Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

كله جبل RNA نيون Published: January 30, 2013 doi: 10.3791/50057
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 2Department of Biochemistry, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

نحن هنا وصف كامل الفلورسنت جبل

Abstract

تقييم نمط التعبير عن الجينات، وكذلك توطين التحت خلوية خصائص الحمض النووي الريبي في نسخها، هي الملامح الرئيسية لفهم وظيفتها البيولوجية خلال التنمية. RNA في الموقع التهجين (RNA-ISH) هو وسيلة قوية تستخدم لتصور خصائص توزيع RNA، سواء كان ذلك على المستوى العضوي أو الخلوي التحت خلوية 1. ويستند RNA-ISH على تهجين الحمض النووي تحقيقا المسمى (مثل العقاقير RNA، أليغنوكليوتيد]) مكملة لسلسلة من مرنا أو RNA هدفا غير الترميز من الفائدة 2. كما يتطلب الإجراء الأساسي وحده تسلسل المعلومات لتوليد تسلسل محدد تحقيقات، فإنه يمكن تطبيقها عالميا لطائفة واسعة من الكائنات الحية وعينات الأنسجة 3. وبالفعل، تم تنفيذ عدد من الدراسات على نطاق واسع لتوثيق ISH التعبير الجيني والحمض النووي الريبي ديناميات توطين الكائنات الحية في نموذج مختلف، مما أدى إلىإنشاء موارد المجتمع المهم 4-11. في حين وضعت مجموعة متنوعة من العلامات التحقيق والكشف عن استراتيجيات على مر السنين، جنبا إلى جنب من استخدام الكواشف كشف fluorescently-صفت والأنزيمية خطوات التضخيم إشارة تقديم تحسينات كبيرة في الحساسية وقرار إجراء 12. هنا، ونحن تصف طريقة الفلورسنت الأمثل في الموقع التهجين (FISH) توظيف tyramide التضخيم إشارة (TSA) لتصور RNA التعبير وديناميات التوطين في الأجنة ذبابة الفاكهة على مراحل. يتم تنفيذ الإجراء في 96-PCR كذلك شكل لوحة، مما يسهل كثيرا من المعالجة المتزامنة لعدد كبير من العينات.

Protocol

1. دقق إعداد RNA

لمحة عامة: يصف القسم التالي الخطوات اللازمة لجعل Digoxigenin (حفر)-RNA المسمى تحقيقات مناسبة للأسماك. الخطوة الأولى تنطوي على استنساخ أو تضخيم PCR تسلسل المقابلة لمنطقة المحولة من الجين من الفائدة التي سيتم استخدامها لإنشاء تسلسل التحقيق الخاصة. ويمكن تحقيق هذا عن طريق الاستنساخ الجيني لأول مرة في الجزء البلازميد الذي يحيط الموقع الاستنساخ متعددة من قبل عناصر المروج عاثية (T7، T3 أو SP6)، التي يمكن أن تخدم ثم كنموذج لPCR باستخدام بادئات المرافقة التي تتضمن تسلسل المروج ، مما يولد منتج PCR مع تسلسل خطي المروج مختلفة في كل طرف (الشكل 1A). بدلا من ذلك، لتجنب خطوة الاستنساخ، يمكن للمرء أيضا تنفيذ التضخيم PCR من [كدنا] أو الحمض النووي الجيني باستخدام أليغنوكليوتيد] التي تشمل T7، T3 أو SP6 تسلسل في الأطراف 5 'الخاصة بهم (على سبيل المثال T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '؛ T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'؛ SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3). ثم يتم استخدام المنتجات PCR الخطية كقوالب لفهم DIG-المسمى أو تحقيقات مضاد RNA من جولة الاعادة في النسخ المختبر مع البلمرة المناسبة (1B الشكل). عند إجراء تحقيقات لجينات معينة، نوصي إعداد كل من الحس ومضاد تحقيقات RNA باستخدام بلمرة متميزة، والتي سوف تكون مفيدة لتقييم FISH خصوصية إشارة (أي ما لم يتم نسخها الجين من الاهتمام في التوجه العقاقير، فإن الشعور RNA التحقيق كشف عن مستوى إشارة الخلفية). في كل من الخطوات التالية، ينبغي للمرء أن يأخذ عناية كبيرة لتفادي التدهور المحتملة من جانب تلويث ribonucleases (RNAses) عن طريق تنظيف أولا جميع المناطق مقاعد البدلاء والمعدات مع الايثانول 70٪ أو تجارية حلول وإزالة التلوث ريبونوكلياز باستخدام ريبونوكلياز خالية الإمدادات (مثل المياه، نصائح، أنابيب microcentrifuge).

أماهterials

  • 1.5 مل أنابيب microcentrifuge، (Abgene، روتشستر، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية القط. لا 0900)
  • هلام استخراج مجموعات (QIAGEN، ميسيسوجا، ON، كندا؛ كات رقم 28706).
  • ريبونوكلياز مجانا الماء (Wisent، وشركة كات رقم 809-115-CL)
  • بلمرة RNA (T7، T3، أو SP6). (20 U / ميكرولتر، Fermentas العلوم البيولوجية. القط. رقم EP0101، EP0111، EP0131).
  • مثبطات ريبونوكلياز ريبونوكلياز-OUT (40 U / ميكرولتر)، (إينفيتروجن، برلنغتون ON. رقم. Canada.Cat 10777-019).
  • Digoxigenin (DIG) يمزج النوكليوتيدات (DIG-11-UTP، روش التطبيقية العلوم البيولوجية، لافال، QC، كندا. القط. No.11209256910).

معدات

  • قمة الجدول الصغير الطرد المركزي
  • هلام الكهربائي جهاز
  1. PCR تضخيم الجين تسلسل محدد من الحمض النووي الجيني، [كدنا]، أو DNA البلازميد لتوليد منتج PCR الخطية يحيط بها T7 عاثية، أو متواليات المروج T3 SP6. اتبع توصيات الشركة المصنعة للظروف PCR.
  2. التحقق من جودة والاشتراكيةزي للمنتج PCR بواسطة الكهربائي للهلام الاغاروز. المكوس والمنتجات PCR تنقية باستخدام معيار هلام استخراج طقم وفقا لتوصيات والمصنوعات أزل المنتج في 50 ميكرولتر من العازلة.
  3. يعجل المنتج PCR عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من خلات الصوديوم 3M (الرقم الهيدروجيني 5.2) و 150 ميكرولتر من الايثانول الجليد الباردة بنسبة 100٪، ووضع أنابيب في -70 درجة مئوية خلال الليل. أجهزة الطرد المركزي أنابيب في 13000 XG لمدة 10 دقيقة في C ° 4 و غسل بيليه مع الايثانول 70٪. تدور مرة أخرى، وإزالة كل آثار من الإيثانول وتجفيف الهواء بيليه. resuspend في 25-50 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية المياه.
  4. نسخ DIG-صفت التحقيق باستخدام PCR 200-500 نانوغرام المنتج المنقى في رد فعل 20 ميكرولتر على النحو التالي: 2 ميكرولتر من 10X العازلة النسخ T7 (إينفيتروجن)، 1 ميكرولتر (20 U / ميكرولتر) من المانع ريبونوكلياز، 2 ميكرولتر مزيج DIG-NTP ، و 2 ميكرولتر بوليميراز RNA T7 (20 U / ميكرولتر). جلب الحجم النهائي إلى 20 ميكرولتر مع ريبونوكلياز خالية المياه. احتضان رد فعل النسخ في C ° 37 ساعة ل3-4.
  5. ضبط transcمزيج ription إلى 50 ميكرولتر مع ريبونوكلياز خالية المياه ويعجل DIG-RNA المسمى التحقيق كما هو موضح في الخطوة 4. إعادة تعليق على غسلها RNA بيليه في 100 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية المياه. تخزين عينات معلق في C. ° -70
  6. قياس الطيف باستخدام مسبار nanodrop. للتحقق من نوعية التحقيق، تشغيل عينة 1-2 ميكرولتر الملون على 1-2٪ هلام الاغاروز مع بروميد إيثيديوم.

2. جمع وتثبيت الجنين ذبابة الفاكهة

لمحة عامة: يصف هذا القسم الخطوات لحصاد وتجهيز نظم ذبابة الفاكهة الجنين. اعتمادا على عدد من الأجنة اللازمة، يمكن الحفاظ على الذباب في أقفاص السكان من مختلف الأحجام. الخطوات التالية هي لمجموعات تنفيذها باستخدام 900 سم 3 أقفاص اسطوانية باستخدام 100mm جمع عصير التفاح لوحات. تثبيت السليم يتطلب إزالة اثنين من طبقات واقية تحيط الجنين: والمشيماء الخارجي والداخلي فيتيلينه غشاء 13. حصاد مرة واحدة، واستحم أولا الأجنة في محلول التبييض 50٪ لإزالة المشيماء، ثم تكون مختلطة في حل ثنائي الطور تحتوي على هيبتان (الغشاء المحي permeabilizes)، والتي تحتوي على الفورمالديهايد PBS 3.7٪. مشققة ثم الغشاء المحي وإزالتها عن طريق نقل الأجنة إلى خليط ثنائي الطور من هيبتان والميثانول. تثبيت الجنين السليم وإزالة الغشاء المحي هو أمر حاسم لنجاح الإجراء FISH المصب.

المواد

  • عصير التفاح لوحات أجار (40٪ عصير التفاح، والسكروز 4٪، 3.5٪ أجار، 0.3٪ الميثيل بارابين) مع معجون الخميرة سنتات الحجم (خميرة الخباز مختلطة مع الماء لاتساق الزبدة)
  • مسحوق بارافورمالدهيد (علوم المجهر الإلكتروني، هاتفيلد، PA، الولايات المتحدة الأمريكية؛ كات رقم 19208)
  • هيبتان
  • الميثانول
  • 3٪ التبييض حل
  • 20 مل قارورة زجاج التلألؤ (الحرارية فيشر العلمية، أوتاوا، ON، كندا؛ كات رقم 03-337-15).

معدات

  • أقفاص السكان
  • سلال جمع (مصنوعة باستخدام شبكة Nitex والجزء العلوي من قطع أنبوب البولي بروبلين 50 مل التي تم قطع ثقب في الغطاء).
  • فرشاة الطلاء الصغيرة
  • دوامة الجدول الأعلى
  1. قبل اضحة جيدا فدان السكان أقفاص مع لوحة عصير / الخميرة التفاح لمدة 1 ساعة عند 25 ° C.
  2. إضافة جديدة عصير التفاح / الخميرة لوحة إلى قفص لحصاد الأجنة مرحلة مبكرة. احتضان لمدة 4 القفص ساعة عند 25 ° C (لاحظ أن يمكن تعديلها مرات جمع تبعا لمراحل المطلوب).
  3. إعداد جديدة محلول الفورمالديهايد 37٪ من خلال الجمع بين 3،7 مسحوق بارافورمالدهيد ز، 70 ميكرولتر من KOH 2N، و 7.3 مل من الماء في كوب milliQ قارورة التلألؤ تحت غطاء الكيميائية. تغلي الحل حتى يذوب تماما مسحوق بارافورمالدهيد، ثم باردة لدرجة حرارة الغرفة وتصفية في قارورة التلألؤ جديدة.
  4. إعداد الحل تثبيت ثنائي الطور من قبلالجمع بين 2،25 مل من 1X PBS مع 250 مل من 37٪ الفورمالديهايد في قارورة التلألؤ، ثم إضافة 7.5 مل من هيبتان.
  5. حصاد لوحة عصير التفاح من القفص وجمع الأجنة عن طريق إضافة القليل من ماء الصنبور درجة حرارة الغرفة وتنظيف بدقة الأجنة قبالة لوحة مع فرشاة الطلاء. نقل الأجنة معلق في سلة وشطف مع ماء الصنبور الفاتر.
  6. الأجنة لمدة 90 ثانية Dechorionate من الاستحمام سلال جمع في حل التبييض، ثم يشطف جيدا بالماء الفاتر الصنبور (حتى ذهب رائحة التبييض).
  7. تفكيك سلة جمع، وجمع الأجنة باستخدام الفرشاة بلطف ونقلها إلى حل تثبيت ثنائي الطور. سوف تتراكم في الأجنة واجهة بين PBS وطبقات هيبتان.
  8. ختم القنينات التلألؤ وربط إلى دوامة خلاط. يهز لمدة 20 دقيقة على الأقل الإعداد.
  9. إزالة وتجاهل معظم مراحل أقل PBS العليا وهيبتان باستخدام ماصة باستور. نضحما تبقى من PBS / هيبتان / الأجنة الخليط في ماصة. بطريقة البطيئه، تجاهل المرحلة PBS أقل من ماصة، مع الحرص على عدم القضاء على الأجنة. إيداع الأجنة في أنبوب 1.5 مل تحتوي على حل ثنائي الطور من 500 ميكرولتر هيبتان (المرحلة العليا) و 500 ميكرولتر الميثانول (أقل المرحلة).
  10. يهز أنابيب بقوة باليد لمدة 30-45 ثانية للقضاء على الأغشية المحية. متصدع مرة واحدة، فإن أجنة تغوص في الميثانول.
  11. تجاهل المرحلة العليا هيبتان والأجنة في الطور البيني uncracked هيبتان / الميثانول، وإضافة 500 ميكرولتر من الميثانول. يهز لمدة 5 ثوانى.
  12. يغسل 3 مرات مع الميثانول وتخزين الأجنة في -20 ° C (في هذه المرحلة ويمكن تخزين الأجنة لأسابيع / أشهر).

3. بعد التثبيت، تصنيع التهجين والتهجين، يغسل مشاركة

نظرة عامة: هذا القسم تفاصيل وخطوات المعالجة للpermeabilization الجنين قبل FISH، قبل التهجين،التهجين مع تحقيقات RNA ويغسل بعد التهجين. للخطوات الأولية permeabilization يتم التعامل مع الأجنة وبركة في أنبوب واحد (الخطوات 1-9 أدناه، تهدف لمدة 10-15 ميكرولتر من الأجنة استقر / عينة)، ولكن aliquoted أنها في الآبار الفردية لوحة PCR 96-جيدا قبل الشروع في الخطوة ما قبل التهجين (الخطوة 10 أدناه). هذا يساعد على ضمان معاملة جميع الأجنة حتى في المراحل الأولى من التجربة. عند إعداد تجربة FISH، من المهم أن تشمل الضوابط السلبية لتحديد مستوى إشارة الخلفية في التجارب الفردية. لهذا، فإننا نوصي بما في ذلك عينة "لا مسبار"، وكما لوحظ في الباب 1، عينة تهجين مع التحقيق "بمعنى" RNA، والتي سوف تعطي عادة إشارة مماثلة لحالة ال "لا التحقيق.

المواد:

  • الميثانول
  • الفوسفات مخزنة المالحة بنسبة 0.1٪ توين-20 (PBT)
  • بروتين-K 1 ملغ / مل محلول المخزون (سيغما الدريتش، أوكفيل، ON، كندا. كتالوج رقم P2308)
  • جليكاين (20 ملغ / مل محلول المخزون)
  • حل التهجين: الفورماميد 50٪، SSC 5X، 0.1٪ توين-20، 100 غ / مل من السائل المنوي DNA المنفصمة السلمون، 100 ميكروغرام / مل الهيبارين.
  • halfskirted 0.2 مل 96-PCR وحات جيدة، Abgene، روتشستر، نيويورك، الولايات المتحدة الأمريكية القط. لا 0900)

معدات

  • الفرن التهجين، كتلة التدفئة الرقمية أو ماء الاستحمام للتعديل إلى 56 ° C، 80 ° C أو 100 ° C، أو جهاز PCR.
  • pipettors متعددة القنوات (مستحسن لتبسيط خطوات الغسيل)
  • Nutating خلاط
  1. شطف الأجنة في الميثانول، ثم في خليط 1:1 من الميثانول: PBT، ثم مرتين في PBT.
  2. إصلاح الأجنة لمدة 20 دقيقة في 1 مل من PBT يحتوي على الفورمالديهايد 3.7٪ (الطازجة كما هو موضح في الخطوة 11) مع هزاز ثابت على nutator.
  3. غسل الأجنة لمدة 3 مرات لمدة 2 دقيقة في حين PBT هزاز.
  4. إعداد الحل من 3 ميكروغرام / مل من K بروتين (PK) المخفف في PBT وإضافة500 ميكرولتر من حل لعينات. احتضان العينات لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون أن تهتز. خلط الأجنة كل دقيقة 2 من النفث مع ماصة أو عن طريق أنابيب لقلب بلطف.
  5. نقل الأجنة عينات على الجليد لمدة 1 ساعة.
  6. نقل العينات إلى درجة حرارة الغرفة وإزالة الحل PK. غسل 2 مرات عن 2 دقيقة مع 1 مل من 2 ملغم + PBT / جليكاين مل.
  7. إصلاح عينات 20 دقيقة في 1 مل من الفورمالدهيد + 3.7٪ PBT مع هزاز. شطف الأجنة 5 مرات في PBT.
  8. شطف الأجنة مع 1 مل من مزيج 1:1 من PBT وحل HYB. استبدال مع 0،5-1 مل من محلول HYB 100٪ (في هذه الخطوة يمكن تخزين الأجنة لعدة أيام / أسابيع في -20 درجة مئوية).
  9. قسامة الأجنة في الآبار الفردية من لوحة 96-جيدا (10-15 ميكرولتر الهدف ل~ الأجنة استقر / حسنا، أن تحرص على استخدام فتحة واسعة نصائح لتجنب إتلاف الأجنة).
  10. يغلي 100 ميكرولتر / عينة من حل HYB لمدة 5 دقائق ثم تبرد وعلى الجليد لمدة 5 دقائق. يتم استخدام هذا الحل لنموذج ما قبل التهجين (قبل HYB) .
  11. إضافة 100 ميكرولتر / عينة من قبل HYB الحل واحتضان لمدة لا تقل عن 2 ساعة في 56 ° C.
  12. لكل عينة، تمييع ~ 100 نانوغرام من التحقيق في 100 ميكرولتر من حل HYB. الحرارة عند 80 درجة مئوية لمدة 3 دقائق، ثم تبرد على الجليد لمدة 5 دقائق (يمكن أن تظل ساخنة تحقيقات على الجليد لعدة ساعات).
  13. إزالة الحل قبل HYB من الأجنة واستبدال الحل مع التحقيق RNA.
  14. هجن في C ° 56 ساعة ل12-16.
  15. قبل غسل الحارة الحلول التالية في 56 ° C: (A) 200 ميكرولتر / عينة من حل HYB، (B) 100 ميكرولتر / عينة من مزيج من 03:01 HYB: PBT، (C) 100 ميكرولتر / عينة من 01:01 مزيج من HYB: PBT، (D) 100 ميكرولتر / عينة من مزيج من 01:03 HYB: PBT، (E) 400 ميكرولتر / عينة من PBT.
  16. شطف عينات مع 100 ميكرولتر من محلول غسل A، ثم نفذ الخطوة مع 100 ميكرولتر غسل / عينة من الحلول AD في 56 ° C لمدة 15 دقيقة لكل منهما. ثم، وغسل عينات 4 مرات لمدة 5 دقائق مع 100 ميكرولتر / E عينة من الحل في C. ° 56
  17. بارد العينات إلى درجة حرارة الغرفة.

معشوقة = "jove_title"> 4. كشف التحقيق

لمحة عامة: هذا القسم يصف الأجسام المضادة والكواشف المستخدمة للكشف عن الكشف عن تصور وتوزيع إشارة RNA التهجين التحقيق التالي. وترد هذه الخطوات تخطيطي في الشكل 2. نحن هنا فقط تقديم كشف الكواشف القياسية التي نستخدمها لتضخيم إشارة قوية، ولكن هناك مجموعة متنوعة الكواشف المتاحة تجاريا التي يمكن استخدامها كبدائل، وخصوصا عندما نقرا مزدوجا FISH أداء التجارب للمشاركة في الكشف عن الرناوات مختلفة في نفس الوقت لضعف البروتين RNA تلطيخ. يتم عرض أمثلة من النتائج التي تم التوصل لهذا البروتوكول في نمط الفسيفساء مرنا التعبير / التعريب في الشكل 3.

المواد

  • HRP، مترافق الماوس وحيدة النسيلة المضادة للDIG (جاكسون ImmunoResearch كات شركة المختبرات. رقم 200-032-156)
  • البيوتين، مترافق الماوس وحيدة النسيلة المضادة للDIG (جاكسون إمانoResearch كات شركة المختبرات. رقم 200-062-156)
  • Streptavidin-HRP المتقارن (مجسات الجزيئية، يوجين OR، الولايات المتحدة الأمريكية، القط. No.S991)
  • Cy3-tyramide تقارن (بيركن إلمر العلوم الحياتية، بوسطن، MA، الولايات المتحدة الأمريكية، القط. رقم SAT704A)
  • DABCO تصاعد الحل: في أنبوب 50 مل، 1،25 غرام من تمييع DABCO (1،4-diazabicyclo [2.2.2] اوكتان؛ سيغما D-2522) في 15 مل من 1X PBS، ثم يضاف 35 مل من الجلسرين وتخلط حتى تماما متجانسة. من premixing مع PBS، يذوب مسحوق DABCO بسرعة كبيرة. حل محل تصاعد في -20 ° C.
  • الشرائح الزجاجية، coverslips

معدات

  • Nutating خلاط
  • الأقنية pipettor
  • مضان المجهر
  1. إعداد PBTB الحل، تحتوي على PBT + 1٪ غير دهن الحليب الجاف (عادة 50-100 مل كافية لكشف كل حضانة كاشف والخطوات الغسيل).
  2. منع عينات لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 100 ميكرولتر PBTB / عينة في حين هزاز على nutator.
    3. <لى> إزالة حجب حل من أجنة واحتضان لمدة 1،5-2 عينات ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 100 ميكرولتر / عينة حل البيوتين ضد وحيد النسيلة المضادة للDIG (مخفف 1/400 من المخزون في PBTB) مع هزاز.
  3. غسل العينات 6 مرات لمدة 5 دقائق كل مع 100 ميكرولتر PBTB / عينة مع هزاز.
  4. احتضان 1.5 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 75 مل / عينة من streptavidin-HRP الحل (مخفف 1/100 من الأسهم في PBTB، 10 ميكروغرام / مل تركيز النهائي) مع هزاز.
  5. غسل العينات 6 مرات لمدة 5 دقائق كل 100 ميكرولتر PBTB / عينة مع هزاز (لcounterstaining DNA، لتمييع 1X دابي تركيز العمل في PBTB واستخدام هذا الحل في الخطوة غسل الأول)
  6. شطف الأجنة مع PBT، ثم يغسل 2 مرات لمدة 5 دقائق مع برنامج تلفزيوني.
  7. احتضان لمدة 2 ساعة عينات في درجة حرارة الغرفة على nutator مع 50 ميكرولتر / عينة من Cy3-tyramide الحل (مخفف 1/50 في المخزن المؤقت التضخيم Tyramide). من هذه الخطوة على، تأكد للحفاظ على العينات في وعاء ضوء محمية. </ لى>
  8. غسل العينات 6 مرات لمدة 5 دقائق كل ميكرولتر مع 100 عينة / PBS على nutator.
  9. إزالة وإضافة PBS 100-125 ميكرولتر / عينة من حل تصاعد تحتوي على الجلسرين 70٪ و 2.5٪ (DABCO). عينات المحل في 4 درجات مئوية. ويمكن تخزين هذه العينات لعدة سنوات.
  10. باستخدام تلميح واسعة الجوف، إعادة تعليق الأجنة بواسطة pipetting بلطف العينات ونقل سعة 25 ميكرولتر من الأجنة على شريحة زجاجية، ثم ضع ساترة على الأجنة وختم على الشريحة بطلاء الأظافر.
  11. تحليل عينات الجنين باستخدام مجهر مضان.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

عندما أجريت بنجاح، هذا الإجراء يوفر مستوى معزز لافت للنظر من التفاصيل في التحليل المكانية والزمانية في التعبير الجيني وديناميات توطين مرنا خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر ذبابة الفاكهة. في الواقع، كما هو موضح في الشكل 3A للقزم الكلاسيكية زوج من الجينات القاعدة (المدى)، يمكن للمرء استخدام هذا البروتوكول لمراقبة الأحداث عن طريق التعبير الجيني للكشف عن بؤر نص الوليدة في مجموعات للتعبير عن النوى. وبالإضافة إلى ذلك، كما هو مبين في الفسيفساء الجنين في الشكل 3B، وطريقة تمكن من الميزات التصور توطين مرنا في ذات الدقة العالية.

الشكل 1
الشكل 1. مخطط الداخلي RNA إعداد التحقيق. (A) تمثيل تخطيطي من استراتيجيتنا لتوليف حفر ذات العلامات تحقيقات RNA من النسخ في المختبر النقيبGA قالب DNA RNA الخطية يحيط مع عناصر الجراثيم بوليميريز المروج. (B) صورة من معيار 1٪ الاغاروز هلام تظهر أمثلة من تحقيقات في المختبر RNA المحولة للH2A هيستون، تشغيل وثيقة الرناوات ينقول. نقوم عادة الكهربائي جنبا إلى جنب كل من قالب PCR RNA والتحقيق. وعادة ما يظهر RNA الفرقة ومنفصلة مكثفة مع ارتفاع التنقل بالمقارنة مع القالب

الشكل 2
الشكل 2. التمثيل التخطيطي للخطوات الكشف التحقيق في طريقة FISH. بعد التهجين التحقيق لمعالجة الأجنة، يتم التعرف على حفر تحقيقات ذات العلامات باستخدام المعقدة البيروكسيديز α-DIG الأجسام المضادة، التي المعقد ثم إلى HRP، مترافق streptavidin. ثم يتم تنفيذ Tyramide التضخيم إشارة (TSA) مما أدى إلى تحول كاشف tyramide الى انتخابات حرة ر شكل جذريhrough نشاط HRP. رد الفعل عابر ربط الجذور الحرة tyramide تساهميا إلى بقايا العطرية من البروتينات المجاورة، ومنع انتشارها بعيدا عن مكان التحقيق. والركيزة المعقد لtyramide الأصباغ الفلورية، والتي يمكن الكشف عنها بواسطة الفحص المجهري مضان.

الشكل 3
الشكل 3. أمثلة على النتائج التي تم الحصول عليها باستخدام هذا الإجراء FISH تسليط الضوء على تنوع التعبير مرنا وأنماط توطين التحت خلوية في الأجنة ذبابة الفاكهة. (A) تحليل FISH من زوج من الجينات في مراحل تشغيل قاعدة متميزة من مرحلة التطور الجنيني يكشف كيف التعبير الأولي واسعة في الجزء منتصف من الجنين في المرحلة الجنينية ويتم تكرير 4 في نمط شريطية مجزأة في مراحل لاحقة. (B) تصوير فسيفساء من نتائج FISH تظهر أنواع مختلفة من localizatio مرناأنماط ن في مرحلة الأجنة 4-7. تم إجراء FISH باستخدام DIG-صفت تحقيقات العقاقير التي تم الكشف عنها من قبل المهجنة وحضانات متتابعة مع الأجسام المضادة المضادة للحفر المعقدة البيروكسيديز، streptavidin-HRP، وtyramide Cy3. RNA = أزرق، أحمر = DNA. شريط النطاق في (A) = 25 ميكرومتر، في حين أنه في (B) = 50 ميكرومتر.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

للحصول على خطوات تركيب التحقيق، ونحن عادة ما تولد جريان تحقيقات RNA مضاد من قبل في النسخ المختبر من cDNAs ذبابة الفاكهة كامل طول تضخيم من البلازميدات وجدت في مجموعة جين ذبابة الفاكهة (DGC)، موردا بالتفصيل على الموقع التالي: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html و 14،15. وقد استخدم هذا النهج على نطاق واسع في دراسات كبيرة الحجم ISH تهدف إلى رسم خرائط الجينات وأنماط توطين مرنا في الأجنة ذبابة 9،16. ويمكن طلب البلازميدات DGC من الموارد الجينية ذبابة الفاكهة المركز ( https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ). المرونة في تصميم المواد وبدء الاشعال مخصص مع T7، SP6، أو يتدلى T3 يسمح احد لتوليد بسهولة تحقيقات للكشف عن الأشكال الإسوية مرنا محددة (على سبيل المثال تقسم المتغيرات بدلا من) سص غير الترميز الرناوات غير الممثلة في مجموعات من [كدنا] معيار. عند النظر في تصميم شكل الإسوي محددة تحقيقات، وجدنا أن قوالب تتراوح بين 250-1،000 قواعد يمكن أن تسفر عن نتائج ممتازة FISH.

وبالنسبة للأسماك في الأجنة الطيران، ونحن جزء لا تحقيقات لدينا من قبل العلاج كربونات، بل نستخدم كامل طول جريان النصوص، التي يمكن أن تتراوح في الحجم بين 500-5،000 القواعد. عند تنفيذ FISH على الأنسجة الأخرى التي هي أقل نفاذية لتحقيقات كبيرة، قد يفضل تجزئة الواقع الاختراق التحقيق. ومع ذلك، نحن نفضل الخيار إعداد تحقيقات باستخدام قوالب صغيرة DNA PCR-تضخيم، أو تجميع عدة فردي توليفها تحقيقات الصغيرة معا، بدلا من أداء تجزئة الكيميائي للتحقيقات الكبيرة التي قد تعطي نتائج متغير والحد من جودة الشاملة التحقيق.

كما هو موضح في الخطوات جمع الجنين، نضيف معجون الخميرة عادة إلى لوحات جمع الجنين. سوف عجينة الخميرة بشكل كبيرزيادة عدد البيض الذي تضعه الذباب، وإنتاج البيض يعتمد على بيئة ال 17 في مجال التغذية. وبالإضافة إلى ذلك، سوف الذباب ذبابة الفاكهة في كثير من الأحيان وضع بيضها مباشرة في عجينة الخميرة. يمكنك بسهولة أن تجمع هذه الأجنة عن طريق إذابة الخميرة في الماء لصق باستخدام فرشاة الطلاء الصغيرة ويمر الخليط من خلال جمع سلة. للخطوة dechorionation، وإيجاد حل التبييض 3٪، التي أعدتها تمييع التبييض التجارية (عادة تركيز 6٪) 1:1 مع الماء، ويستخدم في معظم البروتوكولات 13،18،19. في تجربتنا، وجدنا أن احتضان الأجنة مع حل التبييض 3٪ للثانية 90 العروض dechorionation كفاءة. قد تكون هذه المعايير تحتاج إلى تعديل تبعا للحل التبييض التجارية التي هي المتاحة، ولكن ينبغي للمرء أن الحرص على عدم إفرط في التعريض الأجنة لتبييض لأن هذا يمكن أن تتلف العينات. لمراقبة الإجراء dechorionation عن كثب، فمن الممكن أن ننظر إلى الأجنة تحت المجهر رس تأكد من رد فعل dechorionation كاملة، أي أجنة تفقد الزوائد على ظهري عندما يتم dechorionated فيها. وأخيرا، لضمان حسن تثبيت الجنين، ونحن نستخدم حلول الفورمالديهايد الطازجة، والحلول القديمة تميل إلى راسب. لإشارة أخرى، وقد وصفت هذا الإجراء في المواد 13،18،19 الطرق السابقة.

للحصول على خطوات تتعلق permeabilization من الأنسجة الجنينية مع K بروتين، أو الكواشف كشف مثل الأجسام المضادة وأفضل النتائج Cy3-Tyramide، وجدنا باستخدام التخفيفات المبينة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، نظرا لاختلاف البيئات في مختبر والأرصدة كاشف، من المستحسن أن كل مختبر اختبار تجريبيا الكواشف الخاصة لتحديد أفضل تركيز العمل لتلبية احتياجاتهم المحددة. وبالإضافة إلى ذلك، وجدنا تركيزات كاشف الأمثل قد تختلف اعتمادا على الأنسجة تحليلها.

لضمان أن الإجراء الأول FISHق يعطي نتائج قابلة للتكرار دائما، نوصي دائما نضيف ضوابط إيجابية عديدة لفحص، والتي يمكن أن تشمل تحقيقات من النصوص واضحة المعالم مع التعبير / أنماط الترجمة (مثل تشغيل). ويمكن الاطلاع على النصوص مع ضرب أنماط توطين مرنا خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر ذبابة الفاكهة على موقع الويب تحلق بين FISH ( http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ). وعلى العكس، من أجل مراقبة للكشف عن إشارة الخلفية، كما ذكر أعلاه، ينبغي للمرء أن تشمل أيضا 'عدم التحقيق و / أو عينات الحمض النووي الريبي بمعنى التحقيق.

بالإضافة إلى المتقارن tyramide Cy3 المبينة في هذا البروتوكول، وهناك مجموعة متنوعة من غيرها من الكواشف ملون تألقي، مترافق المتاحة تجاريا tyramide من علوم الحياة بيركن إلمر أو مجسات الجزيئية (إينفيتروجن، كندا، المؤتمر الوطني العراقي)، والتي يمكن أن توفر المزيد من المرونة للتجارب التصوير متعدد الألوان . بينما يصف هذه الطريقة الأساسية لدينا procedيمكن تنفيذها لدى عودتهم للأسماك RNA واحدة، والاختلافات من هذه الطريقة للتجارب أكثر تعقيدا، مثل RNA المزدوج FISH أو RNA البروتين شارك في الكشف. للحصول على تفاصيل تتعلق هذه الإجراءات، فإننا نوصي باتباع الإجراءات الموضحة في أساليب FISH القائمة الأوراق 18-20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم عمل أجريت في المختبر Lécuyer بتمويل من علوم والهندسة الوطنية مجلس كندا (NSERC)، والمعاهد الكندية لأبحاث الصحة (CIHR) ودي فون بحوث EN سانتيه كيبيك (FRSQ). ويدعم فابيو الكسيس يفبفر وجايل Moquin-Beaudry من NSERC دراسية البحوث الجامعية، في حين يتم اعتماد كارول Iampietro من الزمالة ما بعد الدكتوراه Pizzagalli انجيلو.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T7, T3 or SP6 RNA Polymerase Fermentas Life Sciences EP0101,EP0111,EP0131 Kits contain reaction buffer.
DIG RNA Labeling Mix Roche Applied Science 11 277 073 910
RNAguard Amersham Biosciences 27-0816-01
3M sodium acetate
Cold 100% ethanol.
Cold 70% ethanol.
Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water.
Heptane
Methanol
proteinase K Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada Catalog No. P2308
40% formaldehyde solution, freshly prepared
PBS-Tween solution (PBT) 1xPBS, 0.1% Tween-20
Glycine solution 2 mg/ ml glycine in PBT
HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc 200-032- 156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG Roche Applied Science, Laval, QC 1 207 733 1/500 dilution of stock solution in PBTB
Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 200-062-156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
Streptavidin-HRP conjugate Molecular Probes, Eugene OR, USA S991 (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
  4. Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
  5. Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
  6. Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  7. Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
  8. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  9. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  10. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
  11. Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
  12. Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
  13. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
  14. Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
  15. Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
  16. Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
  17. Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
  18. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
  19. Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
  20. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).

Tags

علم الأحياء التنموي، العدد 71، البيولوجيا الخلوية، البيولوجيا الجزيئية، علم الوراثة، علم الجينوم،
كله جبل RNA نيون<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; الأجنة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Legendre, F., Cody, N., Iampietro,… More

Legendre, F., Cody, N., Iampietro, C., Bergalet, J., Lefebvre, F. A., Moquin-Beaudry, G., Zhang, O., Wang, X., Lécuyer, E. Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (71), e50057, doi:10.3791/50057 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter