Summary
यहाँ हम एक पूरी माउंट फ्लोरोसेंट का वर्णन
Abstract
विकास के दौरान अपने जैविक समारोह को समझने के लिए एक जीन है, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपनी लिखित शाही सेना के subcellular स्थानीयकरण गुण, की अभिव्यक्ति पैटर्न का आकलन प्रमुख विशेषताएं हैं. स्वस्थानी संकरण में शाही सेना (आरएनए-ish) एक शक्तिशाली शाही सेना वितरण गुणों visualizing के लिए विधि का इस्तेमाल किया है, यह जीवधारी, सेलुलर या subcellular 1 स्तर पर हो. शाही सेना ISH एक लेबल न्यूक्लिक एसिड (जैसे antisense शाही सेना, oligonucleotides) जांच एक mRNA या एक गैर कोडन 2 ब्याज की शाही सेना लक्ष्य के अनुक्रम के लिए पूरक के संकरण पर आधारित है. प्रक्रिया के रूप में प्राथमिक अनुक्रम जानकारी अकेले अनुक्रम विशेष जांच उत्पन्न करने की आवश्यकता है, यह सार्वभौमिक जीवों और ऊतक नमूनों 3 की एक व्यापक श्रृंखला के लिए लागू किया जा सकता है. दरअसल, बड़े पैमाने पर ISH अध्ययन के एक नंबर के लिए जीन की अभिव्यक्ति दस्तावेज और विभिन्न मॉडल जीवों में स्थानीयकरण गतिशीलता शाही सेना के लिए लागू किया गया है, जो करने के लिए नेतृत्व किया गया हैमहत्वपूर्ण समुदाय 4-11 संसाधनों की स्थापना. जबकि जांच लेबलिंग और पहचान की रणनीतियों की एक किस्म के वर्षों में विकसित किया है, fluorescently लेबल का पता लगाने अभिकर्मकों और enzymatic संकेत प्रवर्धन कदम का संयुक्त उपयोग संवेदनशीलता और 12 प्रक्रिया के संकल्प में महत्वपूर्ण वृद्धि की पेशकश करते हैं. यहाँ, हम स्वस्थानी संकरण (मछली) विधि tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) रोजगार के लिए शाही सेना और मंचन किया भ्रूण ड्रोसोफिला में अभिव्यक्ति स्थानीयकरण गतिशीलता कल्पना में एक अनुकूलित फ्लोरोसेंट का वर्णन करता है. प्रक्रिया बाहर 96-अच्छी तरह से पीसीआर थाली प्रारूप है, जो बहुत से नमूनों की बड़ी संख्या के साथ - साथ प्रसंस्करण की सुविधा में किया जाता है.
Protocol
1. शाही सेना जांच तैयारी
अवलोकन: निम्न अनुभाग Digoxigenin (डीआईजी) लेबल आरएनए मछली के लिए उपयुक्त जांच करने के लिए आवश्यक कदम का वर्णन है. पहला कदम क्लोनिंग या पीसीआर एक ब्याज की एक जीन है कि एक अनुक्रम विशेष जांच उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा की लिखित क्षेत्र के लिए इसी अनुक्रम amplifying शामिल है. यह एक प्लाज्मिड जिसमें कई क्लोनिंग साइट जीवाणुभोजी प्रमोटर (T7, T3 या SP6) तत्व है, जो फिर पीसीआर के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सेवा flanking प्राइमरों कि प्रमोटर दृश्यों को शामिल का उपयोग कर सकते हैं द्वारा flanked है में पहली बार क्लोनिंग जीन खंड के द्वारा प्राप्त किया जा सकता है इस प्रकार प्रत्येक छोर (चित्रा 1 ए) में विभिन्न प्रमोटर दृश्यों के साथ एक रेखीय पीसीआर उत्पाद पैदा होता है. वैकल्पिक रूप से, के लिए क्लोनिंग कदम से बचने के लिए, एक भी जीनोमिक डीएनए या सीडीएनए oligonucleotides कि T7, T3 या उनके 5 'extremities में sp6 दृश्यों (जैसे T7 का उपयोग कर से पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन कर सकते हैं'; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 sp6: '5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3). रैखिक पीसीआर उत्पादों तो टेम्पलेट के रूप में उपयोग किया जाता है उपयुक्त पोलीमरेज़ (चित्रा 1 बी) के साथ इन विट्रो प्रतिलेखन में रन दूर खोदो लेबल भावना या antisense शाही सेना जांच कर. जब विशेष जीन के लिए जांच कर रही है, हम दोनों भावना और antisense शाही सेना जांच की तैयारी करने की सलाह देते हैं अलग पीसीआर, जो मछली संकेत विशिष्टता (यानी जब तक ब्याज की जीन antisense ओरिएंटेशन में लिखित है का आकलन करने के लिए उपयोगी हो जाएगा का उपयोग कर, भावना आरएनए जांच प्रकट होगा पृष्ठभूमि संकेत के स्तर). निम्न चरणों के सभी में, एक महान ख्याल रखना contaminating ribonucleases (RNAses) द्वारा पहले 70% इथेनॉल या वाणिज्यिक RNase परिशोधन समाधान के साथ सभी बेंच क्षेत्रों और उपकरणों की सफाई और RNase मुक्त आपूर्ति का उपयोग करके संभावित गिरावट से बचने के (जैसे पानी चाहिए, टिप्स, microcentrifuge ट्यूब).
माterials
- 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों, (Abgene, रोचेस्टर, NY, संयुक्त राज्य अमेरिका बिल्ली कोई 0900)
- जेल निकासी किट (QIAGEN, मिसिसॉगा, पर, कनाडा,. बिल्ली 28706 सं).
- RNase मुफ्त पानी (विसेंट, इंक बिल्ली ८०९-115-CL नंबर)
- आरएनए पीसीआर (T7, T3, या SP6). (20 यू / μl, Fermentas बायोसाइंसेज बिल्ली. EP0101 नहीं, EP0111, EP0131).
- RNase बाहर Ribonuclease inhibitors (40 यू / μl), (Invitrogen, Burlington. Canada.Cat. 10777-019 नंबर पर).
- (डीआईजी) Digoxigenin nucleotide घोला जा सकता है (डीआईजी-11-UTP, Roche एप्लाइड बायोसाइंसेज, Laval, QC, कनाडा बिल्ली. No.11209256910).
उपकरण
- तालिका के शीर्ष पर सूक्ष्म अपकेंद्रित्र
- जेल वैद्युतकणसंचलन उपकरण
- पीसीआर जीनोमिक डीएनए, सीडीएनए, या एक रेखीय पीसीआर जीवाणुभोजी T7, T3 या sp6 प्रमोटर दृश्यों द्वारा flanked उत्पाद उत्पन्न प्लाज्मिड डीएनए से जीन विशिष्ट अनुक्रम बढ़ाना. पीसीआर स्थितियों के लिए निर्माता की सिफारिशों का पालन करें.
- गुणवत्ता और सी सत्यापित करेंagarose जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा पीसीआर उत्पाद के ZE. उत्पाद शुल्क और शुद्ध पीसीआर उत्पाद सिफारिशों विनिर्माण और बफर के 50 μl में उत्पाद elute के अनुसार एक मानक किट जेल निकासी का उपयोग कर.
- 3M सोडियम (5.2 पीएच) एसीटेट और बर्फ के ठंडे 100% इथेनॉल के 150 μl के 5 μl जोड़कर पीसीआर उत्पाद वेग, और -70 ° रातोंरात सी ट्यूबों जगह. 13,000 XG पर ट्यूब 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए और अपकेंद्रित्र 70% इथेनॉल के साथ गोली धो लो. फिर स्पिन, इथेनॉल और गोली शुष्क हवा के सभी निशान हटाने. RNase मुफ्त पानी की 25-50 μl में Resuspend.
- 10X T7 प्रतिलेखन बफर के 2 μl (Invitrogen), RNase अवरोध करनेवाला, 2 μl खोदो NTP मिश्रण 1 μl (20 यू / μl): खोदो लेबल एक 20 के रूप में μl प्रतिक्रिया में 200-500 एनजी शुद्ध पीसीआर उत्पाद का उपयोग कर जांच नक़ल , और 2 μl T7 आरएनए पोलीमरेज़ (20 यू / μl). RNase मुफ्त पानी के साथ 20 μl अंतिम मात्रा लाओ. 37 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 घंटे के लिए प्रतिलेखन प्रतिक्रिया सेते हैं.
- Transc समायोजितription RNase मुफ्त पानी के साथ 50 μl मिश्रण और खोदो लेबल शाही सेना के रूप में चरण 4 में वर्णित जांच तलछट. RNase मुफ्त पानी के 100 μl में धोया आरएनए गोली Resuspend. -70 डिग्री सेल्सियस पर resuspended नमूने स्टोर
- एक nanodrop स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग कर जांच यों. जांच करने के लिए गुणवत्ता को सत्यापित करने के लिए, एक 1-2% agarose जेल दाग पर ethidium ब्रोमाइड के साथ एक 1-2 μl नमूना चलाते हैं.
2. संग्रह और भ्रूण ड्रोसोफिला के फिक्सेशन
अवलोकन: इस खंड में कटाई और प्रसंस्करण का मंचन किया ड्रोसोफिला भ्रूण के लिए कदम का वर्णन करता है. जरूरत भ्रूण की संख्या पर निर्भर करता है, मक्खियों विभिन्न आकारों की आबादी पिंजरों में रखा जा सकता है. निम्नलिखित कदम उठाए हैं के लिए संग्रह 900 सेमी 3 बेलनाकार 100mm सेब का रस संग्रह प्लेटों का उपयोग पिंजरों का उपयोग कर प्रदर्शन किया. उचित निर्धारण दो सुरक्षात्मक भ्रूण आसपास परतों के हटाने की आवश्यकता है: बाहरी जरायु और भीतरी vitellinई झिल्ली 13. एक बार काटा, भ्रूण पहले एक 50% ब्लीच जरायु हटाने समाधान में स्नान कर रहे हैं, तो वे एक Biphasic हेपटैन (पीतक झिल्ली permeabilizes), और PBS 3.7% formaldehyde युक्त युक्त समाधान में मिश्रित कर रहे हैं. पीतक झिल्ली और फिर टूट जाता है हेपटैन और मेथनॉल की एक Biphasic मिश्रण में भ्रूण स्थानांतरित कर हटा दिया. उचित भ्रूण निर्धारण और पीतक झिल्ली को हटाने के डाउनस्ट्रीम मछली प्रक्रिया की सफलता के लिए महत्वपूर्ण है.
सामग्री
- सेब के रस (40% सेब का रस, 4% sucrose, अगर 3.5%, 0.3% मिथाइल paraben) सिक्के के आकार के खमीर पेस्ट के साथ अगर प्लेट (बेकर की खमीर मक्खन स्थिरता के लिए पानी के साथ मिश्रित)
- पाउडर paraformaldehyde (इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी विज्ञान, Hatfield, पीए, संयुक्त राज्य अमेरिका, बिल्ली सं 19208)
- हेपटैन
- मेथनॉल
- 3% ब्लीच समाधान
- 20 मिलीलीटर कांच जगमगाहट शीशियों (थर्मो फिशर साइंटिफिक, ओटावा, पर, कनाडा, बिल्ली 03-337 सं.) -15.
उपकरण
- जनसंख्या पिंजरों
- संग्रह टोकरियाँ एक Nitex जाल और एक कट 50 मिलीलीटर polypropylene ट्यूब जिसमें एक छेद ढक्कन में कटौती की गई के शीर्ष भाग का उपयोग किया.
- लघु पेंट ब्रश
- तालिका के शीर्ष पर भंवर
- पूर्व स्पष्ट अच्छी तरह से खिलाया 25 में 1 घंटे के लिए ताजा सेब का रस / खमीर प्लेट के साथ जनसंख्या पिंजरों डिग्री सेल्सियस
- पिंजरे में एक नए सेब का रस / खमीर प्लेट जोड़ें फसल के लिए प्रारंभिक चरण भ्रूण. 4 घंटे के लिए 25 बजे पिंजरे सेते ° C (कृपया ध्यान दें कि संग्रह के बार वांछित चरणों के आधार पर समायोजित किया जा सकता है).
- 3.7 छ paraformaldehyde पाउडर, 2N KOH के 70 μl, और एक गिलास जगमगाहट शीशी में एक रासायनिक हुड के तहत पानी milliQ की 7.3 मिलीलीटर के संयोजन के द्वारा तैयार एक ताजा 37% formaldehyde समाधान. समाधान उबालें जब तक paraformaldehyde पाउडर पूरी तरह भंग है, तो तापमान और नई जगमगाहट शीशी में फिल्टर करने के लिए कमरे शांत.
- द्वारा एक Biphasic निर्धारण समाधान तैयारएक जगमगाहट शीशी में 37% formaldehyde के 250 मिलीलीटर के के साथ 1X पीबीएस के 2.25 मिलीलीटर के संयोजन, तो हेपटैन की 7.5 मिलीलीटर जोड़ने.
- पिंजरे से फसल सेब का रस प्लेट और कमरे के तापमान पानी के नल का एक बिट जोड़ने और नाजुक थाली से पेंट ब्रश के साथ भ्रूण brushing द्वारा भ्रूण इकट्ठा. एक टोकरी में resuspended भ्रूण स्थानांतरण और गुनगुने पानी के नल से कुल्ला.
- 90 सेकंड के लिए स्नान ब्लीच समाधान में संग्रह बास्केट Dechorionate भ्रूण, तो गुनगुने नल का पानी (ब्लीच गंध तक चला गया है) के साथ अच्छी तरह कुल्ला.
- संग्रह टोकरी साफ करें, धीरे से एक तूलिका का उपयोग भ्रूण को इकट्ठा करने और उन्हें Biphasic निर्धारण समाधान में स्थानांतरित कर सकते हैं. भ्रूण PBS और हेपटैन परतों के बीच इंटरफेस में जमा करेंगे.
- सील जगमगाहट शीशियों और एक भंवर मिश्रक जकड़ना. कम सेटिंग पर 20 मिनट के लिए हिला.
- निकालें और कम pbs और ऊपरी हेपटैन एक पाश्चर विंदुक का उपयोग चरणों के सबसे त्यागने. महाप्राण (व्यंजन)विंदुक में शेष मिश्रण / पीबीएस हेपटैन भ्रूण /. एक dropwise फैशन में, कम विंदुक से पीबीएस चरण त्यागें, देखभाल करने के लिए भ्रूण को समाप्त नहीं. एक 1.5 मिलीलीटर 500 μl हेपटैन एक Biphasic समाधान (ऊपरी चरण) और 500 μl मेथनॉल (कम चरण) युक्त ट्यूब में भ्रूण जमा.
- ट्यूबों सख्ती 30-45 सेकंड के लिए हाथ से शेक पीतक झिल्ली दरार. एक बार टूट, भ्रूण मेथनॉल में डूब जाएगी.
- ऊपरी हेपटैन और हेपटैन / मेथनॉल अंतरावस्था चरण uncracked भ्रूण त्यागें, और मेथनॉल के 500 μl जोड़ें. 5 सेकंड के लिए हिलाओ.
- मेथनॉल के साथ 3 बार धोएं और -20 डिग्री सेल्सियस (इस बिंदु पर भ्रूण हफ्तों / महीनों के लिए भंडारित किया जा सकता है) में भ्रूण की दुकान.
3. पोस्ट - निर्धारण प्रसंस्करण संकरण, और पोस्ट संकरण Washes
अवलोकन: इस खंड का विवरण भ्रूण permeabilization के लिए प्रसंस्करण कदम मछली के लिए पहले, पूर्व संकरण,शाही सेना और जांच के बाद संकरण washes के साथ संकरण. भ्रूण प्रारंभिक permeabilization चरणों के लिए एक ट्यूब (कदम 1-9 नीचे, बसे भ्रूण / नमूना के 10-15 μl के लिए लक्ष्य) में एक पूल के रूप में नियंत्रित किया जाता है, लेकिन वे 96-अच्छी तरह से पीसीआर थाली के व्यक्तिगत कुओं में aliquoted हैं पूर्व संकरण कदम (10 कदम नीचे) के साथ आगे बढ़ने से पहले. इस प्रयोग के प्रारंभिक चरणों में सभी भ्रूण की भी इलाज सुनिश्चित करने में मदद करता है. जब एक मछली प्रयोग सेट, यह महत्वपूर्ण है नकारात्मक नियंत्रण को शामिल करने के लिए अलग - अलग प्रयोगों में पृष्ठभूमि संकेत के स्तर का निर्धारण. इस के लिए, हम एक 'नहीं' जांच नमूना सहित करने की सलाह देते हैं और, के रूप में 1 अनुभाग, एक 'भावना' आरएनए जांच, जो आम तौर पर एक नहीं 'जांच' की हालत तुलनीय संकेत दे देंगे साथ संकरित नमूना में उल्लेख किया गया है.
सामग्री:
- मेथनॉल
- फास्फेट 0.1% Tween-20 (पीबीटी) के साथ खारा buffered
- Proteinase-K 1 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान (सिग्मा Aldrich, Oakville, पर, कनाडा. कैटलॉग सं P2308)
- Glycine (20 मिलीग्राम / एमएल स्टॉक समाधान)
- संकरण समाधान: 50% Formamide, 5X एसएससी, 0.1% Tween-20, 100 ग्राम sheared सामन शुक्राणु डीएनए / मिलीलीटर, 100 हेपरिन / ग्राम मिलीलीटर.
- 0.2 मिलीलीटर 96 पीसीआर प्लेटें, Abgene, रोचेस्टर, एनवाई, अमरीका बिल्ली halfskirted. 0900 नहीं)
उपकरण
- संकरण ओवन, डिजिटल हीटिंग ब्लॉक या पानी के 56 से समायोज्य स्नान ° 80 सी, डिग्री सेल्सियस या 100 डिग्री सेल्सियस, या एक पीसीआर मशीन.
- Multichannel pipettors (धोने चरणों का को सरल करने की सिफारिश की है)
- मिक्सर Nutating
- मेथनॉल में भ्रूण कुल्ला, तो मेथनॉल के एक 1:1 मिश्रण में: PBT, और फिर पीबीटी में दो बार.
- पीबीटी एक nutator पर लगातार कमाल के साथ 3.7% formaldehyde (हौसले से तैयार के रूप में 11 कदम में वर्णित) से युक्त 1 मिलीलीटर में 20 मिनट के लिए भ्रूण को ठीक करें.
- पीबीटी में 2 मिनट जबकि कमाल के लिए 3 बार के लिए भ्रूण को धो लें.
- 3 ग्राम / proteinase (पी) K पीबीटी में पतला मिलीलीटर के समाधान तैयार है और जोड़नेनमूने के लिए और समाधान के 500 μl. मिलाते हुए बिना कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए नमूने सेते हैं. भ्रूण एक विंदुक के साथ jetting या धीरे inverting ट्यूब द्वारा हर 2 मिनट में मिलाएं.
- बर्फ पर 1 घंटे के लिए भ्रूण नमूने स्थानांतरण.
- कमरे के तापमान के लिए नमूने ले जाएँ और पीके समाधान निकालें. 2 मिनट के लिए 1 मिलीग्राम पीबीटी + 2 मिलीग्राम / एमएल ग्लाइसिन के साथ 2 बार धोएं.
- नमूने कमाल साथ पीबीटी + 3.7% formaldehyde के 1 मिलीलीटर में 20 मिनट फिक्स. भ्रूण पीबीटी में 5 बार कुल्ला.
- पीबीटी और HYB समाधान के एक 1:1 मिश्रण के 1 मिलीलीटर के साथ भ्रूण कुल्ला. 0.5-1 मिलीग्राम 100% HYB समाधान (इस कदम पर भ्रूण -20 डिग्री सेल्सियस पर कई दिनों / हफ्तों के लिए भंडारित किया जा सकता है) के साथ बदलें.
- एक 96-अच्छी तरह से थाली (~ 10-15 μl बसे भ्रूण के लिए / अच्छी तरह से देखभाल करने के लिए व्यापक एपर्चर युक्तियों का उपयोग करने के लिए भ्रूण को नुकसान पहुँचाए से बचने के उद्देश्य) की व्यक्तिगत कुओं में अशेष भाजक भ्रूण.
- 5 मिनट और फिर 5 मिनट के लिए बर्फ पर शांत के लिए 100 / HYB समाधान के μl नमूना उबाल लें. यह समाधान पूर्व संकरण नमूना के लिए प्रयोग किया जाता है (पूर्व HYB).
- 100 / पूर्व HYB समाधान के μl नमूना जोडें और 56 में कम से कम 2 घंटे के लिए सेते हैं डिग्री सेल्सियस
- प्रत्येक नमूने के लिए, HYB समाधान के 100 μl में ~ जांच के 100 एनजी पतला. 80 में हीट ° सी 3 मिनट के लिए, फिर 5 मिनट (गर्म जांच कई घंटे के लिए बर्फ पर रखा जा सकता है) के लिए बर्फ पर शांत.
- भ्रूण से पूर्व HYB समाधान निकालें और शाही सेना जांच समाधान के साथ बदलें.
- 12-16 घंटे के लिए 56 डिग्री सेल्सियस में संकरण.
- पूर्व गर्म 56 पर निम्न धोने समाधान ° C (ए) 200 μl / HYB समाधान का नमूना, (बी) 100 μl / HYB की एक 3:1 मिश्रण का नमूना: PBT, (सी) 100 / μl नमूना 01:01 HYB मिश्रण: पीबीटी, (डी) 100 μl / HYB की एक 01:03 मिश्रण का नमूना: PBT, (ई) 400 / पीबीटी के μl नमूना.
- धोने एक समाधान के 100 μl के साथ नमूने कुल्ला, फिर 15 मिनट के लिए प्रत्येक 56 में 100 / समाधान ई. के μl नमूना के साथ धोने कदम डिग्री सेल्सियस करते हैं. फिर, नमूने के लिए 56 डिग्री सेल्सियस में 5 मिनट के लिए 4 बार / समाधान ई के 100 μl नमूना साथ धो
- शांत करने के लिए कमरे के तापमान के नमूने हैं.
अवलोकन: इस खंड का पता लगाने और शाही सेना जांच संकेत निम्नलिखित संकरण के वितरण कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया और एंटीबॉडी पहचान अभिकर्मकों का वर्णन करता है. इन चरणों का रेखाचित्र के रूप में चित्रा 2 में उल्लिखित हैं. यहाँ हम केवल वर्तमान मानक का पता लगाने अभिकर्मकों कि हम मजबूत संकेत प्रवर्धन के लिए उपयोग, लेकिन वहाँ एक किस्म मौजूद व्यावसायिक रूप से उपलब्ध अभिकर्मकों कि विकल्प के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, खासकर जब डबल मछली प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए विभिन्न RNAs प्रोटीन शाही सेना डबल के लिए एक साथ सह का पता लगाने धुंधला हो जाना. इस प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त परिणामों के उदाहरण mRNA अभिव्यक्ति / स्थानीयकरण चित्रा 3 में पैटर्न मौज़ेक के रूप में प्रदर्शित कर रहे हैं.
सामग्री
- एचआरपी संयुग्मित माउस मोनोक्लोनल विरोधी डीआईजी (जैक्सन ImmunoResearch लेबोरेटरीज इंक बिल्ली 200-032-156 सं.)
- बायोटिन - संयुग्मित माउस मोनोक्लोनल विरोधी डीआईजी (जैक्सन ImmunoResearch लेबोरेटरीज इंक बिल्ली. 200-062-156 सं.)
- Streptavidin एचआरपी संयुग्म (आण्विक जांच, यूजीन या, संयुक्त राज्य अमेरिका, बिल्ली No.S991.)
- Cy3 tyramide conjugates (Perkin Elmer लाइफ साइंसेज, बोस्टन, एमए, संयुक्त राज्य अमेरिका, बिल्ली सं SAT704A.)
- का DABCO समाधान बढ़ते: एक 50 मिलीलीटर ट्यूब में 1.25 DABCO के ग्राम पतला (1,4 diazabicyclo [2.2.2] ओकटाइन, सिग्मा D-2522) 1X पीबीएस के 15 मिलीलीटर में, तो ग्लिसरॉल के 35 मिलीग्राम और मिश्रण जोड़ें जब तक पूरी तरह सजातीय. पीबीएस के साथ premixing, DABCO पाउडर बहुत जल्दी भंग कर रहा है. स्टोर -20 डिग्री सेल्सियस में बढ़ते समाधान
- ग्लास स्लाइड्स coverslips,
उपकरण
- मिक्सर Nutating
- Multichannel pipettor
- प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी
- PBTB समाधान, पीबीटी युक्त + 1% गैर वसा सूखा दूध (आमतौर पर 50-100 मिलीग्राम सभी पता लगाने अभिकर्मक ऊष्मायन और वाशिंग कदम के लिए पर्याप्त है) तैयार करें.
- में में 100 μl PBTB / नमूने में कमरे Temp पर 10 मिनट के लिए नमूने ब्लॉक जबकि nutator पर कमाल. <li> 1.5-2 100 μl / नमूना मोनोक्लोनल बायोटिन कमाल के साथ विरोधी डीआईजी एंटीबॉडी समाधान (शेयर से PBTB में पतला / 1 400) के साथ कमरे के तापमान पर एक घंटा लिए भ्रूण और सेते नमूने से अवरुद्ध समाधान निकालें.
- नमूने 100 μl / कमाल के साथ PBTB नमूना के साथ 5 मिनट के लिए 6 बार प्रत्येक धो लें.
- कमरे के तापमान पर 75 / कमाल साथ मिलीलीटर नमूना streptavidin एचआरपी समाधान (PBTB, 10 ग्राम / एमएल अंतिम एकाग्रता में स्टॉक से पतला / 1 100) के साथ 1.5 घंटा सेते हैं.
- नमूने 6 बार 5 मिनट के लिए प्रत्येक 100 μl / कमाल है (डीएनए counterstaining लिए, 1X PBTB में काम कर रहे एकाग्रता DAPI पतला और 1 धोने चरण में इस समाधान का उपयोग) के साथ PBTB नमूना धो.
- पीबीटी के साथ भ्रूण कुल्ला, तो पीबीएस के साथ 5 मिनट के लिए 2 बार धो लो.
- कमरे के तापमान पर 2 घंटा लिए 50 / Cy3 tyramide समाधान (पतला 1 / Tyramide प्रवर्धन बफर में 50) के μl नमूना साथ nutator पर नमूने सेते हैं. पर इस कदम से, एक प्रकाश परिरक्षित गोदाम में नमूने रखने के लिए सुनिश्चित करें./ Li>
- नमूने प्रत्येक पर nutator 100 μl पीबीएस / नमूना के साथ 5 मिनट के लिए 6 बार धोएं.
- पीबीएस निकालें और 100-125 / बढ़ते 70% ग्लिसरॉल और 2.5% (DABCO) युक्त समाधान के μl नमूना जोड़ने. स्टोर 4 डिग्री सेल्सियस नमूने इन नमूनों को कई वर्षों के लिए भंडारित किया जा सकता है.
- चौड़े बोर टिप का उपयोग करना, धीरे नमूनों की pipetting द्वारा भ्रूण resuspend और एक गिलास स्लाइड पर भ्रूण की 25 μl हस्तांतरण, तो भ्रूण और नख पॉलिश के साथ स्लाइड पर सील पर एक coverslip जगह.
- भ्रूण एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग कर नमूने का विश्लेषण.
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Representative Results
जब सफलतापूर्वक प्रदर्शन किया, इस प्रक्रिया को जल्दी ड्रोसोफिला embryogenesis दौरान जीन अभिव्यक्ति और mRNA स्थानीयकरण गतिशीलता के spatio-अस्थायी विश्लेषण में एक विस्तार के strikingly बढ़ाया स्तर प्रदान करता है. वास्तव में, के रूप में शास्त्रीय जोड़ी नियम जीन छोटा सा व्यक्ति (रन) के लिए चित्रा 3A में सचित्र, एक इस प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए नाभिक को व्यक्त करने के समूहों में नवजात प्रतिलिपि foci का पता लगाने के माध्यम से जीन की अभिव्यक्ति की घटनाओं का पालन कर सकते हैं. इसके अलावा, के रूप में चित्रा 3B में भ्रूण मौज़ेक के रूप में दिखाया गया है, विधि mRNA उच्च संकल्प में स्थानीयकरण सुविधाओं के दृश्य के लिए सक्षम बनाता है.
चित्रा 1. आरएनए जांच तैयार करने की प्रक्रिया की रूपरेखा (ए) विट्रो प्रतिलेखन usin में खोदो - लेबल शाही सेना जांच synthesizing के लिए हमारी रणनीति का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व.ga रैखिक डीएनए टेम्पलेट जीवाणुभोजी आरएनए पोलीमरेज़ प्रमोटर तत्वों के साथ flanked. (बी) इन विट्रो histone H2A, रन और डॉक्टर transposon RNAs के लिए लिखित शाही सेना जांच में मानक 1% agarose जेल के उदाहरण दिखा का चित्र. हम आम तौर पर दोनों पीसीआर टेम्पलेट और आरएनए जांच के एक पक्ष द्वारा साइड वैद्युतकणसंचलन प्रदर्शन. शाही सेना आम तौर पर खाके की तुलना में उच्च गतिशीलता के साथ एक तीव्र असतत बैंड के रूप में प्रकट होता है
चित्रा 2. मछली विधि में जांच का पता लगाने के कदम की योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व संसाधित भ्रूण को जांच संकरण के बाद, खोदो - लेबल जांच एक biotinylated एंटीबॉडी α खुदाई, जो फिर एचआरपी संयुग्मित streptavidin complexed है का उपयोग कर मान्यता प्राप्त कर रहे हैं. Tyramide संकेत प्रवर्धन (TSA) तो मुक्त कट्टरपंथी फार्म टी में tyramide अभिकर्मक के परिवर्तन में उत्पन्न किया जाता हैएचआरपी की गतिविधि hrough. Transiently प्रतिक्रियाशील tyramide मुक्त कण covalently पास प्रोटीन के खुशबूदार अवशेषों को बाध्य है, जांच के स्थान से दूर उनके प्रसार रोकने. tyramide सब्सट्रेट फ्लोरोसेंट रंजक, जो प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के द्वारा पाया जा सकता है complexed है.
चित्रा 3. इस मछली mRNA और भ्रूण ड्रोसोफिला में अभिव्यक्ति subcellular स्थानीयकरण पैटर्न की विविधता पर प्रकाश डाला प्रक्रिया का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के उदाहरण (ए) जोड़ी नियम embryogenesis के अलग - अलग चरणों में चलाए जीन की मछली कैसे प्रारंभिक विश्लेषण के मध्य भाग में व्यापक अभिव्यक्ति से पता चलता है 4 भ्रूणीय अवस्था में भ्रूण के बाद के चरणों में एक खंडों पट्टी पैटर्न में परिष्कृत किया जाता है (बी) मछली परिणामों के मोज़ेक चित्रण mRNA localizatio की विभिन्न किस्मों दिखा.n चरण 4-7 भ्रूण में पैटर्न. मछली खोदो लेबल antisense जांच कि संकरित और अनुक्रमिक incubations द्वारा biotinylated एंटीबॉडी विरोधी खोदो, streptavidin-एचआरपी, और tyramide Cy3 के साथ पाया गया का उपयोग किया गया था. आरएनए = नीले, डीएनए = लाल. में स्केल पट्टी (ए) = 25 सुक्ष्ममापी, जबकि (बी) = 50 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
जांच संश्लेषण कदम के लिए, हम आम तौर पर पूरी लंबाई ड्रोसोफिला ड्रोसोफिला जीन संग्रह (क्लब), निम्नलिखित वेबसाइट पर विस्तृत संसाधन में पाया प्लाज़मिड से amplified cDNAs से विट्रो प्रतिलेखन में रन दूर antisense शाही सेना जांच उत्पन्न: http://www .fruitfly.org / / क्लब index.html 14,15. इस दृष्टिकोण जीन अभिव्यक्ति और मक्खी 9,16 भ्रूण में mRNA स्थानीयकरण पैटर्न मानचित्रण के उद्देश्य से बड़े पैमाने पर ISH अध्ययन में किया गया है बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जाता है. क्लब plasmids ड्रोसोफिला जीनोमिक संसाधन केंद्र (से आदेश दिया जा सकता https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ). सामग्री शुरू करने और T7, SP6, या T3 overhangs के साथ कस्टम प्राइमरों डिजाइन में लचीलापन एक जांच आसानी से उत्पन्न करने के लिए विशिष्ट mRNA (उदा वैकल्पिक रूप से spliced वेरिएंट) isoforms ओ का पता लगाने के लिए अनुमति देता हैr RNAs कि मानक सीडीएनए संग्रह में प्रतिनिधित्व नहीं कर रहे गैर कोडन. जब डिजाइनिंग isoform विशिष्ट जांच पर विचार, हमने पाया है कि 250-1,000 ठिकानों से लेकर टेम्पलेट्स उत्कृष्ट मछली परिणाम निकल सकते हैं.
मक्खी भ्रूण में मछली के लिए, हम कार्बोनेट उपचार द्वारा हमारे जांच टुकड़ा नहीं करते हैं, बल्कि हम पूर्ण लंबाई रन दूर टेप, जो आकार में 500-5,000 अड्डों के बीच लेकर कर सकते हैं का उपयोग करें. जब अन्य ऊतकों कि कम बड़ी जांच करने के लिए पारगम्य हैं पर मछली का प्रदर्शन, विखंडन वास्तव में जांच के प्रवेश के पक्ष में हो सकता है. हालांकि, हम छोटे पीसीआर प्रवर्धित डीएनए टेम्पलेट्स का उपयोग कर जांच की तैयारी, या एक साथ कई व्यक्तिगत रूप से संश्लेषित छोटे जांच pooling, बजाय बड़ी जांच है जो चर परिणाम दे और समग्र जांच की गुणवत्ता को कम कर सकते हैं रासायनिक विखंडन प्रदर्शन का विकल्प पसंद करते हैं.
भ्रूण संग्रह कदम के रूप में वर्णित है, हम आम तौर पर भ्रूण संग्रह प्लेटों खमीर पेस्ट जोड़ने. खमीर पेस्ट बहुत होगामक्खियों द्वारा रखी अंडे की संख्या में वृद्धि हुई है, के रूप में अंडा उत्पादन पोषण पर्यावरण 17 पर निर्भर करता है. इसके अलावा, ड्रोसोफिला मक्खियों अक्सर सीधे खमीर पेस्ट में अपने अंडे देना होगा. ये भ्रूण आसानी से पेस्ट एक छोटे पेंट ब्रश का उपयोग कर पानी में खमीर भंग मिश्रण और एक संग्रह टोकरी के माध्यम से गुजर द्वारा एकत्र किया जा सकता है. कदम dechorionation, एक 3% ब्लीच समाधान, पानी के साथ वाणिज्यिक (आमतौर पर 6% एकाग्रता) ब्लीच 01:01 गिराए द्वारा तैयार की है, के लिए सबसे 13,18,19 प्रोटोकॉल में प्रयोग किया जाता है. हमारे अनुभव में, हमने पाया है कि 90 सेकंड के लिए एक 3% ब्लीच समाधान के साथ भ्रूण incubating कुशल dechorionation प्रदान करता है. इन मानकों में वाणिज्यिक ब्लीच समाधान है कि उपलब्ध है के आधार पर समायोजित करने की आवश्यकता है, लेकिन एक देखभाल करने के लिए ब्लीच भ्रूण overexpose नहीं के बाद इस नमूने को नुकसान पहुंचा सकता है चाहिए. के लिए dechorionation प्रक्रिया को और अधिक बारीकी से निगरानी करने के लिए, यह संभव है कि एक खुर्दबीन टी के तहत भ्रूण पर देखने केओ सुनिश्चित dechorionation प्रतिक्रिया पूरा हो गया है, यानी भ्रूण उनके पृष्ठीय appendages खो जब वे dechorionated हैं. अंत में, यह सुनिश्चित हो सके कि भ्रूण निर्धारण करने के लिए उचित है, हम हौसले से तैयार formaldehyde समाधान का उपयोग करते हैं, के रूप में पुराने वेग समाधान करते हैं. आगे के संदर्भ के लिए, इस प्रक्रिया पिछले विधियों 13,18,19 लेख में वर्णित किया गया है.
Proteinase कश्मीर, या ऐसे एंटीबॉडी और Cy3 Tyramide, हमने पाया है इष्टतम dilutions इस प्रोटोकॉल में वर्णित का उपयोग कर परिणाम के रूप में पता लगाने अभिकर्मकों के साथ भ्रूण ऊतकों की permeabilization से संबंधित कदम. हालांकि, प्रयोगशाला वातावरण और अभिकर्मक शेयरों में बदलाव के कारण, हम अनुशंसा करते हैं कि प्रत्येक प्रयोगशाला empirically अपने स्वयं के अभिकर्मकों का परीक्षण करने के लिए अपने विशिष्ट जरूरतों के लिए सबसे अच्छा काम कर रहे सांद्रता निर्धारित. इसके अलावा, हमने पाया है इष्टतम अभिकर्मक सांद्रता विश्लेषण ऊतकों पर निर्भर करते हुए भिन्न हो सकते हैं.
मैं मछली प्रक्रिया सुनिश्चित करने के लिए किएस लगातार प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिणाम दे रही है, हम हमेशा की परख करने के लिए कई सकारात्मक नियंत्रण जोड़ने की सलाह देते हैं, जो अच्छी तरह से परिभाषित अभिव्यक्ति / स्थानीयकरण पैटर्न (जैसे रन) के साथ टेप के लिए जांच को शामिल हो सकते हैं. जल्दी ड्रोसोफिला embryogenesis दौरान हड़ताली mRNA स्थानीयकरण पैटर्न के साथ देखिए फ्लाई मछली वेब साइट (पर पाया जा सकता http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ). विपरीत, पृष्ठभूमि संकेत पहचान, जैसा कि ऊपर उल्लेख किया है के लिए नियंत्रण, एक भी नहीं 'जांच' और / या भावना आरएनए जांच नमूनों को शामिल करना चाहिए.
Cy3 tyramide इस प्रोटोकॉल में वर्णित संयुग्म के अलावा, वहाँ अन्य वाणिज्यिक उपलब्ध Perkin Elmer लाइफ साइंसेज या आणविक जांच (Invitrogen, कनाडा, इंक) से fluorochrome संयुग्मित tyramide अभिकर्मकों, जो बहुरंगा इमेजिंग प्रयोगों के लिए अतिरिक्त लचीलापन प्रदान कर सकते हैं की एक किस्म है . हालांकि इस पद्धति हमारे बुनियादी proced का वर्णनएकल आरएनए मछली, इस विधि के बदलाव के लिए ure डबल आरएनए मछली या शाही सेना, प्रोटीन सह का पता लगाने के रूप में और अधिक जटिल प्रयोगों के लिए लागू किया जा सकता है. इन प्रक्रियाओं से संबंधित जानकारी के लिए, हम मौजूदा मछली 18-20 कागजात तरीकों में वर्णित प्रक्रियाओं का पालन करने की सलाह देते हैं.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
काम Lécuyer प्रयोगशाला में आयोजित राष्ट्रीय विज्ञान और कनाडा के इंजीनियरिंग परिषद (NSERC), स्वास्थ्य (CIHR) अनुसंधान और Fonds डे Recherche एन Sante du क्यूबेक (FRSQ) की कनाडा के संस्थानों से धन के द्वारा समर्थित है. Fabio एलेक्सिस Lefebvre और Moquin Beaudry Gaël NSERC स्नातक अनुसंधान studentships द्वारा समर्थित हैं, जबकि कैरोल Iampietro एंजेलो Pizzagalli postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| T7, T3 or SP6 RNA Polymerase | Fermentas Life Sciences | EP0101,EP0111,EP0131 | Kits contain reaction buffer. |
| DIG RNA Labeling Mix | Roche Applied Science | 11 277 073 910 | |
| RNAguard | Amersham Biosciences | 27-0816-01 | |
| 3M sodium acetate | |||
| Cold 100% ethanol. | |||
| Cold 70% ethanol. | |||
| Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water. | |||
| Heptane | |||
| Methanol | |||
| proteinase K | Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada | Catalog No. P2308 | |
| 40% formaldehyde solution, freshly prepared | |||
| PBS-Tween solution (PBT) | 1xPBS, 0.1% Tween-20 | ||
| Glycine solution | 2 mg/ ml glycine in PBT | ||
| HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc | 200-032- 156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG | Roche Applied Science, Laval, QC | 1 207 733 | 1/500 dilution of stock solution in PBTB |
| Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG | Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 200-062-156 | (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB |
| Streptavidin-HRP conjugate | Molecular Probes, Eugene OR, USA | S991 | (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock |
References
- Wilcox, J. N.
- Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
- Lecuyer, E., Tomancak, P.
- Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
- Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
- Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
- Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
- Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
- Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
- Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
- Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
- Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
- Rothwell, W. F., Sullivan, W.
- Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
- Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
- Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
- Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
- Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
- Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
- Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).
