Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Hele Mount RNA Fluorescent Published: January 30, 2013 doi: 10.3791/50057
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 2Department of Biochemistry, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Her beskriver vi en hel-mount fluorescerende

Abstract

Vurdering af ekspressionsmønstret af et gen, såvel som de subcellulære lokalisering egenskaber af sine transskriberede RNA, er vigtige funktioner til at forstå dens biologiske funktion under udvikling. RNA in situ hybridisering (RNA-ISH) er en kraftfuld metode, der anvendes til at visualisere RNA fordeling egenskaber, det være sig på de organismal, cellulære eller subcellulære niveauer 1. RNA-ISH er baseret på hybridiseringen af en mærket nukleinsyreprobe (fx antisense-RNA, oligonucleotider) komplementær til sekvensen af et mRNA eller et ikke-kodende RNA-mål af interesse 2. Da proceduren kræver primære sekvensinformation alene at generere sekvensspecifikke prober, kan det generelt anvendes i en bred vifte af organismer og vævsprøver 3. Faktisk har en række store ISH undersøgelser blevet gennemført for at dokumentere genekspression og RNA lokalisering dynamik i forskellige modelorganismer, hvilket har ført tiletablering af vigtige samfunds ressourcer 4-11. Mens en række af sonde mærkning og detektion strategier er blevet udviklet gennem årene, den kombinerede anvendelse af fluorescens-mærkede påvisningsreagenser og enzymatiske signalforstærkning trin giver betydelige forbedringer i følsomhed og opløsning af proceduren 12. Her beskriver vi en optimeret fluorescerende in situ-hybridisering fremgangsmåde (FISH) under anvendelse af tyramid signalforstærkning (TSA) for at visualisere RNA-ekspression og lokalisering dynamikken i iscenesatte Drosophila-embryoner. Fremgangsmåden udføres i 96-brønds PCR-plade-format, hvilket i høj grad letter samtidig behandling af et stort antal prøver.

Protocol

1. RNA Probe Preparation

Oversigt: I det følgende afsnit beskrives de trin, der kræves for at gøre digoxigenin (Dig)-mærkede RNA-prober egnede til FISH. Det første trin involverer kloning eller PCR amplifikation af en sekvens svarende til den transkriberede region i et gen af ​​interesse, som vil blive anvendt til at generere en sekvens-specifik probe. Dette kan opnås ved først at klone gensegment i et plasmid, hvori det multiple kloningssted er flankeret af bakteriofag promotorelementer (T7, T3 eller SP6), som derefter kan tjene som en template for PCR under anvendelse af flankerende primere, der omfatter promotorsekvenserne , hvorved der genereres en lineær PCR-produkt med forskellige promotorsekvenser i hver ende (fig. 1A). Alternativt, for at undgå kloningstrin, kan man også udføre PCR-opformering fra genomisk DNA eller cDNA under anvendelse af oligonukleotider, der omfatter T7, T3 eller SP6 sekvenser ved deres 5 'ender (fx T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; Sp6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). De lineære PCR-produkter anvendes derefter som templates til at gøre DIG-mærket sense eller antisense RNA-prober ved afstrømning in vitro transcription med det passende polymerase (figur 1B). Når de foretager prober til specifikke gener, anbefaler vi at forberede både sense-og antisense RNA-prober med forskellige polymeraser, som vil være nyttige til vurdering af FISH signal specificitet (dvs. medmindre genet af interesse transkriberes i antisense-orienteringen, vil sense RNA probe afslører niveauet af baggrundssignal). I alle de følgende trin, bør man tage stor omhu for at undgå mulig nedbrydning ved kontaminerende ribonucleaser (RNAser) ved først at rense alle bænkepladser og udstyr med 70% ethanol eller kommercielle RNAse dekontaminering løsninger og ved at bruge RNAse-fri leverancer (fx vand, tips, mikrocentrifugerør).

Marialer

  • 1,5 ml mikrocentrifugerør, (ABgene, Rochester, NY, USA Cat. Nr. 0900)
  • Gel-udvinding kits (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada. Cat No 28.706).
  • RNAse frit vand (Wisent, Inc. Cat. Nr. 809-115-CL)
  • RNA-polymeraser (T7, T3 eller SP6). (20 U / ul, Fermentas Biosciences. Cat. Nr. EP0101, EP0111, EP0131).
  • RNAse-OUT ribonuklease-hæmmere (40 U / ul), (Invitrogen, Burlington ON. Canada.Cat. Nr. 10777-019).
  • Digoxigenin (DIG) nukleotid blandinger (DIG-11-UTP, Roche Applied Biosciences, Laval, QC, Canada. Kat. No.11209256910).

Udstyr

  • Bordplade mikro-centrifuge
  • Gelelektroforese apparat
  1. PCR amplificere genspecifik sekvens fra genomisk DNA, cDNA, eller plasmid-DNA til generering af en lineær PCR-produkt flankeret af bakteriofag T7, T3 eller SP6 promotorsekvenser. Følg producentens anbefalinger for PCR-betingelser.
  2. Kontroller kvaliteten og size af PCR-produktet ved agarosegelelektroforese. Forbrugsafgifter og rense PCR-produkt under anvendelse af en standard gel-ekstraktionskit ifølge fremstiller anbefalinger og eluere produktet i 50 pi buffer.
  3. Udfældning af PCR-produktet ved tilsætning af 5 pi af 3 M natriumacetat (pH 5,2) og 150 pi iskold 100% ethanol, og placere rørene ved -70 ° C natten over. Centrifuger rørene ved 13.000 x g i 10 minutter ved 4 ° C og vaskes pelletten med 70% ethanol. Spin igen ved at fjerne alle spor af ethanol og lufttør pillen. Resuspender i 25-50 pi RNAse-frit vand.
  4. Transskribere DIG-mærket probe under anvendelse af fra 200 til 500 ng renset PCR produkt i en 20 ul reaktion som følger: 2 pi 10X T7 transcription buffer (Invitrogen), 1 pi (20 U / ul) af RNAse inhibitor, 2 ul Dig-NTP mix , og 2 pi T7 RNA-polymerase (20 U / ul). Bringe slutrumfanget til 20 pi med RNAse-frit vand. Inkubér transcription reaktionen ved 37 ° C i 3-4 timer.
  5. Juster transcription blanding til 50 pi med RNAse-frit vand, og udfældning af Dig-mærket RNA-probe som beskrevet i trin 4. Resuspendere det vaskede RNA-pellet i 100 ul RNAse-frit vand. Gemme de resuspenderede prøver ved -70 ° C.
  6. Kvantificere sonden under anvendelse af en nanodrop spektrofotometer. At kontrollere sonden kvalitet, køre en 1-2 ul prøve på en 1-2% agarosegel farvet med ethidiumbromid.

2. Indsamling og Fiksering af Drosophila-embryoner

Oversigt: Dette afsnit beskriver trin til høst og forarbejdning iscenesatte Drosophila foster. Afhængig af antallet af nødvendige embryoer, kan fluer holdes i befolkningen bure i forskellige størrelser. De følgende trin er til samlinger udføres ved hjælp af 900 cm 3 cylindriske bure med 100mm æblejuice indsamling plader. Korrekt fiksering forudsætter fjernelse af to beskyttende lag, der omgiver fosteret: den ydre chorion og den indre vitelline membran 13. Når høstet, embryonerne først badet i en 50% blegeopløsning at fjerne chorion, så de blandes i en bifasisk opløsning indeholdende heptan (permeabilizes vitellinmembranen), og PBS indeholdende 3,7% formaldehyd. Vitellinmembranen derpå krakket og fjernes ved at overføre fostre i en bifasisk blanding af heptan og methanol. Korrekt embryo fiksering og fjernelse af vitellinmembranen er kritisk for en vellykket gennemførelse af downstream FISH procedure.

Materialer

  • Æble-juice-agarplader (40% æblesaft, 4% sucrose, 3,5% agar, 0,3% methylparaben) med dime-sized gær pasta (bagegær blandes med vand til smør konsistens)
  • Pulveriseret paraformaldehyd (Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA, USA,. Cat No 19.208)
  • Heptan
  • Methanol
  • 3% blegemiddelopløsning
  • 20 ml glasscintillationshætteglas (Thermo Fisher Scientific, Ottawa, ON, Canada. Cat No 03-337-15).

Udstyr

  • Population bure
  • Collection kurve (fremstillet under anvendelse af en Nitex net og den øverste del af et snit 50 ml polypropylenrør, hvor et hul er skåret i låget).
  • Lille malerpensel
  • Bordplade vortex
  1. Pre-klare velnærede population bure med frisk æblesaft / gær plade i 1 time ved 25 ° C.
  2. Tilføj en ny æblejuice / gær plade til buret for at høste den tidlige fase embryoner. Inkubér buret i 4 timer ved 25 ° C (bemærk, at indsamling gange kan justeres afhængigt af de ønskede trin).
  3. Der fremstilles en frisk 37% formaldehydopløsning ved at kombinere 3,7 g paraformaldehyd pulver, 70 pi 2 N KOH, og 7,3 ml MilliQ vand i et glasscintillationshætteglas i et kemisk stinkskab. Opløsningen koges indtil paraformaldehydet pulveret er fuldstændigt opløst, hvorefter der afkøles til stuetemperatur og filtreres over i nye scintillationshætteglas.
  4. Der fremstilles en bifasisk fiksering opløsning afkombinere 2,25 ml 1X PBS med 250 ml 37% formaldehyd i et scintillationshætteglas og derefter tilsætte 7,5 ml heptan.
  5. Høste æblesaft pladen fra buret og indsamle de embryoner ved at tilføje en smule af rumtemperatur postevand og delikat børstning embryoner fra pladen med pensel. Overfør resuspenderede embryoner i en kurv og skyl med lunkent vand fra hanen.
  6. Dechorionate embryoner til 90 sek ved badning indsamlingsstederne kurve i blegemiddel løsning, derefter skylles grundigt med lunkent vand fra hanen (indtil blegemiddel lugt er væk).
  7. Skil indsamlingen kurven, indsamle embryoner forsigtigt med en pensel og overføre dem til den tofasede fiksering løsning. Embryonerne vil akkumuleres ved grænsefladen mellem PBS og heptan lag.
  8. Seal scintillationshætteglas og fastgøres til en hvirvelblander. Ryst i 20 min på laveste indstilling.
  9. Fjern og kasser fleste af de nedre PBS og øvre heptan faser under anvendelse af en Pasteur-pipette. Aspirérde resterende PBS / heptan / embryoner blandingen i pipetten. I en dråbevis måde, bortkastes den nederste PBS fasen fra pipetten, pas på ikke at fjerne de embryoner. Deponere embryoner i et 1,5 ml rør indeholdende en bifasisk opløsning af 500 pi heptan (øvre fase) og 500 pi methanol (nedre fase).
  10. Ryst rør kraftigt i hånden i 30-45 sekunder til at knække ægmembraner. Når krakket, vil embryonerne synke ned i methanol.
  11. Skille den øvre heptan fase og uncracked embryoner på heptan / methanol interfase, og der tilsættes 500 gl methanol. Ryst i 5 sek.
  12. Vask 3 gange med methanol og opbevares embryoerne ved -20 ° C (på dette tidspunkt embryoer kan opbevares i uger / måneder).

3. Post-fiksering Processing, hybridisering og Post-hybridisering Vaskene

Oversigt: Dette afsnit beskriver de procestrin for embryo permeabilisering forud for FISH, præ-hybridisering,hybridisering med RNA-prober og post-hybridiserings-vaske. For oprindelige permeabilisering trin embryonerne håndteres som en pulje i et enkelt rør (trin 1-9 nedenfor, der sigter til 10-15 pi afviklede embryoner / prøve), men de er alikvoteret i individuelle brønde i en 96-brønds PCR-plade før du fortsætter med præ-hybridisering (trin 10 nedenfor). Dette hjælper til at sikre ensartet behandling af alle embryoer i de indledende faser af forsøget. Når du opsætter et FISH eksperiment, er det vigtigt at medtage negative kontroller for at bestemme niveauet af baggrunden signal i de enkelte forsøg. Til dette anbefaler vi, herunder en "no-sonde 'prøve, og som nævnt i afsnit 1, en prøve hybridiseret med" fornuft "RNA-probe, som typisk vil give et signal sammenlignes med" no-sonde' tilstand.

Materialer:

  • Methanol
  • Phosphatpufret saltvand med 0,1% Tween-20 (PBT)
  • Proteinase-K 1 mg / ml stamopløsning (Sigma Aldrich, Oakville, ON, Canada. Katalog nr. P2308)
  • Glycin (20 mg / ml stamopløsning)
  • Hybridiseringsopløsning: 50% formamid, 5X SSC, 0,1% Tween-20, 100 g / ml sheared laksesperm-DNA, 100 ug / ml Heparin.
  • 0,2 ml halfskirted 96-brønds PCR-plader, ABgene, Rochester, NY, USA Cat. Nej 0900)

Udstyr

  • Hybridiseringsovn, digital varmeblok eller vandbad indstilles til 56 ° C, 80 ° C eller 100 ° C, eller en PCR maskine.
  • Multikanal pipetter (anbefales at forenkle vasketrin)
  • Mikserens
  1. Skyl embryoner i methanol og derefter i en 1:1-blanding af methanol: PBT og derefter to gange i PBT.
  2. Fastgør embryoner i 20 minutter i 1 ml PBT med 3,7% formaldehyd (frisk fremstillet som beskrevet i trin 11) med konstant rocking på en nutator.
  3. Vask embryoner til 3 gange i 2 minutter i PBT, mens rokkende.
  4. Der fremstilles en opløsning af 3 ug / ml proteinase K (PK) fortyndet i PBT og tilsæt500 ul opløsning til prøver. Inkuber prøver i 10 minutter ved stuetemperatur uden omrystning. Bland fostre hver 2 min ved jetting med en pipette eller ved forsigtigt at vende rørene.
  5. Overfør embryoner prøver på is i 1 time.
  6. Flytte prøver til stuetemperatur og fjerne PK opløsning. Vask 2 gange i 2 minutter med 1 ml PBT + 2 mg / ml glycin.
  7. Fix prøver 20 min i 1 ml PBT + 3,7% formaldehyd med vipning. Skyl embryoner 5 gange i PBT.
  8. Skyl embryoner med 1 ml af en 1:1 blanding af PBT og Hyb opløsning. Erstat med 0,5-1 ml 100% Hyb opløsning (ved dette trin embryonerne kan opbevares i flere dage / uge ved -20 ° C).
  9. Alikvote embryoner til individuelle brønde i en 96-brønds plade (mål for ~ 10-15 pi afviklede embryoner / brønd, sørge for at bruge brede blændeåbning tips til at undgå at beskadige embryoner).
  10. Kog 100 gl / prøve af Hyb opløsning i 5 minutter og afkøles på is i 5 min. Denne opløsning anvendes til prøven forud for hybridisering (Pre-Hyb).
  11. Der tilsættes 100 gl / prøve af Pre-Hyb-opløsning og inkuberes i mindst 2 timer ved 56 ° C.
  12. For hver prøve fortyndes ~ 100 ng probe i 100 gl Hyb opløsning. Opvarm ved 80 ° C i 3 minutter, hvorefter der afkøles på is i 5 min (opvarmede prober kan holdes på is i flere timer).
  13. Fjern Pre-Hyb løsning fra embryoner og erstatte med RNA-probe opløsning.
  14. Hybridiserer ved 56 ° C i 12-16 timer.
  15. Pre-varme følgende vaskeopløsninger ved 56 ° C: (A) 200 gl / prøve af Hyb opløsning, (B) 100 gl / prøve af en 3:1 blanding af Hyb: PBT, (C) 100 gl / prøve af en 1:1 blanding af Hyb: PBT, (D) 100 gl / prøve af en 1:3 blanding af Hyb: PBT, (E) 400 gl / prøve af PBT.
  16. Skyl prøver med 100 ul vaskeopløsning A, derefter udføre vasketrinnet med 100 ul / prøve af opløsninger AD ved 56 ° C i 15 minutter hver. Derefter vaskes prøverne 4 gange i 5 minutter med 100 gl / prøve af opløsning E ved 56 ° C.
  17. Cool prøver til stuetemperatur.

Oversigt: Dette afsnit beskriver antistoffer og detektionsreagenser anvendes til at påvise og synliggøre fordelingen af RNA-proben signal efter hybridisering. Disse trin beskrives skematisk i figur 2.. Her har vi kun præsentere de almindelige detektionsreagenser som vi anvender til robust signal forstærkning, men der findes en række kommercielt tilgængelige reagenser, der kan anvendes som alternativer, især når der udføres dobbelt-FISH eksperimenter til at samarbejde detektere forskellige RNA'er samtidigt for protein-RNA dobbelt farvning. Eksempler på resultater opnået med denne protokol, vises i mRNA ekspression / lokalisering mønster mosaik i figur 3.

Materialer

  • HRP-konjugeret muse-monoklonalt anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nr. 200-032-156)
  • Biotinkonjugeret muse-monoklonalt anti-DIG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc. Cat. Nej 200-062-156)
  • Streptavidin-HRP-konjugat (Molecular Probes, Eugene OR, USA, Cat. No.S991)
  • Cy3-tyramid konjugater (Perkin Elmer Life Sciences, Boston, MA, USA, Cat. Nej SAT704A)
  • DABCO monteringsløsning: I et 50 ml rør, 1,25 g DABCO fortyndes (1,4-diazabicyclo [2.2.2] octan; Sigma D-2522) i 15 ml 1X PBS, hvorefter der tilsættes 35 ml glycerol og bland indtil fuldstændig homogen. Ved forblanding med PBS, er DABCO pulver opløst meget hurtigt. Store montering opløsning ved -20 ° C.
  • Objektglas, dækglas

Udstyr

  • Mikserens
  • Multikanalpipette
  • Fluorescensmikroskop
  1. Forbered PBTB opløsning indeholdende PBT + 1% ikke-fedtholdig tørmælk (sædvanligvis 50-100 ml er tilstrækkelig for alle detektionsreagens inkubation og vasketrin).
  2. Bloker prøver i 10 minutter ved stuetemperatur i 100 gl PBTB / prøve mens vuggende på nutator.
    3. <li> fjernes blokerende opløsning fra embryoner og inkuber prøverne i 1,5-2 timer ved stuetemperatur med 100 pi / sample det monoklonale biotin anti-DIG-antistof-opløsning (fortyndet 1/400 fra lager til PBTB) med vipning.
  3. Vask prøverne 6 gange i 5 min hver med 100 gl PBTB / prøve med vipning.
  4. Der inkuberes 1,5 timer ved stuetemperatur med 75 ml / prøve af streptavidin-HRP-opløsning (fortyndet 1/100 fra lager i PBTB, 10 ug / ml slutkoncentration) med vipning.
  5. Vask prøverne 6 gange i 5 min hver 100 pi PBTB / prøve med rocking (for DNA kontrastfarvning, DAPI fortyndes til 1X arbejdskoncentration i PBTB og anvend denne opløsning i det første vasketrin).
  6. Skyl embryoner med PBT, og vask derefter to gange i 5 minutter med PBS.
  7. Inkuber prøverne i 2 timer ved stuetemperatur på nutator med 50 gl / prøve af Cy3-tyramid opløsning (fortyndet 1/50 i tyramid amplificeringsbuffer). Fra dette trin på, sørg for at holde prøver i en lys afskærmet beholder. </ Li>
  8. Vask prøverne 6 gange i 5 min hver med 100 ul PBS / prøve på nutator.
  9. Fjern PBS og tilsæt 100 til 125 gl / prøve af monterings opløsning indeholdende 70% glycerol og 2,5% (DABCO). Store prøver ved 4 ° C. Disse prøver kan opbevares i adskillige år.
  10. Ved hjælp af en stor indvendig diameter spids, resuspendere embryoner ved forsigtigt at pipettere prøverne og overføre 25 ul af embryoner over på en glasplade, og derefter placere et dækglas over embryoner og tætningen på objektglasset med fingernegl polish.
  11. Analysere embryo prøver under anvendelse af et fluorescensmikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hvornår gennemført, denne procedure giver en markant forbedret niveau af detaljer i den spatio-temporale analyse af genekspression og mRNA lokalisering dynamik i den tidlige Drosophila embryogenese. Som vist i figur 3A for den klassiske pair-reglen genet runt (run), kan man anvende denne protokol til at observere genekspression begivenheder via påvisning af nascent transcript foci i grupper af ekspression kerner. Desuden, som vist i embryonet mosaik i figur 3B fremgangsmåden muliggør visualisering af mRNA-lokalisering funktioner i høj opløsning.

Figur 1
Figur 1. Beskrivelse af RNA-probe fremstillingsprocedure. (A) Skematisk repræsentation af vores strategi til syntetisering af Dig-mærkede RNA-prober ved in vitro transcription usinga lineær DNA-skabelon flankeret af bakteriofag RNA-polymerase promotorelementer. (B) Billede af standard 1% agarose gel, der viser eksempler på in vitro transskriberede RNA-prober for histon H2A-, køre og doc transposonenderne RNA'er. Vi normalt udfører en side om side-elektroforese af både PCR-template og RNA-probe. RNA'et viser sig typisk som en intens særskilt bånd med højere mobilitet i forhold til skabelonen

Figur 2
Figur 2. Skematisk fremstilling af proben detection trin i FISH-metoden. Efter probehybridisering til forarbejdede embryoner, er Dig-mærkede prober anerkendt under anvendelse af en biotinyleret α-Dig-antistof, som derefter kompleksbindes til HRP-konjugeret streptavidin. Tyramid signalforstærkning (TSA) udføres derefter resulterer i omdannelsen af ​​den tyramid-reagens til fri radikal form through aktiviteten af ​​HRP. Forbigående reaktive tyramid frie radikaler kovalent binder til aromatiske rester af nærliggende proteiner, forhindrer deres diffusion væk fra sonden placering. Den tyramid substrat er kompleksbundet til fluorescerende farvestoffer, der kan detekteres ved fluorescensmikroskopi.

Figur 3
Figur 3. Eksempler på Resultaterne heraf FISH procedure fremhæve de forskellige mRNA-ekspression og subcellulær lokalisering mønstre i Drosophila-embryoner. (A) FISH-analyse af parret-reglen gen kørt ved forskellige stadier af embryogenese viser, hvordan den oprindelige brede ekspression i midterdelen af embryonet på fosterstadiet 4 er raffineres til et segmenteret stribemønster i senere faser. (B) Mosaic skildring af FISH resultater viser forskellige sorter af mRNA localization mønstre i fase 4-7 embryoner. FISH blev udført under anvendelse af DIG-mærkede antisense-prober, der blev hybridiseret og påvist ved sekventielle inkubationer med det biotinylerede anti-Dig-antistof, streptavidin-HRP, og Cy3 tyramid. RNA = blå, DNA = rød. Scale bar in (A) = 25 uM, mens den i (B) = 50 uM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

For probe syntesetrin vi typisk genererer afløb antisense RNA-prober ved in vitro transkription fra fuld længde Drosophila cDNA'er amplificeret fra plasmider fundet i Drosophila Gene Collection (DGC), en ressource beskrevet på følgende websted: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. Denne fremgangsmåde har været brugt i udstrakt grad i store ISH undersøgelser med henblik på kortlægning genekspression og mRNA lokalisering mønstre i flyve embryoner 9,16. DGC plasmider kan bestilles fra Drosophila Genomic Resource Center ( https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/ ). Fleksibiliteten i udgangsmaterialer og designe tilpassede primere med T7, SP6, eller T3 overhæng gør det muligt at let generere prober til påvisning af specifikke mRNA-isoformer (fx alternativt splejsede varianter) or ikke-kodende RNA, der ikke er repræsenteret i de standard cDNA samlinger. Når man overvejer designe isoform-specifikke prober, har vi fundet, at skabeloner i området fra 250-1,000 baser kan give fremragende fisk resultater.

For fisk i flyve embryoner, gør vi ikke fragment vore sonder ved carbonat behandling, men snarere bruger vi i fuld længde afløb transkripter, som kan variere i størrelse mellem 500-5.000 baser. Når der udføres FISH på andre væv, der er mindre gennemtrængeligt for store prober, kan fragmentering faktisk favorisere probe penetration. Det foretrækkes imidlertid, at muligheden for fremstilling af prober ved hjælp af mindre PCR-amplificerede DNA-skabeloner og samling af flere individuelt syntetiserede små prober sammen, frem for at udføre kemisk fragmentering af store prober, som giver variable resultater, og reducere det samlede probe kvalitet.

Som beskrevet i de embryonindsamlingsteam skridt, vi normalt tilføje gær pasta til embryonindsamlingsteam plader. Gær pasta vil i høj gradøge antallet af æg lagt af fluer, som ægproduktionen afhænger af den ernæringsmæssige miljø 17. Desuden vil Drosophila fluer ofte lægge deres æg direkte i gær pasta. Disse embryoner kan let opsamles ved opløsning af gæren indsæt i vand med en lille pensel og lede blandingen gennem en samling kurv. For dechorionation trin, en 3% blegeopløsning, fremstillet ved fortynding af kommercielt blegemiddel (typisk 6% koncentration) 1:1 med vand, anvendes i de fleste protokoller 13,18,19. Det er vores erfaring, har vi fundet, at inkubere embryoner med en 3% blegemiddelopløsning for 90 sek tilbyder effektiv dechorionation. Disse parametre kan være nødvendigt at justere afhængigt af den kommercielle blegemiddel løsning, der er til rådighed, men man skal passe på ikke at overeksponere embryoerne at blege, da dette kan beskadige prøverne. Til overvågning af dechorionation procedure nærmere, er det muligt at se på de embryoner under et mikroskop to sørge for dechorionation reaktionen er fuldstændig, dvs embryoner mister deres dorsale vedhæng når de dechorionated. Endelig, for at sikre korrekt embryo fiksering, bruger vi frisk fremstillede formaldehydopløsninger, som gamle opløsninger har tendens til at udfælde. For yderligere reference, har denne procedure er beskrevet i tidligere metoder artikler 13,18,19.

For trin vedrørende permeabilisering af embryonale væv med proteinase K, eller påvisningsreagenser såsom antistoffer og Cy3-tyramid, vi har fundet optimale resultater ved anvendelse af fortyndinger beskrevet i denne protokol. Men på grund af variationer i lab miljøer og reagens lagre, anbefaler vi, at hvert laboratorium empirisk teste deres egne reagenser til at bestemme de bedste arbejdsbetingelser koncentrationer til deres specifikke behov. Derudover har vi fundet den optimale reagenskoncentrationer kan variere afhængigt af de analyserede væv.

At sikre, at FISH procedure is giver konsekvent reproducerbare resultater, anbefaler vi altid tilføje flere positive kontroller til analysen, som kunne omfatte prober for udskrifter med veldefineret udtryk / lokalisering mønstre (f.eks løb). Udskrifter med slående mRNA lokalisering mønstre under tidlig Drosophila embryogenese kan findes på Fly-FISH web site ( http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/ ). Omvendt, for at kontrollere for baggrunden signaldetektering, som nævnt ovenfor, bør man også omfatte "no-probe 'og / eller sense-RNA-probe prøver.

Ud over den Cy3 tyramid konjugat er beskrevet i denne protokol, er der mange andre kommercielt tilgængelige fluorochrom-konjugerede tyramid reagenser fra Perkin Elmer Life Sciences eller Molecular Probes (Invitrogen, Canada, Inc.), som kan tilvejebringe yderligere fleksibilitet til flerfarvet billeddannelse eksperimenter . Selv om denne fremgangsmåde beskriver vores grundlæggende procedUre for enkelt RNA-FISH, variationer af denne fremgangsmåde kan implementeres for mere komplekse eksperimenter, såsom dobbeltstrenget RNA FISH eller RNA-protein-co-detektion. For detaljer vedrørende disse procedurer, anbefaler vi at følge de procedurer, der er beskrevet i de eksisterende FISK metoder papirer 18-20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Ingen interessekonflikter erklæret.

Acknowledgments

Arbejdet udføres i Lecuyer laboratorium er støttet af midler fra National Sciences and Engineering Council of Canada (NSERC), den canadiske Institutes of Health Research (CIHR) og Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ). Fabio Alexis Lefebvre og Gaël Moquin-Beaudry understøttes af NSERC bachelor forskning stipendier, mens Carole Iampietro støttes af Angelo Pizzagalli postdoc-stipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T7, T3 or SP6 RNA Polymerase Fermentas Life Sciences EP0101,EP0111,EP0131 Kits contain reaction buffer.
DIG RNA Labeling Mix Roche Applied Science 11 277 073 910
RNAguard Amersham Biosciences 27-0816-01
3M sodium acetate
Cold 100% ethanol.
Cold 70% ethanol.
Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water.
Heptane
Methanol
proteinase K Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada Catalog No. P2308
40% formaldehyde solution, freshly prepared
PBS-Tween solution (PBT) 1xPBS, 0.1% Tween-20
Glycine solution 2 mg/ ml glycine in PBT
HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc 200-032- 156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG Roche Applied Science, Laval, QC 1 207 733 1/500 dilution of stock solution in PBTB
Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 200-062-156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
Streptavidin-HRP conjugate Molecular Probes, Eugene OR, USA S991 (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
  4. Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
  5. Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
  6. Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  7. Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
  8. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  9. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  10. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
  11. Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
  12. Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
  13. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
  14. Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
  15. Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
  16. Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
  17. Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
  18. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
  19. Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
  20. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).

Tags

Developmental Biology Cellular Biology molekylærbiologi genetik Genomics, Embryo Fluorescent FISH genekspressionsmønster RNA Localization RNA tyramid signalforstærkning TSA knockout bananflue hele mount embryogenese dyremodel
Hele Mount RNA Fluorescent<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisering af<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoner
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Legendre, F., Cody, N., Iampietro,… More

Legendre, F., Cody, N., Iampietro, C., Bergalet, J., Lefebvre, F. A., Moquin-Beaudry, G., Zhang, O., Wang, X., Lécuyer, E. Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (71), e50057, doi:10.3791/50057 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter