Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Всего горы РНК Флуоресцентные Published: January 30, 2013 doi: 10.3791/50057
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 2Department of Biochemistry, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Здесь мы опишем весь монтаж флуоресцентных

Abstract

Оценка экспрессии генов, а также субклеточном свойства локализации его транскрипции РНК, являются ключевыми для понимания особенностей его биологической функции в процессе разработки. РНК в гибридизация (РНК-ISH) представляет собой мощный метод, используемый для визуализации свойств РНК распределения, будь то на организменном, клеточном и субклеточном уровнях 1. РНК-ISH основан на гибридизации меченого зонда нуклеиновой кислоты (например, антисмысловую РНК, олигонуклеотиды), комплементарный последовательности мРНК и некодирующих РНК объектом интереса 2. Так как процедура требует первичной информации о последовательности только для генерации последовательности конкретных датчиков, он может применяться универсально для широкого круга организмов и образцов тканей 3. Действительно, ряд крупномасштабных ISH исследования были реализованы к документу экспрессии генов и РНК локализации динамики в различных модельных организмов, которые привели ксоздание важных ресурсов сообщества 4-11. В то время как различные маркировки и обнаружения зонда стратегии были разработаны на протяжении многих лет, в сочетании использование флуоресцентно-меченных обнаружения реагентов и ферментативных реакций усиления сигнала предлагают значительные улучшения чувствительности и разрешающей процедуры 12. Здесь мы описываем оптимизированы флуоресцентные на месте методом гибридизации (FISH) с использованием tyramide усиления сигнала (TSA) для визуализации экспрессии РНК и локализации динамику в постановке эмбрионов дрозофилы. Процедура проводится в 96-луночный ПЦР планшет формата, что значительно облегчает одновременную обработку большого количества образцов.

Protocol

1. РНК-зонд подготовка

Обзор: В следующем разделе описаны шаги, необходимые, чтобы сделать дигоксигенин (Dig)-меченных РНК-зондов подходящих для рыбы. На первом этапе клонирования или ПЦР-амплификации последовательности, соответствующей транскрипции область интересующего гена, который будет использоваться для генерации последовательности конкретных зонда. Это может быть достигнуто путем клонирования первый сегмент гена в плазмиду, в которых сайт множественного клонирования в окружении бактериофага промоутер элементов (T7, Т3 или SP6), которая может служить в качестве шаблона для ПЦР с использованием фланкирующих праймеров, которые включают последовательности промотора , создавая таким образом линейную продуктов ПЦР с различных последовательностей промотора на каждой конечности (рис. 1А). Кроме того, чтобы избежать клонирования шаг, можно также выполнять ПЦР-амплификации с геномной ДНК или кДНК с использованием олигонуклеотидов, которые включают T7, Т3 или SP6 последовательности в их 5 'конечностей (например, T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). Линейные продуктов ПЦР затем используются в качестве шаблонов, чтобы сделать Dig-меченных смысловой или антисмысловой РНК-зонды на стоке в пробирке транскрипции с соответствующей полимеразы (рис. 1b). При изготовлении датчиков для конкретных генов, мы рекомендуем подготовки как смысловой и антисмысловой РНК-зонды использованием различных полимераз, которые будут полезны для оценки FISH сигнал специфичность (т.е. если интерес ген транскрибируется в антисмысловой ориентации, чувство РНК-зонд покажет уровень фонового сигнала). Во всех следующих шагов, следует проявлять большую осторожность, чтобы избежать возможных деградации загрязняющих рибонуклеазы (РНКазы), сначала убрать все скамейки площадей и оборудования с 70% этанола или коммерческие дезактивации РНКазы решения и с помощью РНКазы без принадлежностей (например, вода, Советы, микроцентрифужных трубы).

Массачусетстериалов

  • 1,5 мл микроцентрифужных трубы, (Abgene, Rochester, NY, USA кат. Нет 0900)
  • Гель-экстракция наборы (QIAGEN, Mississauga, ON, Канада;. Кат № 28706).
  • РНКазы свободной воды (зубра, Inc кат. № 809-115-CL)
  • РНК-полимеразы (T7, T3, или SP6). (20 ед / мкл, Fermentas Biosciences. Кат. EP0101, EP0111, EP0131).
  • РНКазы-OUT рибонуклеазы ингибиторы (40 ед / мкл), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Номер 10777-019).
  • Дигоксигенин (DIG) нуклеотидные смеси (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Лаваль, Квебек, Канада. Кат. No.11209256910).

Оборудование

  • Настольная микро-центрифуге
  • Гель-электрофореза аппарата
  1. ПЦР усилить ген-специфической последовательности из геномной ДНК, кДНК или плазмидной ДНК для создания линейного продукта ПЦР в окружении бактериофага Т7, Т3 или SP6 последовательностей промотора. Следуйте рекомендациям производителя по условиям ПЦР.
  2. Проверка качества и сиZE продукта ПЦР методом электрофореза в агарозном геле. Акцизы и очищают ПЦР-продукта с использованием стандартной гель-экстракции комплект в соответствии с рекомендациями производителей и элюирования продукта в 50 мкл буфера.
  3. Осадок продукта ПЦР добавлением 5 мкл 3М ацетата натрия (рН 5,2) и 150 мкл ледяного 100% этанола, и поместить трубы при -70 ° C в течение ночи. Центрифужные пробирки при 13000 х г в течение 10 мин при 4 ° C и мыть гранул с 70% этанола. Побочные снова, удалите все следы этанола и воздушно-сухой осадок. Ресуспендируют в 25-50 мкл РНКазы без воды.
  4. Расшифруйте Dig-меченого зонда с использованием 200-500 нг очищенного продукта ПЦР в 20 мкл реакции следующим образом: 2 мкл 10X буфера транскрипции Т7 (Invitrogen), 1 мкл (20 ед / мкл) ингибитор РНКазы, 2 мкл Dig-NTP смеси , и 2 мкл Т7 РНК-полимеразы (20 ед / мкл). Принесите конечный объем до 20 мкл РНКазы без воды. Инкубируйте транскрипции реакции при 37 ° С в течение 3-4 часов.
  5. Отрегулируйте Закавкription смесь до 50 мкл РНКазы без воды и осаждения Dig-меченой РНК зонд, как описано в шаге 4. Ресуспендируют промытый осадок РНК в 100 мкл РНКазы без воды. Хранить ресуспендированных образцы при -70 ° C.
  6. Количественная зонда с использованием NanoDrop спектрофотометр. Для проверки качества зонда, запуск 1-2 мкл образца на 1-2 окрашенных% агарозном геле с этидийбромидом.

2. Сбор и фиксация эмбрионов Drosophila

Обзор: В этом разделе описаны шаги для уборки и обработки поставил Drosophila эмбриона. В зависимости от количества эмбрионов необходимо, мухи могут быть сохранены в популяции клеток различных размеров. Следующие шаги для коллекции осуществляется с помощью 900 см 3 цилиндрическими клетками использованием 100-мм пластин яблочный сок коллекции. Правильная фиксация требует удаления из двух защитных слоев, окружающих зародыш: внешний хориона и внутренней vitellinэлектронной мембраны 13. После уборки урожая, эмбрионы сначала купались в 50% раствором хлорной извести для удаления хориона, то они смешиваются в двухфазный раствор, содержащий гептан (permeabilizes желточной оболочки), и ФБР, содержащего 3,7% формальдегида. Желточной оболочки, затем трещины и удалена путем переноса эмбрионов в двухфазной смеси гептана и метанола. Правильное закрепление эмбриона и удаление желточной оболочки имеет решающее значение для успеха ниже процедуру FISH.

Материалы

  • Сок яблочно-агара (40% яблочного сока, 4% сахарозы, 3,5% агара, 0,3% метилпарабен) с копейки размера дрожжей пасты (пекарских дрожжей смешивают с водой, маслом консистенции)
  • Сухое параформальдегида (Electron наук микроскопии, Hatfield, Пенсильвания, США;. Кат № 19208)
  • Гептан
  • Метанол
  • 3% раствор хлорки
  • 20 мл стеклянные сцинтилляционные флаконы (Thermo Fisher Scientific, Оттава, Онтарио, Канада;. Кат № 03-337-15).

Оборудование

  • Население клетки
  • Коллекция корзины (с использованием сетки Nitex и верхней части разреза 50 мл полипропиленовые трубы, в которой дыра была сокращена в крышке).
  • Малые кисти
  • Столешница вихревой
  1. Предварительно ясно сытого населения клетки с свежий яблочный сок / дрожжей плиты в течение 1 часа при 25 ° C.
  2. Добавить новый яблочный сок / дрожжей пластины к клетке, чтобы урожай ранних эмбрионов стадии. Инкубируйте клетки в течение 4 часов при 25 ° C (обратите внимание, что коллекция раз может быть скорректирована в зависимости от желаемой стадии).
  3. Подготовка свежих 37% раствор формальдегида, объединив 3,7 г параформальдегида порошка, 70 мкл 2N KOH и 7,3 мл MilliQ воды во флаконе сцинтилляционного стекла под химическим капот. Варить до тех пор пока решение параформальдегида порошок полностью не растворится, затем охлаждают до комнатной температуры и фильтр в новом флаконе сцинтилляционные.
  4. Подготовка двухфазный раствор фиксацииобъединение 2,25 мл 1X PBS с 250 мл 37% формальдегида в сцинтилляционный флакон, затем добавить 7,5 мл гептана.
  5. Заготавливают пластины яблочный сок из клетки и собирать эмбрионов, добавив немного воды комнатной температуры крана и деликатно чистки эмбрионов от пластины с кистью. Передача ресуспендированных эмбрионов в корзину и смойте теплой водой из-под крана.
  6. Dechorionate эмбрионов в течение 90 сек, купаясь коллекции корзины в раствор отбеливателя, затем тщательно смыть теплой водой из-под крана (до отбеливатель запах ушел).
  7. Разберите корзину для сбора, сбора эмбрионов осторожно помощью кисти и перенести их в двухфазной фиксации решения. Эмбрионы будут накапливаться на границе между PBS и гептана слоев.
  8. Печать сцинтилляционные флаконы и крепятся к вихревой смеситель. Встряхните в течение 20 мин на минимальное значение.
  9. Снимите и выбросьте самых нижних и верхних PBS гептан фаз при помощи пипетки Пастера. Произносить с придыханиемоставшиеся PBS / гептан / эмбрионов смесь в пипетку. В капле моды, отказаться от нижнего PBS фазы из пипетки, стараясь не устранит эмбрионов. Депозит эмбрионов в 1,5 мл пробирку, содержащую двухфазный раствор 500 мкл гептана (верхняя фаза) и 500 мкл метанола (нижняя фаза).
  10. Встряхнуть труб энергично руки в течение 30-45 секунд, чтобы взломать желточной мембраны. Как только трещины, эмбрионы будут погружаться в метаноле.
  11. Откажитесь от верхнего гептан фазы и без трещин эмбрионов на гептан / метанол интерфазе, и добавить 500 мкл метанола. Встряхивают в течение 5 сек.
  12. Промыть 3 раза с метанолом и хранения эмбрионов при -20 ° C (на данный момент эмбрионы могут храниться в течение недель / месяцев).

3. После фиксации обработки, гибридизация и пост-гибридизации автомойки

Аннотация: В этом разделе подробно описываются этапы обработки эмбрионов пермеабилизации до FISH, предварительно гибридизации,гибридизации с РНК-зондов и пост-гибридизации стирок. Для первых шагов пермеабилизации эмбрионов обрабатываются как бассейн в одной пробирке (шаги 1-9 ниже, направленных на 10-15 мкл поселился эмбрионов / образец), но они аликвоты на отдельные лунки 96-луночный планшет ПЦР Прежде чем приступить к предварительной гибридизации шаге (шаг 10 ниже). Это помогает обеспечить даже лечения всех эмбрионов на начальных этапах эксперимента. При настройке FISH эксперимент, важно, чтобы включить отрицательного контроля для определения уровня фонового сигнала в отдельных экспериментах. Для этого, мы рекомендуем, в том числе образец «не-зонда и, как отмечено в разделе 1, пример гибридизации с« смысл »РНК-зондов, которые, как правило, дают сигнал сравним с условием« не-зонда.

Материалы по теме:

  • Метанол
  • Фосфатным буферным раствором с 0,1% Tween-20 (PBT)
  • Протеиназы K-1 мг / мл маточного раствора (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Канада. Инвентарный номер P2308)
  • Глицин (20 мг / мл раствора)
  • Гибридизация решения: 50% формамида, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 100 мкг / мл стриженой ДНК спермы лосося, 100 мкг / мл гепарина.
  • 0,2 мл halfskirted 96-луночные ПЦР планшеты, Abgene, Rochester, NY, USA кат. Нет 0900)

Оборудование

  • Гибридизация печь, цифровой блок нагрева или водяной бане регулируемый до 56 ° C, 80 ° C или 100 ° C, или машина ПЦР.
  • Многоканальные пипетки (рекомендуется для упрощения промывки)
  • Nutating смеситель
  1. Промойте эмбрионы в метаноле, затем в смеси 1:1 метанол: PBT, а затем дважды в PBT.
  2. Исправить эмбрионов в течение 20 мин в 1 мл PBT содержащий 3,7% формальдегида (свежеприготовленный как описано в шаге 11) с постоянной покачивание на nutator.
  3. Промойте эмбрионы 3 раза в течение 2 минут в PBT в то время как качалка.
  4. Приготовить раствор из 3 мкг / мл протеиназы К (PK) разводят в PBT и добавьте500 мкл раствора для образцов. Инкубируйте образцы в течение 10 мин при комнатной температуре, без встряхивания. Смешать эмбрионов каждые 2 мин струйное с помощью пипетки или, мягко обращения трубы.
  5. Трансфер эмбрионов образцы на льду в течение 1 часа.
  6. Перемещение образца до комнатной температуры и удаления PK решение. Промойте 2 раза по 2 мин с 1 мл PBT + 2 мг / мл глицина.
  7. Исправить образцы 20 мин в 1 мл PBT + 3,7% формальдегида с качалки. Промойте эмбрионы в 5 раз PBT.
  8. Промойте эмбрионы с 1 мл смеси 1:1 PBT и Hyb решение. Заменить 0,5-1 мл на 100% Hyb решение (на этом этапе эмбрионы могут храниться в течение нескольких дней / недель при температуре -20 ° C).
  9. Алиготе эмбриона на отдельные лунки 96-луночный планшет (цель на ~ 10-15 мкл поселился эмбрионов / а, заботиться, чтобы использовать широкую апертуру советов, чтобы избежать повреждения эмбрионов).
  10. Отварить 100 мкл / образец Hyb раствор в течение 5 мин, а затем охлаждают на льду в течение 5 мин. Это решение используется для подготовки проб-гибридизации (Pre-Hyb).
  11. Добавить 100 мкл / образец предварительного Hyb решения и инкубировать в течение не менее 2 ч при 56 ° C.
  12. Для каждого образца, развести ~ 100 нг зонда в 100 мкл раствора Hyb. Тепло при 80 ° C в течение 3 мин, затем охлаждают на льду в течение 5 мин (с подогревом зонды могут быть сохранены на льду в течение нескольких часов).
  13. Удалить предварительного Hyb раствор из эмбрионов и заменить решение зонд РНК.
  14. Гибридизации при 56 ° C в течение 12-16 часов.
  15. Предварительно теплой следующие решения стирка при 56 ° C: (A) 200 мкл / образец решения Hyb; (B) 100 мкл / образец со счетом 3:1 смесь Hyb: PBT; (C) 100 мкл / образец 1:01 сочетание Hyb: PBT; (D) 100 мкл / образец 1:03 сочетание Hyb: PBT; (E) 400 мкл / образец PBT.
  16. Промыть образцов с 100 мкл промывочного раствора, а затем выполнить промывания с 100 мкл / образец AD решения при 56 ° C в течение 15 минут каждый. Затем вымыть образцов 4 раза по 5 мин с 100 мкл / образец решения E при 56 ° C.
  17. Прохладный образцы до комнатной температуры.

Обзор: Данный раздел описывает антител и обнаружения реагентов, используемых для обнаружения и визуализации распределения сигнала РНК-зонд следующие гибридизации. Эти шаги изложены схематично на рисунке 2. Здесь мы только представляем стандартных реагентов обнаружения, которые мы используем для надежного усиления сигнала, но существует множество коммерчески доступных реагентов, которые могут быть использованы в качестве альтернативы, особенно при выполнении двойного FISH экспериментов по совместной выявления различных РНК одновременно для белка-РНК двойной окрашивание. Примеры результатов, полученных с помощью этого протокола отображается в экспрессию мРНК / локализации мозаики на рисунке 3.

Материалы

  • HRP-конъюгированных моноклональных антител мыши-DIG (Jackson Laboratories, Inc ImmunoResearch Кат. 200-032-156)
  • Биотин-сопряженных мышиных моноклональных анти-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc кат. Номер 200-062-156)
  • Стрептавидин-HRP конъюгата (Molecular Probes, Eugene OR, США, кат. No.S991)
  • Cy-3-tyramide конъюгатов (Perkin Elmer Life Sciences, Бостон, Массачусетс, США, Кат. SAT704A)
  • DABCO решение для монтажа: в 50 мл трубки, развести 1,25 грамма DABCO (1,4-диазабицикло [2.2.2] октан; Sigma D-2522) в 15 мл 1X PBS, а затем добавить 35 мл глицерина и перемешать до полного однородным. По предварительным смешиванием с PBS, порошок DABCO растворяется очень быстро. Магазин решение для монтажа при температуре -20 ° C.
  • Предметные стекла, покровные

Оборудование

  • Nutating смеситель
  • Многоканальные пипетки
  • Флуоресцентный микроскоп
  1. Подготовка PBTB раствор, содержащий PBT + 1% сухого обезжиренного молока (обычно 50-100 мл достаточно для всех инкубации обнаружения реагентов и промывки).
  2. Блок образцов в течение 10 мин при комнатной температуре в 100 мкл PBTB / образец в то время как покачиваясь на nutator.
    3. <li> Удалить блокирующий раствор из эмбрионов и инкубировать образцы в течение 1,5-2 часов при комнатной температуре с 100 мкл / образец моноклональных биотин анти-DIG раствор антител (разбавленный 1/400 со склада в PBTB) с качалки.
  3. Вымойте образцов в 6 раз по 5 мин с 100 мкл PBTB / образца с качалки.
  4. Инкубируйте 1,5 часа при комнатной температуре с 75 мл / образец стрептавидин-HRP раствора (разводят 1/100 со склада в PBTB, 10 мкг / мл конечная концентрация) с качалки.
  5. Вымойте образцов в 6 раз по 5 мин 100 мкл PBTB / образца с качалки (для ДНК counterstaining, развести DAPI в 1X рабочей концентрации в PBTB и использовать это решение на первом этапе стирки).
  6. Промойте эмбрионы с PBT, затем промыть 2 раза в течение 5 мин с PBS.
  7. Инкубируйте образцы в течение 2 часов при комнатной температуре на nutator с 50 мкл / образец Cy3-tyramide раствора (разводят 1/50 Tyramide в буфер усиления). С этого шага, убедитесь, хранить образцы в свете экранированные розетки. </ Li>
  8. Вымойте образцов в 6 раз по 5 мин с 100 мкл PBS / образца на nutator.
  9. Удалить PBS и добавьте 100-125 мкл / образец монтажа раствора, содержащего 70% глицерина и 2,5% (DABCO). Магазин образцов при температуре 4 ° C. Эти образцы могут храниться в течение нескольких лет.
  10. Использование широким отверстием наконечника, ресуспендируют эмбрионов, осторожно пипеткой проб и передать 25 мкл эмбрионов на предметное стекло, затем поместите покровное над эмбрионами и уплотнение на слайд с лака для ногтей.
  11. Анализ эмбриона образцов с использованием флуоресцентного микроскопа.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Когда выполняется успешно, эта процедура предлагает поразительно повышения уровня детализации в пространственно-временной анализ экспрессии генов и динамику локализации мРНК во время раннего эмбриогенеза дрозофилы. Действительно, как показано на рисунке 3А для классической парой-правила гена коротышка (Run), можно использовать этот протокол для наблюдения событий экспрессии генов с помощью выявления зарождающихся очагов стенограмму в группах выражения ядер. Кроме того, как показано в зародыше мозаики на рисунке 3b, метод позволяет визуализировать локализацию мРНК особенности в высоком разрешении.

Рисунок 1
Рисунок 1. Структура РНК процедуру подготовки зонда. (А) Схематическое представление нашей стратегии для синтеза Dig-меченых зондов РНК в пробирке транскрипции Усинга линейного шаблона ДНК бактериофага окружении с элементами промотора РНК-полимеразы. (B) Изображение стандартного 1% агарозном геле, показывающие примеры в пробирке транскрипции РНК-зондов для гистона H2A, запуска и док транспозона РНК. Мы обычно выполняют бок-о-бок электрофорез как шаблон ПЦР и РНК-зонда. РНК обычно появляется как интенсивные дискретные группы с более высокой подвижностью по сравнению с шаблоном

Рисунок 2
Рисунок 2. Схематическое изображение зонда обнаружения шаги в FISH метода. После зонда гибридизации обработанных эмбрионов, Dig-меченых зондов отражаются с использованием биотинилированного α-Dig антитела, которые затем в комплексе с HRP-конъюгированных стрептавидином. Tyramide усиления сигнала (TSA) затем выполняется в результате преобразования tyramide реагента в свободный радикал т формеhrough деятельности HRP. Временно реактивной tyramide свободных радикалов, ковалентно связываться с ароматическими остатками поблизости белки, предотвращая их распространение вдали от зонда месте. Tyramide подложки комплекс с флуоресцентными красителями, которые могут быть обнаружены с помощью флуоресцентной микроскопии.

Рисунок 3
Рисунок 3. Примеры результатов, полученных с помощью этой процедуры FISH подчеркивая разнообразие экспрессию мРНК и субклеточных модели локализации в эмбрионах дрозофилы. (A) FISH анализа пара-правила ген работает на различных стадиях эмбриогенеза показывает, как начальная широкой выражение в средней части зародыша на эмбриональной стадии 4 перерабатывается в сегментированные картины полос на более поздних стадиях. (B) Мозаика изображением рыбы результаты, показывающие различные варианты мРНК localizatioп моделей в стадии 4-7 эмбрионов. FISH проводили с использованием Dig-меченых зондов, которые антисмысловых гибридизовали и обнаружил последовательной инкубации с биотинилированным анти-Dig антитела, стрептавидин-HRP, и Cy3 tyramide. РНК = синий, ДНК = красный. Шкала бар () = 25 мкм, тогда как в (B) = 50 мкм.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Для шагов зонд синтеза, мы обычно генерируют стоки антисмысловых РНК-зондов в пробирке транскрипции от полной длины кДНК Drosophila амплифицировали из плазмиды найден у дрозофилы ген Collection (РСК), ресурс подробно описаны на сайте: http://www .fruitfly.org / РСК / index.html 14,15. Этот подход широко используется в больших масштабах ISH исследований, направленных на отображение экспрессии генов и модели локализации мРНК в лету эмбрионов 9,16. DGC плазмид можно заказать геномной Drosophila ресурсный центр ( https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ). Гибкость в исходных материалах и проектирования пользовательских праймеров с T7, SP6 или T3 свесами позволяет легко создавать зонды для выявления специфических изоформ мРНК (например, варианты альтернативного сплайсинга) оГ некодирующих РНК, которые не представлены в стандартном кДНК коллекций. При рассмотрении проектирования изоформ-специфических зондов, мы обнаружили, что шаблоны от 250-1,000 базы может дать отличные результаты FISH.

Для рыбы в лету эмбрионов, мы не фрагмент наши зонды карбоната лечение, а, скорее мы используем во всю длину стоки стенограммы, которая может варьироваться в размерах между 500-5,000 базы. При выполнении рыбу на других тканей, которые являются менее проницаемой для больших зондов, фрагментация действительно может способствовать проникновению зонда. Тем не менее, мы предпочитаем вариант подготовки зонда с помощью меньших ПЦР-амплифицированных ДНК-матриц, или объединения нескольких индивидуально-синтезировали небольшие зонды вместе, а не выполнять химическую фрагментации больших зондов, которые могут дать различные результаты и снижение общего качества зонда.

Как описано в шагах эмбрионов, мы обычно добавляем дрожжи пасты на пластинах эмбрионов. Дрожжи паста будет в значительной степениувеличить количество яиц, отложенных мухами, а производство яиц зависит от питательной среды 17. Кроме того, дрозофилы мухи часто откладывают яйца прямо в дрожжевые пасты. Эти эмбрионы могут легко быть собраны путем растворения дрожжей вставьте в воде с помощью небольшой кисти и пропуская смесь через коллекцию корзине. Для dechorionation шаг, 3% раствором хлорной извести, подготовленные путем разбавления коммерческого отбеливателя (как правило, 6%-ной концентрации) 1:1 с водой, используется в большинстве протоколов 13,18,19. По нашему опыту, мы обнаружили, что инкубации эмбрионов с 3% раствором хлорной извести в течение 90 сек предлагает эффективные dechorionation. Эти параметры могут нуждаться в корректировке в зависимости от коммерческой раствором хлорной извести, которая доступна, но следует позаботиться, чтобы не передержать эмбрионов для отбеливания, так как это может привести к повреждению образцов. Для контроля dechorionation процедуру более внимательно, то можно посмотреть на эмбрионы под микроскопом тO Убедитесь, что dechorionation завершения реакции, т.е. зародыши теряют свои спины придатков, когда они dechorionated. Наконец, для обеспечения надлежащей фиксации эмбриона, мы используем свежеприготовленные растворы формальдегида, как старые решения, как правило, выпадают в осадок. Для дальнейшего использования, эта процедура была описана в предыдущих статьях методы 13,18,19.

Для шагов, относящиеся к проницаемости эмбриональных тканей с протеиназы К, или обнаружения реагентов, таких как антитела и Cy-3-Tyramide, мы нашли оптимальные результаты, используя разведения, описанных в данном протоколе. Тем не менее, из-за различий в лабораторных условиях и реагента акции, мы рекомендуем, чтобы каждая лаборатория эмпирически проверить свои реагентов для определения наилучших рабочих концентраций для своих конкретных потребностей. Кроме того, мы нашли оптимальные концентрации реагента может варьироваться в зависимости от ткани проанализированы.

Для того, чтобы FISH процедуры яс давая последовательно воспроизводимых результатов, мы рекомендуем всегда добавляем несколько положительных элементов управления для анализа, который может включать в себя датчики для стенограммы с четко определенным выражением / локализации моделей (например пробега). Стенограммы с поразительной локализации мРНК моделей во время раннего эмбриогенеза дрозофилы можно найти на Fly-FISH веб-сайт ( http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ). Наоборот, для контроля фонового сигнала обнаружения, как уже говорилось выше, следует также включать «не-зонда" и / или чувство образцов РНК зонд.

В дополнение к Cy3 сопряженных tyramide описанных в этом протоколе, есть множество других коммерчески доступных флуорохромом сопряженных tyramide реагентов из Perkin Elmer Life Sciences или молекулярные зонды (Invitrogen, Канада, Inc), которая может обеспечить дополнительную гибкость для многоцветных изображений эксперименты . Хотя этот метод описывает наши основные procedЮр для одной рыбы РНК, вариации этого метода могут быть реализованы для более сложных экспериментов, таких как двойной РНК рыбы или РНК-белок совместного обнаружения. Для деталей, относящихся к этим процедурам, мы рекомендуем следующие процедуры, описанные в существующих методов FISH работ 18-20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Нет конфликта интересов объявлены.

Acknowledgments

Работы, проводимые в лаборатории Лекьюайер поддерживается финансирование от Национального наук и инженерного совета Канады (NSERC), Канадский институт исследований в области здравоохранения (CIHR) и Фон-де-Recherche ан Здоровье Квебека (FRSQ). Фабио Алексис Лефевра и Гаэль Moquin-Бодри поддерживается NSERC студентов studentships исследования, в то время как Кэрол Iampietro поддерживается Angelo Pizzagalli докторской стипендии.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T7, T3 or SP6 RNA Polymerase Fermentas Life Sciences EP0101,EP0111,EP0131 Kits contain reaction buffer.
DIG RNA Labeling Mix Roche Applied Science 11 277 073 910
RNAguard Amersham Biosciences 27-0816-01
3M sodium acetate
Cold 100% ethanol.
Cold 70% ethanol.
Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water.
Heptane
Methanol
proteinase K Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada Catalog No. P2308
40% formaldehyde solution, freshly prepared
PBS-Tween solution (PBT) 1xPBS, 0.1% Tween-20
Glycine solution 2 mg/ ml glycine in PBT
HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc 200-032- 156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG Roche Applied Science, Laval, QC 1 207 733 1/500 dilution of stock solution in PBTB
Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 200-062-156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
Streptavidin-HRP conjugate Molecular Probes, Eugene OR, USA S991 (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
  4. Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
  5. Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
  6. Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  7. Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
  8. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  9. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  10. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
  11. Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
  12. Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
  13. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
  14. Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
  15. Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
  16. Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
  17. Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
  18. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
  19. Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
  20. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).

Tags

Биология развития выпуск 71 клеточной биологии молекулярной биологии генетики геномики, Эмбрион флуоресцентный FISH Pattern экспрессии генов РНК локализации РНК Tyramide усиления сигнала TSA нокаут плодовой мухи все горе эмбриогенез животной модели
Всего горы РНК Флуоресцентные<em&gt; На месте</em&gt; Гибридизация<em&gt; Drosophila</em&gt; Эмбрионы
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Legendre, F., Cody, N., Iampietro,… More

Legendre, F., Cody, N., Iampietro, C., Bergalet, J., Lefebvre, F. A., Moquin-Beaudry, G., Zhang, O., Wang, X., Lécuyer, E. Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (71), e50057, doi:10.3791/50057 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter