagem foi obtida com 6 mW de potência incidente e um ponto focal 1 mm abaixo do crânio diluído. Cada área transversal consistindo de 2.048 scans axiais com uma taxa de aquisição de 0,14 segundos por imagem.
- Digitalizações volumétricas do cérebro pode também ser obtido por recolha de uma série de 2D imagens transversais usando dois conjuntos de espelhos para Galvo xy digitalização com o espelho de digitalização Galvo primeiro feixe na direcção sagital e o espelho Galvo segunda análise no coronal direção.
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Representative Results
Após a criação de uma janela diluído sobre o córtex cerebral a vasculatura agora deve ser visualmente mais proeminente (Figura 1) e vai permitir uma maior profundidade de imagens (até 1 mm). O córtex direito é diluído para cerca de 55 pM quando comparado com um crânio normal, medido a 140 ^ m (Figura 1) e proporciona uma maior clareza óptica. Além disso o desbaste de 10-15 uM é possível 11 não, contudo, necessário que a utilização de folhas de vidro de cobertura e as placas do crânio não são implementadas nas nossas experiências (Figura 1 e 2). Este método particular nos permitiu identificar estruturas específicas (córtex cerebral, corpo caloso) nas nossas outubro imagens transversais (Figura 3). Imagens sagitais outubro de um crânio normal (Figura 3A) versus um crânio diluído (Figura 3B) são mostrados para comparação dos resultados de uma imagem com um TSCW outubro de sucesso. Além disso, um corte transversal coronal outubroimagem é também obtida para facilitar a identificação de estruturas da linha média (Figura 3C). A intensidade máxima do sinal para a Figura 3 é 45 dB acima do ruído de fundo. Uma comparação de perfis de intensidade de um crânio não-diluídos e diluídos um crânio revela uma maior intensidade de sinal e de profundidade de penetração de um modelo TSCW (Figura 4).
Figura 1. TSCW em um modelo de mouse. A 4 × 4 mm janela crânio diluído (indicado na caixa pontilhada quadrado) é criado ~ 1 mm posterior e lateral para bregma sobre o hemisfério cerebral direito usando várias brocas dentárias. O córtex direito (diluída para cerca de 55 mm) é significativamente mais transparente do que o crânio não diluído (córtex esquerdo, 140 mm) proporcionando uma maior penetração de profundidade para a imagiologia óptica utilizando outubro β = bregma, λ = lambda, SS = Sagittal de sutura.
Figura 2. Outubro de imagem de TSCW in vivo. Um modelo de mouse com um desbaste de caveira é fixada em um quadro estereotáxico no âmbito do objectivo de outubro de imagem in vivo.
Figura 3. Outubro imagens do córtex cerebral in vivo. (A) parassagital imagem outubro do córtex sob um crânio normal. (B) parassagital imagem outubro do córtex sob um crânio diluído. (C) Coronal imagem outubro de um crânio diluído (esquerda) e um crânio normal (à direita). As estruturas do cérebro são mais claramente visíveis sob uma TSCW, em comparação com um crânio normal. Outubro de imagens foram obtidas a partir do mesmo rato in vivo com imagens de tamanho 50,5 milímetros × 2 mm, com intensidade máxima do sinal de 45 dB. β = bregma, CC = corpo caloso, SS = sagital sutura, barra de escala = 1 mm.
Figura 4. Comparações da intensidade do perfil de prep crânio normal e diluído. TSCW permite aumentar a intensidade do sinal e de profundidade de penetração. O TSCW alcança uma profundidade de imagem de cerca de 1 mm, com SNR suficiente.
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Discussion
Imagens com outubro e um diluído crânio-se de uma técnica neuro-imaging romance que só recentemente foram investigadas 15, 16. Em nossos experimentos, demonstramos a viabilidade do SD-outubro de imagem através de um TSCW em um modelo de rato in vivo. A partir dos resultados, o crânio é diluído para cerca de 55 ^ m e a profundidade de penetração é obtida em cerca de 1 mm, com resolução de imagem de 8 um e 20 um na direcção axial e lateral, respectivamente. No perfil de intensidade do sinal, outubro de imagem através de uma TSCW aumenta a intensidade do sinal e de profundidade de penetração, em comparação com um crânio normal (Figura 4). Em comparação, os dois fótons de imagem com um TSCW a espessura do crânio de ~ 10-15 uM pode atingir profundidades de imagem de 150-250 ^ M abaixo da superfície pial 10, 11, 13 com a resolução axial no ~ 3 10 pM, enquanto a cabeça de desbaste ~ profundidade de 20 ^ M de imagem pode chegar a 300-400 uM dentro do córtex cerebral 12. Overall, imageamento óptico com outubro revela-se uma modalidade de imagem promissora, permitindo uma espessa TSCW durante o processo de desbaste, proporcionando uma penetração mais profunda do que a microscopia mutiphoton profundidade.
Utilizando um desbaste crânio é vantajoso em imagiologia óptica, tais como Out 15, 16 e de dois fotões microscopia 10-13, uma vez que proporciona pouco ou nenhum neuroinflamação, em comparação com uma craniotomia se o desbaste é realizado com sucesso 11, 12, 15, 16,. Empregando uma craniotomia para imagiologia pode resultar em microglia reactiva, bem como a regulação alta de proteína ácida fibrilar glial (GFAP) nos astrócitos reactivos após insultos ao cérebro. No entanto, a imagem após a adoção de uma técnica de desbaste crânio revela não activa microglia e imunomarcação GFAP fraco implicando não reactivos astrócitos 10. Através de adequada diluição do crânio, estruturas específicas dentro do córtex cerebral, tais como morfologia e microglia vasculatura cortical, cum ser distinguidos 11-13. No entanto, existem desvantagens de usar um TSCW para a imagiologia óptica. Se o crânio não é diluído com a espessura correcta ou o crânio tem superfícies ásperas devido à profundidade de penetração indevida desbaste para imagiologia pode ser limitada. Outra desvantagem para a profundidade de imagem pobre pode resultar de sub-dural hemorragia devido a vibrações de perfuração. Sangramento debaixo da dura-máter é inevitável, e por isso não pode ser usada para outubro de imagem. Em casos como estes, um novo modelo animal deve ser usado para a experiência.
Identificar certas estruturas dentro do córtex utilizando outubro através de um TSCW pode ser útil na detecção de doenças neurodegenerativas e para estudar alterações na função cerebral. O fluxo de sangue de imagem pode ser alcançado através de Doppler 17 out, 18 como a quantificação do fluxo sanguíneo cerebral é primordial no controlo das necessidades metabólicas do cérebro no estudo de acidente vascular cerebral, doença de Alzheimer, 18, ou tumores cerebrais 17. Axonale degeneração neuronal também é proeminente em imagens outubro e podem se beneficiar de estudos de distúrbios cerebrais diferentes. Pela imagem da camada de fibras nervosas da retina (CFNR), que contém os axônios células ganglionares, mecanismos de neuro-degeneração, neuro-protecção e neuro-reparação pode ser visualizado, não só em doenças ópticas, mas também em doenças neurológicas, tais como Parkinson 19 e múltipla esclerose 20, 21, este último que foi explorado em detalhe através da medição da espessura da camada 21 e da mácula na retina por meio de técnicas de segmentação 20 out.
Neuro-imagem com OCT não se restringe apenas às estruturas de imagem e funções do cérebro. OCT pode ser vantajoso em crónica in vivo imaging 10, 11, bem como em procedimentos de estereotaxia, tais como estudos electrofisiológicos e microinjecção 1, 3, 15-17. Em neurocirurgia, OCT pode ser usado como uma ferramenta de biópsia ou de guiamento 2, permitindo que os cirurgiões para verimagens em tempo real de feedback das características anatômicas específicas dentro do cérebro 17. Com a evolução, acreditamos que nossa combinação atual de SD-outubro com um TSCW tem o potencial de melhorar a capacidade de um clínico a déficits diagnóstico neurológico quando é aplicada com outras modalidades, como uma pressão intracraniana (PIC) monitor de 22, a ressonância magnética ( RM), ou tomografia axial computorizada (TAC) 1.
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Disclosures
Não há conflitos de interesse declarados.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pela Prova Descoberta UC da concessão Conceito e pelo NIH (R00 EB007241). Os autores também gostariam de agradecer a Jacqueline Hubbard por sua assistência neste experimento.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
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