Summary
Presenteren we een methode om een uitgedunde schedel corticale venster (TSCW) in een muizenmodel voor
Abstract
Optical Coherence Tomography (OCT) is een biomedisch beeldvormende techniek met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Met zijn minimaal invasieve benadering oktober wordt veelvuldig gebruikt in de oogheelkunde, dermatologie, gastro-enterologie en 1-3. Met behulp van een verdund-schedel corticale venster (TSCW), maken we gebruik spectrale-domein OCT (SD-OCT) modaliteit als een instrument om het imago van de cortex in vivo. Gewoonlijk een open-schedel is gebruikt voor neuro-imaging omdat het meer veelzijdigheid echter een TSCW benadering is minder invasief en is een effectief middel voor langdurige imaging in neuropathologie studies. Hier geven we een methode om een TSCW in een muismodel voor in vivo beeldvorming oktober van de cerebrale cortex.
Introduction
Sinds de introductie in het begin van 1990, is oktober op grote schaal gebruikt voor biologische beeldvorming van weefsel structuur en functie 2. Oktober genereert cross-sectionele beelden door het meten van echo vertragingstijd van teruggekaatste licht 4 door het implementeren van lage samenhang lichtbron met een glasvezel-Michelson interferometer 2,4. SD-OCT, ook wel bekend als Fourier-domein OCT (FD-OCT), werd voor het eerst geïntroduceerd in 1995 5 en biedt een superieure beeldvormende modaliteit ten opzichte van traditionele tijdsdomein OCT (TD-OCT). In SD-OCT, wordt de verwijzing arm stationair gehouden wat resulteert in een hoge snelheid en hoge resolutie beeldacquisitie 6-9.
Momenteel hebben TSCW modellen grotendeels gebruikt in vivo brain imaging toepassingen van twee-foton microscopie in plaats van een traditionele craniotomie. Deze TSCW zijn gelijktijdig wordt gebruikt met een aangepaste schedel plaat of een glazen dekglaasje 10 tot 13 extra ima gevenGing stabiliteit. In onze studies hebben we waargenomen dat accessoires zoals deze niet noodzakelijk zijn voor oktober imaging wanneer TSCW gebruikt. Daarom is het ontbreken van een schedel plaat of glazen dekglaasjes zorgt voor een breder scala van beeldvormende venstergrootte omdat hierdoor interferentie met de optische bundel en veranderen oktober afbeeldingen.
Een verdund-schedel voorbereiding heeft bewezen voordelig te zijn in de beeldvorming studies van de hersenen met behulp van twee-foton microscopie 10-13. In onze experimenten hebben we gebruik maken van een SD-OCT systeem om het imago van de cortex in vivo door middel van een TSCW. Onze eigen SD-OCT imaging setup bevat een breedband, low-coherentie lichtbron bestaande uit twee superluminescent diodes (SLD) gecentreerd op 1295 nm met een bandbreedte van 97 nm resulteert in een axiale en laterale resolutie van 8 urn en 20 urn, respectievelijk 14 . Met onze optische imaging-apparaat, zien wij dat beeldvorming door middel van een TSCW groot potentieel heeft bij het identificeren en visualiseren van structuren en functies in de optically dichte hersenweefsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Chirurgische Voorbereiding
- Vrouwelijke CD 1 muizen in de leeftijd van 6-8 weken werden in onze experimenten.
- Verdoven de muis met een intraperitoneale injectie van ketamine en xylazine combinatie (80 mg / kg ketamine/10 mg / kg xylazine). Plaats de muis op een homeothermic pad om een optimale lichaamstemperatuur te garanderen bij ~ 37 ° C Continu monitoren niveau van de anesthesie door het testen van dier reflexen (bv, knijpen de voet met stompe pincet) en meer injecteren verdoving indien nodig.
- Smeer beide ogen met een kunstmatige scheur zalf. Verwijder haren op de hoofdhuid met een scheermes en verwijder resterende haren met alcohol 70% prep pads. Breng een dun laagje van Nair ontharing room over de hoofdhuid en wacht 2 minuten voor het van kracht worden. Voorzichtig weg te vegen Nair en overige haar met behulp van een zoutoplossing bevochtigde wattenstaafjes en alcohol prep pads. Hoofdhuid moet nu volledig haarloos.
- Desinfecteer hoofdhuid met behulp van een wattenstaafje betadine stok en reinig met 70% ethanol prep pads.
- Voorzichtig het dier verpakken in chirurgisch afdekmateriaal om een optimale lichaamstemperatuur van ~ 37 te verzekeren ° C en monteer het dier op een stereotactische frame aan de schedel te immobiliseren. Een paar tikjes tegen de schedel haar stabiliteit kan garanderen. Een lijst met gebruikte materialen in Tabel 1.
2. Verdund-schedel Corticale Window Voorbereiding
- Start de incisie op de middenlijn punt tussen de ogen. Ga verder caudaal aan de middellijn punt tussen de oren. Een deel van de huid met een pincet.
- Zoek het gebied dat moet worden verdund onder een dissectie microscoop en verwijder voorzichtig de fascia met een pincet. Droog de schedel met steriele wattenstaafjes voordat u de verdunde corticale venster. In onze experimenten hebben we een 4 × 4 mm dunner craniale venster ~ 1 mm posterior en lateraal van bregma.
- Begin het verdunnen van de schedel met een ronde carbideboor met boor formaat 0,75 mm in een chirurgische handboor met behulp van licht zwaaiende beweging only. Breng geen directe druk op de schedel. Stop het boren om de 20-30 seconden aan het bot stof met behulp van steriele zoutoplossing en wattenstaafjes te verwijderen en om te voorkomen dat oververhitting van de schedel. De zoutoplossing zal ook helpen bij het afvoeren van de warmte in de schedel.
- Nadat de buitenste laag van de compact bot volledig verwijderd middelste laag sponsachtig bot moet nu zichtbaar. Er kan wat lichte bloedingen zijn als de bloedvaten zijn meer zichtbaar in het sponsachtige bot laag. Schakel over naar een groene steen boor en blijven boren met behulp van extra voorzichtigheid, want de sponzige laag is meer delicaat. De groene steen boor zal verwijderen minder botmateriaal tijdens het maken van gelijkmatigheid in de craniale venster. Stop het boren af en toe aan het bot stof te verwijderen en om de schedel te koelen.
- Tot slot, wanneer de schedel transparanter is geworden en vaatstelsel op de hersenen nu zichtbaar is, begint het polijsten van de schedel met een polijsten boor. Hierdoor kan een meer precieze dunner, terwijl glad langs de schedel. Controleer geringe dikte van de skull door zachtjes te tikken op het met een pincet. Stop polijsten als de schedel wordt enigszins flexibel.
- De verdunde craniale venster moet nu volledig glad en reflecterend en klaar voor imaging (figuur 1). Vanwege de aard van sterk verstrooiende weefsels van de hersenen moet de schedel worden verdund ten minste 55 urn voor optimale penetratiediepte. Een lijst met gebruikte materialen in Tabel 1.
3. Optical Coherence Tomography Imaging
- Na de operatie is voltooid, controleert u dier ademhaling en reflexen op het juiste niveau van de anesthesie te garanderen en extra verdoving toedienen, indien nodig. Verwijder dier uit de stereotactische frame, houd van dieren verpakt in chirurgisch afdekmateriaal, en het vervoer van dieren naar de beeldvorming station.
- Voordat beeldvorming de borden voor reflexen en toe te passen extra kunsttranen indien nodig. Monteren dier op het stereotactische frame de schedel beveiligen.
- Plaats dier onderOktober camera en plaats de TSCW onder de optische bundel (Figuur 2). Een dwarsdoorsnede van de schedel en de hersenen kunnen nu zichtbaar (figuur 3).
- Data acquisitie kan beginnen zodra gebied van belang is gelegen. Voor beeldvorming, we galvo spiegels een imaging window bereiken met een breedte van 4,0 mm. Een beeldvormend diepte van 2 mm werd verkregen met 6 mW incidenten vermogen en een knooppunt 1 mm onder de schedel verdund. Elke doorsnede bestond uit 2.048 axiale scans met een acquisitie-tarief van 0,14 sec per beeld.
- Volumetrische scans van de hersenen kan ook worden verkregen door het verzamelen van een reeks 2D dwarsdoorsneden door twee sets galvo spiegels voor xy scannen met de eerste galvo spiegel scannen de bundel in de sagittale richting en de tweede galvo spiegel scannen in het coronale richting.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nadat een verdund venster over de cerebrale cortex het vaatstelsel nu meer beeldbepalende (figuur 1) en maakt het mogelijk een diepere imaging diepte (tot 1 mm). De rechter cortex wordt verdund tot ongeveer 55 urn in vergelijking met een normale schedel gemeten op 140 urn (figuur 1) en biedt een betere optische helderheid. Worden verdund tot 10-15 urn kan 11 echter niet noodzakelijk het gebruik van glazen dekglaasjes en schedel platen niet worden toegepast in onze experimenten (figuur 1 en 2). Deze methode heeft ons toegestaan om specifieke structuren (cerebrale cortex, corpus callosum) te identificeren in onze oktober cross-sectionele beelden (Figuur 3). Parasagittal oktober beelden van een normale schedel (Figuur 3A) versus een verdunde schedel (Figuur 3B) worden de resultaten van een LGO beeld vergelijken met een succesvolle TSCW. Daarnaast een coronale doorsnede oktoberbeeld ook verkregen te vergemakkelijken identificeren middellijn structuren (Figuur 3C). De maximum signaalsterkte voor Figuur 3 is 45 dB boven de ruis. Een intensiteitsprofiel vergelijking van niet-verdund schedel en een verdunde schedel blijkt een grotere signaalintensiteit en een penetratiediepte in TSCW model (Figuur 4).
Figuur 1. TSCW in een muismodel. Een 4 x 4 mm verdund schedel venster (aangeduid in de gestippelde vierkantje) gecreëerd ~ 1 mm posterior en lateraal van bregma de juiste hersenhelft met verschillende tandheelkundige boren. De rechter cortex (verdund tot ongeveer 55 urn) aanzienlijk transparanter is dan de niet-verdunde schedel (links cortex, 140 urn) een grotere penetratiediepte voor optische beeldvorming met oktober β = bregma, λ = lambda, SS = sagittal hechtdraad.
Figuur 2. Oktober beeldvorming van TSCW in vivo. Een muismodel met een verdunde-schedel wordt bevestigd in een stereotactische frame onder de doelstelling oktober imaging in vivo.
Figuur 3. Oktober beelden van de cerebrale cortex in vivo. (A) parasagittal oktober beeld van de cortex onder een normale schedel. (B) parasagittal oktober beeld van de cortex onder een verdund schedel. (C) Coronale oktober beeld van een verdund schedel (links) en een normale schedel (rechts). De structuren van de hersenen zijn duidelijk zichtbaar onder een TSCW in vergelijking met een normale schedel. Beelden van oktober werden verkregen van dezelfde muis in vivo beeldvorming met maat 50,5 mm × 2 mm met een maximale signaal intensiteit van 45 dB. β = bregma, CC = corpus callosum, SS = pijlnaad, schaal bar = 1 mm.
Figuur 4. Intensiteitsprofiel vergelijkingen van de normale en verdund schedel prep. TSCW maakt toegenomen intensiteit van het signaal en de diepte penetratie. De TSCW bereikt een imaging diepte van ongeveer 1 mm met voldoende SNR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Imaging met OCT en een uitgedunde schedel is een nieuwe neuro-imaging techniek die pas onlangs onderzocht 15, 16. In onze experimenten hebben we aangetoond dat het mogelijk SD-OCT beeldvorming door middel van een TSCW in een muismodel in vivo. Van onze resultaten wordt de schedel verdund tot ongeveer 55 pm en de penetratiediepte wordt verkregen bij ongeveer 1 mm in resolutie van 8 urn en 20 um in de axiale en laterale richting, respectievelijk. In de signaalsterkte profiel, OCT imaging door een TSCW verhoogt de signaalintensiteit en penetratiediepte in vergelijking met een normale schedel (figuur 4). In vergelijking, twee-foton beeldvorming met een TSCW op schedel dikte van ~ 10-15 urn bereiken beeldvorming diepte van 150-250 um onder pial oppervlak 10, 11, 13 met axiale resolutie ~ 3 pm 10 terwijl een verdunde schedel van ~ 20 urn beeldvorming diepte kan oplopen tot 300-400 micrometer binnen de hersenschors 12. Overall, optische beeldvorming met OCT blijkt een veelbelovende beeldvormende modaliteit, waardoor een dikkere TSCW tijdens het verdunnen, terwijl het verstrekken diepere diepte penetratie dan mutiphoton microscopie.
Gebruikmakend van een uitgedunde schedel is voordelig in optische beeldvorming, zoals 15 oktober 16 en twee-foton microscopie 10-13 omdat het weinig tot geen neuroinflammatie vergeleken met een craniotomie als verdunning wordt uitgevoerd met succes 11, 12, 15, 16,. Gebruikmakend van een craniotomie voor beeldvorming kan leiden reactieve microglia en opregulatie van gliale fibrillaire zure proteïne (GFAP) in reactieve astrocyten na beledigingen naar de hersenen. Echter, beeldvorming na de aanneming van een verdunde-schedel techniek onthult niet-actieve microglia en zwakke GFAP immunokleuring impliceren niet-reactieve astrocyten 10. Door juiste verdunning van de schedel, specifieke structuren binnen de cerebrale cortex, zoals microglia morfologie en corticale vasculatuur, ceen onderscheiden 11-13. Toch zijn er nadelen van het gebruik van een TSCW voor optische beeldvorming. Als de schedel niet verdund tot de juiste dikte of de hoofdhuid ruwe oppervlakken door ondeskundig dunner penetratiediepte voor beeldvorming kan worden beperkt. Een ander nadeel voor de slechte beeldvorming diepte kan het gevolg zijn van sub-durale bloeding als gevolg van trillingen van het boren. Bloeden onder de dura onvermijdelijk en kan daarom niet gebruikt worden voor oktober imaging. In dergelijke gevallen moet een nieuw diermodel worden gebruikt voor het experiment.
Het identificeren van bepaalde structuren binnen de cortex met behulp van oktober door middel van een TSCW kan behulpzaam zijn bij het opsporen neurodegeneratieve ziekten en bij het bestuderen van veranderingen in de hersenfunctie. Imaging bloedstroom kan worden bereikt door Doppler 17 oktober 18 als kwantificeren cerebrale bloedstroom voorop de controle op de metabolische behoeften van de hersenen te bestuderen beroerte, ziekte van Alzheimer 18 of hersentumoren 17. Axonaleen neuronale degeneratie is ook prominent aanwezig in OCT beelden en kunnen profiteren studies van verschillende hersenaandoeningen. Door beeldvorming de retinale zenuwvezellaag (RNFL), die ganglion cellen axonen mechanismen van neurodegeneratie, neuro-bescherming en neuro-fix niet alleen zichtbaar in optische stoornissen maar ook in neurologische ziekten zoals Parkinson's 19 en multiple sclerosis 20, 21, waarvan laatstgenoemde is in detail onderzocht door meting van de macula 21 en netvlies laagdikte door oktober segmentatietechnieken 20.
Neuro-imaging met OCT is niet alleen beperkt tot beeldvorming structuren en functies van de hersenen. Oktober voordelig kan zijn bij chronische in vivo imaging 10, 11 en in stereotactische procedures zoals elektrofysiologische studies en microinjectie 1, 3, 15-17. In neurochirurgie kan oktober worden gebruikt als een biopsie of leirollen werktuig 2 doordat chirurgen omreal-time feedback beelden van specifieke anatomische kenmerken in de hersenen 17. Met de verdere ontwikkelingen, geloven wij dat onze huidige combinatie van SD-OCT met een TSCW heeft de potentie om een clinicus in staat is om de diagnose neurologische tekorten te verbeteren wanneer het wordt toegepast met andere modaliteiten, zoals een intracraniële druk (ICP) monitor 22, magnetische resonantie beeldvorming ( MRI) of gecomputeriseerde axiale tomografie (CAT) 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de UC Discovery Proof of Concept subsidie en door de NIH (R00 EB007241). De auteurs willen ook graag Jacqueline Hubbard bedanken voor haar hulp bij dit experiment.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-542-02 | |
| Xylazine | Akorn, Inc. | 139-236 | |
| Artificial Tears Ointment | Rugby | 0536-6550-91 | |
| Nair | Church Dwight Co., Inc. | 4010130 | |
| Sterile Alcohol Prep Pad | Kendall Healthcare | 6818 | |
| Cotton Tipped Applicators | Fisherbrand | 23-400-115 | |
| Betadine Solution Swabstick | Purdue Products | 67618-153-01 | |
| Saline Solution, .9% | Phoenix Pharmaceuticals | 57319-555-08 | |
| Stereotactic Frame | Stoelting | ||
| High Speed Surgical Hand Drill | Foredom | 38,000 rpm | |
| Carbide Round Bur | Stoelting | 0.75 mm | |
| Dura-Green Stones | Shofu | Shank: HP Shape: BA1 |
|
| CompoMaster Coarse & CompoMaster Polisher | Shofu | Shape: Mini-Pt. | |
| SpaceDrapes | Braintree Scientific, Inc. |
References
- Bizheva, K., Unterhuber, A., Hermann, B., Povazay, B., Sattmann, H., Drexler, W. Imaging ex vivo and in vitro brain morphology in animal models with ultrahigh resolution optical coherence tomography. Journal of Biomedical Optics. 9, 719-724 (2004).
- Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography for ultrahigh resolution in vivo imaging. Nature Biotechnology. 21, 1361-1367 (2003).
- Wantanabe, H., Rajagopalan, U. M., Nakamichi, Y., Igarashi, K. M., Kadono, H., Tanifuji, M. Swept source optical coherence tomography as a tool for real time visualization and localization of electrodes used in electrophysiological studies of brain in vivo. Biomedical Optics Express. 2, 3129-3134 (2011).
- Huang, D., Swanson, E. A., Lin, C. P., Schuman, J. S., Stinson, W. G., Chang, W., Hee, M. R., Flottee, T., Gregory, K., Puliafito, C. A., Fujimoto, J. G.
- Mitsui, T. Dynamic range of optical reflectometry with spectral interferometry. Japanese Journal of Applied Physics. 38, 6133-6137 (1999).
- de Boer, J. F., Cense, B., Park, B. H., Pierce, M. C., Tearney, G. J., Bouma, B. Improved signal-to-noise ratio in spectral-domain compared with time-domain optical coherence tomograhy. Optics Letters. 28, 2067-2069 (2003).
- de Boer, J. F. Ch. 5. Optical Coherence Tomography: Technology and Applications. , Springer. (2008).
- Choma, M. A., Sarunic, M. V., Yang, C., Izatt, J. A. Sensitivity advantage of swept source and fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 11, 2183-2189 (2003).
- Leitgeb, R. A., Drexler, W., Unterhuber, A., Hermann, B., Bajraszewski, T., Le, T., Stingl, A., Fercher, A. F. Ultrahigh resolution fourier domain optical coherence tomography. Optics Express. 12, 2156-2165 (2004).
- Drew, P. J., Shih, A. Y., Driscoll, J. D., Knutsen, P. M., Blinder, P., Davalos, D., Akassoglou, K., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nature Methods. 7, 981-984 (2010).
- Shih, A. Y., Mateo, C., Drew, P. J., Tsai, P. S., Kleinfeld, D. A Polished and Reinforced Thinned-skull Window for Long-term Imaging of the Mouse. J. Vis. Exp. 61, e3742 (2012).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice. Nature Protocols. 5, (2010).
- Lu, M., Majewska, S., K, A., Gelbard, H. A. A Thin-skull Window Technique for Chronic Two-photon In vivo Imaging of Murine Microglia in Models of Neuroinflammation. J. Vis. Exp. (43), e2059 (2010).
- Wang, Y., Oh, C. M., Oliveira, M. C., Islam, M. S., Ortega, A., Park, B. H. GPU accelerated real-time multi-functional spectral-domain optical coherence tomography system at 1300nm. Optics Express. 20, 14797-14813 (2012).
- Aguirre, A. D., Chen, Y., Fujimoto, J. F. Depth-resolved imaging of functional activation in the rat cerebral cortex using optical coherence tomography. Opt. Lett. 31, 3459-3461 (2006).
- Chen, Y., Aguirre, A. D., Ruvinskaya, L., Devor, A., Boas, D. A., Fujimoto, J. G. Optical coherence tomography (OCT) reveals depth-resolved dynamics during functional brain activation. Journal of Neuroscience Methods. 178, 162-173 (2009).
- Liang, C., Wierwille, J., Moreira, T., Schwartzbauer, G., Jafri, M. S., Tang, C., Chen, Y. A forward-imaging needle-type OCT probe for image guided stereotactic procedures. Opt Express. 19, 26283-26294 (2011).
- Srinivasan, V. J., Sakadzic, S., Gorczynska, I., Ruvinskaya, S., Wu, W., Fugimoto, J. G., Boas, D. A. Quantitative cerebral blood flow with optical coherence tomography. Optics Express. 18, 2477-2494 (2010).
- Galetta, K. M., Calabresi, P. A., Frohman, E. M., Balcer, L. J. Optical Coherence Tomography (OCT): imaging the visual pathway as a model for neurodegeneration. The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 8, 117-132 (2011).
- Seigo, M. A., Sotirchos, E. S., Newsome, S., Babiarz, A., Eckstein, C., Ford, E., Oakley, J. D., Syc, S. B., Frohman, T. C., Ratchford, J. N., Balcer, L. J., Frohman, E. M., Calabresi, P. A., Saidha, S. In vivo assessment of retinal neuronal layers in multiple sclerosis with maual and automated optical coherence tomography segementation techniques. J. Neurol. , (2012).
- Frohman, E. M., Fujimoto, J. G., Frohman, T. C., Calabresi, P. A., Cutter, G., Balcer, L. J. Optical coherence tomography: a window into the mechanisms of multiple sclerosis. Nature Clinical Practice. 4, 664-675 (2008).
- Gill, A. S., Rajneesh, K. F., Owen, C. M., Yeh, J., Hsu, M., Binder, D. K. Early optical detection of cerebral edema in vivo. J. Neurosurg. 114, 470-477 (2011).
