Summary
我们提出一个方法创建一个稀疏的头骨皮质的窗口（TSCW）在小鼠模型
Abstract
光学相干断层扫描（OCT）是生物医学成像技术，具有高时空分辨率。凭借其微创的方法，华侨城已被广泛用于眼科，皮肤科，消化内科1-3。使用稀疏的头骨皮层的窗口（TSCW），我们采用谱域OCT（SD-OCT）的方式作为一种工具， 体内的皮质图像。好评，打开颅骨已用于神经成像，因为它提供了更多的功能，但是，TSCW方法是微创的，是一种有效的长期平均成像在神经病理学研究。在这里，我们提出的方法在小鼠模型体内 OCT成像的大脑皮质创建一个TSCW的。
Introduction
在20世纪90年代初，自推出以来，华侨城已被广泛用于生物成像的组织结构和功能2。 OCT生成的横截面图像，通过测量通过实施低相干光源与光纤的Michelson干涉仪2,4回波时间延迟的反向散射光4。 SD-OCT，也被称为傅立叶域OCT（FD-OCT），在1995年5月首次推出，提供了出色的成像方式相比，传统的时域OCT（TD-OCT）。在SD-OCT中，参考臂保持静止导致在高速和超高分辨率图像采集6-9。
目前，TSCW模型已被主要用于代替传统的开颅双光子显微镜在体内脑成像应用。这些TSCW同时使用一个自定义的颅骨内板或玻璃盖片10-13提供额外的IMA晋稳定。在我们的研究中，我们已观察到，这些配件，如没有必要使用OCT成像时TSCW。因此，缺乏的颅骨外板或玻璃盖玻片允许摄像窗口的大小以便在更大的范围内，因为它们可能会干扰光束，并改变OCT图像。
阿稀疏颅骨制剂已被证明是有利的，在使用双光子显微镜10-13的大脑成像研究。在我们的实验中，我们使用了SD-OCT系统图像通过TSCW 体内的皮质。我们的自定义的SD-OCT成像设置包含一个宽带，低相干光源由两个超辐射发光二极管（SLD）的中心在1295纳米的带宽为97纳米，从而在轴向和横向分辨率为8μm和20μm的，分别为14组成的。我们的光学成像设备，我们设想，成像通过TSCW有很大的潜力，在识别和可视化的结构和功能的Optically密集的脑组织。
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Protocol
1。手术准备
- 女CD 1岁之间的6-8周，在我们的实验中使用的小鼠。
- 麻醉的小鼠腹膜内注射氯胺酮和甲苯噻嗪的组合（80毫克/公斤ketamine/10 mg / kg的甲苯噻嗪）。将鼠标在homeothermic垫，以确保最佳的体温〜37℃连续监测麻醉水平测试动物的反射（ 如 ，钝钳捏脚），并在必要时注入更多的麻醉剂。
- 用人工泪液润滑双眼软膏。删除使用剃刀在头皮上的毛发，并用70％的酒精准备垫去除残留的头发。奈尔脱毛膏在头皮涂上薄薄的一层，等待2分钟生效。轻轻擦去Nair和剩余的头发用生理盐水浸湿棉签和酒精准备垫。的头皮现在应该是完全无毛。
- 头皮使用优碘棉签棒的消毒和清洁70％的酒精准备垫。
- 小心地包裹动物在手术单，以确保最佳的体温〜37°C，并安装到一个立体的框架，以固定的头骨的动物。轻轻敲击颅骨，以确保其稳定性。所使用的材料的列表被设置在表1中 。
2。稀疏的头骨皮质窗口准备
- 启动切口在中线点之间的眼睛。继续尾部的中线点之间的耳朵。用钳子部分的皮肤。
- 在解剖显微镜下找到被摊薄和筋膜，用小镊子轻轻取出。头骨薄的皮质窗口前，用无菌棉签擦干。在我们的实验中，我们创建了一个4×4毫米薄的颅窗〜1毫米后方和侧面，前囟门。
- 开始变薄的头骨采用圆硬质合金钻针，钻头尺寸0.75毫米手电钻在手术中使用淡扫运动ONLY。不要将头骨上的直接压力。停止钻，每隔20-30秒，去除骨灰尘，用无菌生理盐水和棉签，以避免过热的头骨。的盐水也将有助于在整个头骨的热量散发。
- 一旦外层紧凑骨完全除去中间的海绵骨层现在应该可见。有可能会出现一些轻微的出血，如血管较明显的松质骨层。切换到一个绿色的石牙钻，继续钻探，使用格外小心，因为海绵层更加细腻。绿色的石牙钻去除骨材料少，同时创造均匀度在整个颅窗。停钻，偶尔去除骨的灰尘和冷却的头骨。
- 最后，当头骨已变得更加透明和血管对大脑现在是可见的，开始抛光使用抛光牙钻的头骨。这将允许更精确的细化而平滑的头骨。检查薄的SKU会用钳子轻轻拍打就可以了。停止抛光时，的头骨变得稍微灵活。
- 减薄的颅窗现在应该完全光滑的和反射的，并准备用于成像（ 图1）。由于高散射的大脑组织的性质，应减薄颅骨至少为55微米，最佳的穿透深度。所使用的材料的列表被设置在表1中 。
3。光学相干断层成像
- 手术完成后，检查动物的呼吸速率和反应能力，以确保适当的麻醉和管理额外的麻醉，如果必要的。删除动物脑立体定位框架，使动物在手术单包裹，运输动物的成像站。
- 在成像检查对反射的迹象，如果需要申请额外的人工泪液。安装立体定位框架，以确保头骨的动物。
- 广场动物下OCT相机和位置的TSCW下的光束（ 图2）。 A剖视图的头骨和大脑现在可以被可视化（ 图3）。
- 一旦找到感兴趣的区域，就可以开始数据采集。对于成像的目的，我们使用检流计反射镜，具有4.0毫米的宽度来实现的摄像窗口。一种成像深度为2mm，得到6毫瓦的入射功率，以及焦点1毫米以下的薄的颅骨。每个横截面面积由2048与每幅图像的采集速率为0.14秒的轴向扫描。
- 也可以通过以下方式获得的体积扫描的大脑收集一系列的二维截面图像通过使用检流计反射镜两套XY扫描与所述第一检流计镜扫描在弧矢方向上的光束和所述第二检流计镜扫描在冠状的方向发展。
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Representative Results
脉管系统创建一个减薄的窗口在大脑皮层后现在应该是视觉上更加突出（ 图1），并且将允许成像深度更深（可达1毫米）。右皮质减薄到约55微米，较到正常颅骨测定在140微米（ 图1），并提供了更大的光学清晰度。 11但没有必要的，因为使用的盖玻片和颅骨内板没有实现在我们的实验中（ 图1和图2），可以进一步细化到10-15微米。这个特定的方法，使我们能够确定在我们OCT截面图像（ 图3）的具体结构（大脑皮质，胼胝体）。矢状一个正常颅骨（ 图3A）相对于减薄颅骨（ 图3B）的OCT图像示出了一个成功的比较的结果的OCT图像TSCW。此外，冠状截面OCT图像也被获得，以便在确定中线结构（ 图3C）。针对图3中的最大信号强度的本底噪声为45分贝以上。非减薄颅骨和减薄颅骨一个强度分布图的比较揭示了一个更大的信号强度和穿透深度在TSCW模型（ 图4）。
图1。 TSCW在小鼠模型中，A 4×4毫米薄颅骨窗口（在虚线正方形框表示）创建〜1毫米，后侧及外侧前囟门右侧大脑半球使用各种牙科钻针。的右皮质（减薄到约55微米）是显著比非减薄颅骨（左侧皮层，140微米），提供了更大的穿透深度为使用OCT成像光学透明。 β=前囟门，λ=λ，SS = sagitt人缝合。
图2。 OCT成像TSCW 在体内 ，一种被固定在立体定位框架下的目标的OCT成像在体内小鼠模型与减薄颅骨。
图3。 OCT图像的的大脑皮层体内 。（A）矢状窦旁皮层下的OCT图像的一个正常的头骨。 （B）矢状窦旁皮层下的OCT图像减薄的头骨。 （C）的冠状OCT图像减薄颅骨（左）和一个正常的颅骨（右）。结构的大脑中视觉上更明显下TSCW相比一个正常颅骨。 OCT图像从与成像大小5从同一小鼠体内获得0.5毫米×2毫米的45分贝的最大信号强度。 β=前囟门，CC =胼胝体，SS =矢状缝，比例尺= 1毫米。
图4。强度分布比较正常的，薄的头骨准备。TSCW允许增加信号强度和穿透深度。 TSCW达到的成像深度约1毫米与足够的信噪比。
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Discussion
成像与OCT和减薄颅骨是一种新的神经成像技术，只有最近的调查15，16。在我们的实验中，我们证实SD-OCT成像的可行性通过一个TSCW在小鼠模型体内 。从我们的结果，颅骨被减薄到约55微米，和获得的穿透深度分别为8μm和20μm的在轴向和横向方向上的图像的分辨率，在约1毫米。在信号强度分布，通过TSCW OCT成像的信号强度和穿透深度增加，相比一个正常颅骨（ 图4）。相比较而言，双光子成像与TSCW在颅骨〜10-15微米的厚度可以达到150-250微米的成像深度低于软膜表面10，11，13〜3微米10的轴向分辨率，同时减薄头骨〜 20μm的成像深度可达300-400微米内的大脑皮层12。 OVerall，光学成像与华侨城被证明是一个有前途的成像方式，允许更厚的TSCW在细化过程中，同时提供更深的穿透深度，比mutiphoton显微镜。
利用减薄颅骨如OCT 15，16和双光子显微镜10-13在光学成像是有利的，因为它提供了相比开颅，如果减薄进行成功的11，12，15，16，几乎没有神经炎症。采用开颅手术的成像可能会导致反应的小胶质细胞的神经胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在侮辱的大脑反应后星形胶质细胞以及上调。然而，成像后采用了稀疏头骨技术揭示了非激活的小胶质细胞和GFAP免疫薄弱，这意味着非反应性星形胶质细胞10。通过适当的头骨变薄，在大脑皮层的结构，如小胶质细胞形态学及皮质血管，C加以区分11-13。然而，有缺点的使用一个TSCW的光学成像。如果颅骨还没有正确的厚度减薄到或颅骨具有粗糙表面由于不当减薄用于成像的穿透深度，可能会受到限制。另一种成像深度差的缺点可能会导致子硬膜下出血，由于钻井振动。下方的硬脑膜出血是不可避免的，因此不能被用于OCT成像。在诸如这些的情况下，一个新的动物模型应用于实验。
内皮层使用OCT通过TSCW识别某些结构可以帮助跟踪神经退行性疾病和脑功能变化研究。 18年10月17日通过多普勒成像血流量可以达到量化脑血流量是最重要的，在监测的代谢需求的大脑在学习中风，阿尔茨海默氏病18，或脑肿瘤的17。轴突和神经元变性也很突出，在OCT图像，并可以享受各种脑部疾病的研究。通过成像在视网膜神经纤维层（RNFL），其中包含神经节细胞轴突，神经的变性，神经的保护机制和神经的修复可以可视化，不仅在光学疾病而且在神经系统疾病，如帕金森氏19和多个多发性硬化20，21，后者已详细探讨了通过测量21和视网膜层厚度的黄斑通过OCT分割技术20。
神经成像不仅限于与OCT成像对大脑的结构和功能。 OCT在慢性肾炎中可以是有利的在体内成像10，11，以及在立体定向的操作过程，如电生理和微量注射研究1，3，15-17。在神经外科，OCT可以作为一个活切片检查或指导工具，让医师可以查看实时反馈大脑内的17的具体解剖特征的图像。随着进一步的发展，我们相信我们目前的组合SD-OCT一个TSCW的潜力，以提高一个临床医生的能力，以诊断神经系统的赤字时，它的应用与其他方式的颅内压（ICP）显示器22，磁共振成像等（ MRI），或计算机轴向断层扫描（CAT）1。
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Disclosures
没有利益冲突的声明。
Acknowledgments
这项工作是由加州大学理念授予的发现证明，由美国国立卫生研究院（R00 EB007241）。作者还要感谢杰奎琳·哈伯德对她的帮助，在这个实验中。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
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