Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

הר כולו RNA פלורסנט Published: January 30, 2013 doi: 10.3791/50057
Automatic Translation
*1,2, *1, 1, 1, 1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Institut de Recherches Cliniques de Montréal (IRCM), 2Department of Biochemistry, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

כאן אנו מתארים שלם הר ניאון

Abstract

הערכת דפוסי הביטוי של גן, כמו גם את תכונות לוקליזציה subcellular של רנ"א התעתיקים שלה, הן תכונות מרכזיות להבנת התפקוד הביולוגי שלה במהלך פיתוח. רנ"א כלאה באתר (RNA-ish) הוא שיטה חזקה המשמשת להמחשת מאפייני הפצת RNA, יהיה זה ברמת האורגניזם, סלולרית או subcellular 1. RNA-ish מבוסס על הכלאה של חללית שכותרתו חומצות גרעין (למשל antisense RNA, oligonucleotides) משלימה הרצף של mRNA או יעד שאינו קידוד-RNA של עניין 2. כנוהל מחייב מידע רצף ראשוני בלבד כדי ליצור רצף בדיקות ספציפיות, זה יכול להיות מיושם באופן אוניברסלי למגוון רחב של יצורים ודגימות רקמה 3. ואכן, מספר מחקרי איש בקנה מידה גדול יושם לתעד ביטוי גנים ודינמיקת RNA לוקליזציה באורגניזם מודל שונה, מה שהוביל להקמת משאבי קהילה חשובים 4-11. בעוד מגוון של תיוג בדיקה וזיהוי אסטרטגיות פותח לאורך השנים, השימוש בשילוב של חומרים כימיים זיהוי כותרת-fluorescently וצעדי הגברת אותות אנזימטית מציע שיפורים משמעותיים ברגישות וברזולוציה של ההליך 12. כאן, אנו מתארים ניאון מותאם בשיטת כלאה באתר (FISH) העסקת הגברת אות tyramide (TSA) לדמיין ביטוי RNA ודינמיקת לוקליזציה בעוברי תסיסנית מבוימת. ההליך מתבצע ב96-PCR צלחת פורמט היטב, שמאוד מקל על העיבוד בו הזמני של מספר גדול של דגימות.

Protocol

1. הכנת RNA Probe

סקירה: הסעיף הבא מתאר את הצעדים הנדרשים כדי להפוך את בדיקות Digoxigenin (Dig) שכותרתו-RNA מתאימות לדגים. השלב הראשון כרוך בשיבוט או מחזק את רצף מקביל לאזור תמלל של גן של עניין שניתן להשתמש כדי ליצור חללית רצף ספציפית PCR. זו יכולה להיות מושגת על ידי השיבוט הראשון במגזר הגן לתוך פלסמיד שבו אתר השיבוט המרובה מוקף באלמנטי bacteriophage אמרגן (T7, T3 או SP6), אז מה שיכול לשמש כתבנית לשימוש PCR primers איגוף הכולל את רצפי פרומוטר , ובכך לייצר מוצר PCR ליניארי עם רצפי פרומוטר שונים בכל גפיים (איור 1 א). לחלופין, כדי למנוע את צעד השיבוט, אפשר גם לבצע הגברת PCR מהדנ"א הגנומי או cDNA באמצעות oligonucleotides הכולל T7, T3 או SP6 רצפים בגפיהם 5 '(למשל T7:5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGA-3 '; T3: 5'-AATTAACCCTCACTAAAGGGAGA-3'; SP6: 5'-ATTTAGGTGACACTATAGAAGAG-3 '). מוצרי PCR יניארי לאחר מכן משמשים כתבניות כדי להפוך את בדיקות antisense RNA תחושה או Dig מתויג על ידי ניגר בשעתוק מבחנה עם פולימראז המתאים (1B איור). בעת ביצוע בדיקות עבור גנים ספציפיים, אנו ממליצים להכין שתי בדיקות antisense RNA תחושה והשימוש polymerases נפרד, שיהיה מועיל להערכה סגולי אות דגים (כלומר, אלא אם כן הגן של עניין הוא עבד באורינטצית antisense, תחושת רנ"א הבדיקה תגלה רמת אות רקע). בכל השלבים הבאים, אחד צריך לקחת בזהירות רבה, כדי למנוע הידרדרות אפשרית על ידי ribonucleases המזהם (RNAses) על ידי ניקוי כל תחומי הספסל והציוד הראשון עם פתרוני טיהור RNase מסחריים אתנול או 70% ובאמצעות אספקת RNAse חינם (למשל מים, טיפים, צינורות microcentrifuge).

אמאterials

  • 1.5 צינורות microcentrifuge מ"ל, (Abgene, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב חתול. לא 0900)
  • ערכות ג'ל חילוץ (Qiagen, Mississauga, ON, קנדה;. מק"ט 28706).
  • RNAse חופשי מים (Wisent, חתול בע"מ. מספר 809-115-CL)
  • polymerases RNA (T7, T3, או SP6). (20 U / μl, Fermentas Biosciences. חתול. מספר EP0101, EP0111, EP0131).
  • RNAse-Out מעכבי Ribonuclease (40 U / μl), (Invitrogen, ברלינגטון ON. Canada.Cat. מספר 10777-019).
  • Digoxigenin (DIG) תערובות נוקלאוטיד (DIG-11-UTP, רוש יישומית Biosciences, Laval, QC, קנדה. חתול. No.11209256910).

ציוד

  • בראש טבלת מייקרו צנטריפוגה
  • מנגנון ג'ל אלקטרופורזה-
  1. PCR להגביר רצף הגן ספציפי מ-DNA גנומי, cDNA, או DNA פלסמיד כדי לייצר מוצר PCR יניארי המוקף bacteriophage T7, רצפי פרומוטר T3 או SP6. בצע את המלצות היצרן לתנאי PCR.
  2. ודא את האיכות וsiZE של ​​מוצר PCR ידי אלקטרופורזה agarose ג'ל. בלו ומוצר PCR לטהר בעזרת ערכה סטנדרטית ג'ל שאיבה בהתאם להמלצות ומייצרות elute המוצר ב 50 μl של חיץ.
  3. תזרז את מוצר PCR על ידי הוספת 5 μl יצטט 3M נתרן (pH 5.2) ו 150 μl של 100% אתנול קר כקרח, ולמקם את הצינורות ב -70 מעלות צלזיוס למשך הלילה. צנטריפוגה צינורות ב13000 XG עבור 10 דקות ב 4 ° C ולשטוף גלולה עם אתנול 70%. מסתחרר שוב, להסיר כל העקבות של אתנול ואוויר יבש הגלול. Resuspend ב25-50 μl מי RNAse חינם.
  4. לתמלל חללית לחפור-תווית באמצעות מוצר 200-500 ng מטוהרי PCR בתגובת 20 μl כדלקמן: 2 μl של חיץ שעתוק T7 10X (Invitrogen), μl 1 (20 U / μl) של RNAse מעכב, 2 μl Dig-NTP התמהיל , ו 2 RNA פולימראז T7 μl (20 / μl U). להביא את הנפח הסופי עד 20 μl עם מי RNAse חינם. דגירת תגובת השעתוק על 37 מעלות צלזיוס למשך שעות 3-4.
  5. התאם transcתמהיל ription עד 50 μl עם מי RNAse חינם ויזרז את Dig מתויג-RNA הבדיקה כפי שמתוארת בשלב 4. Resuspend רנ"א הגלולה השטופה ב100 μl מי RNAse חינם. אחסן את דגימות resuspended ב -70 ° C.
  6. לכמת את החללית באמצעות ספקטרופוטומטר nanodrop. כדי לוודא את איכות הבדיקה, הפעל מדגם μl 1-2 בג'ל צבעוני 1-2% agarose עם רומיד ethidium.

2. איסוף וקיבוע של עוברי תסיסנית

סקירה: סעיף זה מתאר את השלבים לקצירה ועיבוד עובר דרוזופילה מבוימת. בהתאם לכך, מספר העוברים הדרושים, זבובים יכולים להישמר בכלובי אוכלוסיות בגדלים שונים. השלבים הבאים הם לאוספים בוצעו באמצעות 900 3 כלובים גליליים סנטימטר באמצעות פלטות איסוף מיץ תפוחי 100mm. קיבעון נאות מחייב את הסרתם של שתי שכבות הגנה המקיפות את העובר: הסיסי החיצוני והפנימי vitellinקרום הדואר 13. שנקטף ברגע, את העוברים הם התרחצו ב50% תמיסת כלור להסיר הסיסי, אז הם מעורבבים בתמיסה המכילה פאזית heptane (permeabilizes קרום vitelline), וPBS המכיל פורמלדהיד 3.7%. אז קרום vitelline סדוק והוסר על ידי העברת העוברים לתערובת פאזית לheptane ומתנול. קיבעון עובר תקין והסרה של קרום vitelline הוא קריטי להצלחה של הליך הדגים במורד הזרם.

חומרים

  • אפל מיץ צלחות אגרו (40% מיץ תפוחים, סוכרוז 4%, אגר 3.5%, 0.3% מהתיל paraben) עם רסק שמרים בגודל מטבע (שמרי האופה מעורבב עם מים לעקביות חמאה)
  • paraformaldehyde אבקה (מדעי אלקטרונים מיקרוסקופים, הטפילד, פנסילבניה, ארה"ב;. חתול מספר 19208)
  • Heptane
  • מתנול
  • 3% פתרון אקונומיקה
  • 20 מיליליטר זכוכית בקבוקוני נצנץ (תרם הפישר סיינטיפיק, אוטווה, ON, קנדה;. מק"ט 03-337-15).

ציוד

  • כלובי אוכלוסייה
  • סלי אוסף (המתבצע באמצעות רשת Nitex ואת החלק העליון של צינור חתוך 50 מ"ל פוליפרופילן שבבור נחתך במכסה).
  • מברשת צבע קטנה
  • מערבולת בראש הטבלה
  1. היטב האכיל כלובים מראש ברורי אוכלוסייה עם צלחת מיץ / שמרי תפוחים טריה לשעת 1 בשעת 25 ° C.
  2. הוסף צלחת חדשה מיץ תפוחים / שמרים לכלוב כדי לקצור עוברים בשלבים מוקדמים. דגירת הכלוב במשך 4 שעות ב 25 ° C (שים לב שזמני איסוף יכולים להיות מותאמים בהתאם לשלבים הרצויים).
  3. הכן 37% פתרון פורמלדהיד טרי על ידי שילוב של אבקת 3.7 גרם paraformaldehyde, 70 μl של 2N KOH ו -7.3 מיליליטר מי milliQ בבקבוקון זכוכית נצנץ מתחת לברדס כימי. מרתיחים את הפתרון עד שאבקת paraformaldehyde הוא נמס לגמרי, אז מגניב לטמפרטורת חדר ומסנן לתוך בקבוקון נצנץ חדש.
  4. הכן את פתרון קיבעון פאזית ידישילוב 2.25 מ"ל של 1X PBS עם 250 מ"ל של פורמלין 37% בבקבוקון נצנץ, ואז מוסיף 7.5 מ"ל של heptane.
  5. לקצור את צלחת מיץ התפוחים מהכלוב ולאסוף את העוברים על ידי הוספה מעט מים ברז טמפרטורת חדר ועדינות מברישה את העוברים מחוץ לצלחת עם המכחול. להעביר את עוברי resuspended לסל ולשטוף במים ברז פושרים.
  6. עוברי Dechorionate עבור 90 שניות על ידי רחיצת סלי האיסוף בפתרון אקונומיקה, ולאחר מכן לשטוף היטב במים ברז פושר (עד ריח אקונומיקה נעלם).
  7. לפרק את סל האיסוף, לאסוף עוברים בעדינות באמצעות מכחול ולהעביר אותם לפתרון הקיבעון פאזית. העוברים יצטברו בממשק שבין PBS ושכבות heptane.
  8. בקבוקוני חותם נצנץ ויתחבר למיקסר מערבולת. Shake במשך 20 דקות על הגדרה הנמוכה ביותר.
  9. להסיר ולסלק את רוב שלבי PBS והעליון הנמוכים heptane באמצעות פסטר פיפטה. לשאוב/ עוברי PBS / heptane התערובת שנותרה לתוך פיפטה. באופנת dropwise, להשליך את שלב PBS הנמוך מפיפטה, נזהר שלא לחסל את העוברים. להפקיד את העוברים לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל פתרון פאזית לheptane μl 500 (שלב העליון) ומתנול μl 500 (שלב נמוך יותר).
  10. Shake צינורות נמרצות ביד במשך 30-45 שניות לפצח את קרומי vitelline. נסדק ברגע, את העוברים ישקעו במתנול.
  11. השלך את השלב העליון heptane ועוברי uncracked בשלבי ביניים / מתנול heptane, ולהוסיף 500 μl של מתנול. Shake למשך 5 שניות.
  12. לשטוף 3 פעמים עם מתנול ולאחסן את העוברים ב -20 ° C (בשלב זה ניתן לאחסן את העוברים במשך שבועות / חודשים).

3. לאחר קיבוע עיבוד, הכלאה ולאחר ההכלאה שוטפת

סקירה: סעיף זה מפרט את צעדי העיבוד לpermeabilization עובר לפני הדגים, הכלאה-מראש,הכלאה עם בדיקות RNA ושטיפות לאחר הכלאה. לקבלת השלבים הראשוניים permeabilization עוברי מטופלים כברכה בצינור יחיד (שלבים 1-9 להלן, מכוון עבור 10-15 μl של עוברים / מדגם התיישבו), אבל הם aliquoted לתוך בארות בודדות של צלחת 96-PCR גם לפני שימשיך בשלב טרום הכלאה (שלב 10 להלן). פעולה זו מסייעת להבטיח אפילו טיפול של כל העוברים בשלבים הראשוניים של הניסוי. בעת הגדרת ניסוי דגים, חשוב לכלול פקדים שליליים כדי לקבוע את רמת אות רקע בניסויים נפרדים. לשם כך, אנו ממליצים בכלל המדגם 'ללא בדיקה ", וכפי שציין בסעיף 1, מדגם הכלאה עם' החוש 'רנ"א החללית, אשר בדרך כלל תיתן איתות דומה למצב' ללא הבדיקה".

חומרים:

  • מתנול
  • פוספט נאגר מלוח עם 0.1% Tween-20 (PBT)
  • Proteinase K-1 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות (סיגמה אולדריץ, Oakville, ON, קנדה. מספר P2308)
  • גליצין (20 מ"ג / מיליליטר פתרון מניות)
  • פתרון הכלאה: פוראמיד 50%, SSC 5X, 0.1% Tween-20, 100 / מיליליטר גרם של DNA זרע סלמון טעון, 100 הפארין מיקרוגרם / מ"ל.
  • 0.2 מ"ל halfskirted 96-PCR גם צלחות, Abgene, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב חתולים. לא 0900)

ציוד

  • אמבטית תנור הכלאת בלוק, דיגיטלי או חימום מי מתכוונן עד 56 ° C, 80 ° C או 100 ° C, או מכונת ה-PCR.
  • פיפטורים רב (מומלץ לפשט את פעולות כביסה)
  • Nutating מיקסר
  1. יש לשטוף את העוברים במתנול, ולאחר מכן בתערובת ביחס 1:1 של מתנול: PBT, ולאחר מכן פעמים בPBT.
  2. תקן את העוברים במשך 20 דקות ב1 מ"ל של PBT המכיל פורמלדהיד 3.7% (המוכן טרי כמתואר בשלב 11) עם נדנדה מתמדת בnutator.
  3. שטוף את העוברים במשך 3 פעמים עבור 2 דקות בPBT תוך נדנדה.
  4. הכן את הפתרון של 3 מיקרוגרם / מ"ל ​​של proteinase K (קי) בדילול PBT ולהוסיף500 μl של פתרון לדגימות. דגירת דגימות למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר בלי לרעוד. מערבב עוברים כל 2 דקות על ידי jetting עם פיפטה או על ידי ההיפוך בעדינות את הצינורות.
  5. העברת דגימות עוברים על קרח ל1 שעות.
  6. להעביר דגימות לטמפרטורת חדר ולהסיר פתרון PK. לשטוף 2 פעמים עבור 2 דקות עם 1 מ"ל של PBT + 2 מ"ג / המ"ל גליצין.
  7. תקן דגימות 20 דקות ב1 מ"ל של PBT + פורמלדהיד 3.7% עם נדנדה. יש לשטוף את העוברים 5 פעמים ב PBT.
  8. יש לשטוף את עוברים עם 1 מ"ל של תערובת ביחס 1:1 של PBT ופתרון היב. חלף עם 0.5-1 מ"ל של 100% פתרון היב (בשלב זה את העוברים יכולים להיות מאוחסנים במשך כמה ימים / שבועות ב -20 ° C).
  9. עוברי aliquot לתוך בארות בודדות של צלחת 96-היטב (למטרה ~ 10-15 μl של עוברים התיישבו / היטב, לטפל להשתמש טיפי צוהר רחבים כדי למנוע פגיעה בעוברים).
  10. מרתיח 100 μl / מדגם של פתרון היב למשך 5 דקות ולאחר מכן לצנן על קרח למשך 5 דקות. פתרון זה משמש לטרום הכלאת מדגם (טרום היב) .
  11. הוסיפו 100 μl / מדגם של פתרון טרום היב ודגירה של לפחות 2 שעות על 56 ° C.
  12. עבור כל מדגם, לדלל ~ 100 ננוגרם של חללית ב 100 μl של פתרון היב. חום ב 80 מעלות צלזיוס במשך 3 דקות, ואז מגניבות על קרח למשך 5 דקות (בדיקות מחוממות יכולות להישמר על קרח לכמה שעות).
  13. הסר את הפתרון טרום היב מהעוברים ולהחליף עם פתרון בדיקת רנ"א.
  14. להכליא על 56 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות.
  15. לשטוף את הפתרונים הבאים מראש, חמים, ב56 ° C: () 200 μl / מדגם של פתרון היב; (ב) 100 μl / מדגם של תמהיל 3:01 של היב: PBT; (ג) 100 μl / מדגם של 01:01 שילוב של היב: PBT; (ד ') 100 μl / מדגם של תמהיל 1:03 של היב: PBT; (E) 400 μl / מדגם של PBT.
  16. שטוף עם 100 דגימות של פתרון μl לשטוף, ואז לבצע את שלב השטיפה עם 100 μl / מדגם של ספירת פתרונות על 56 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כל אחד. לאחר מכן, לשטוף דגימות 4 פעמים למשך 5 דקות עם 100 μl / מדגם E פתרון על 56 ° C.
  17. דגימות להתקרר לטמפרטורת חדר.

ילדה = "jove_title"> 4. איתור חללית

סקירה: סעיף זה מתאר את הנוגדנים וריאגנטים זיהוי המשמשים לזיהוי ולהמחיש חלוקת ההכלאה הבאה אות בדיקת רנ"א. צעדים אלו התוו סכמטי באיור 2. כאן אנו מציגים רק את ריאגנטים זיהוי הרגילים שאנו משתמשים להגברת אות יציבה, אך קיים מגוון חומרים כימיים מסחריים קיימים שניתן להשתמש בם כתחליף, במיוחד בעת ביצוע ניסויים-FISH הכפול לשתף לזהות RNAs השונה בו זמנית לחלבון-RNA הכפול מכתים. דוגמאות לתוצאות שהושגו עם פרוטוקול זה מוצגות בפסיפס mRNA ביטוי / לוקליזציה הדפוס באיור 3.

חומרים

  • HRP-מצומדות עכבר חד שבטי אנטי DIG (חתול ג'קסון ImmunoResearch מעבדות בע"מ. מספר 200-032-156)
  • ביוטין מצומדות עכבר חד שבטי אנטי DIG (ג'קסון Immunחתול בע"מ oResearch מעבדות. מספר 200-062-156)
  • Streptavidin-HRP המצומד (בדיקות מולקולריות, יוג'ין ו, ארה"ב, חתול. No.S991)
  • conjugates Cy3-tyramide (מדעי פרקין אלמר חיים, בוסטון, מסצ'וסטס, ארה"ב, קאט. המספר SAT704A)
  • DABCO הרכבת פתרון: בצינור מ"ל 50, לדלל 1.25 גרם של DABCO (1,4-diazabicyclo [2.2.2] יוקטן; סיגמא D-2522) ב15 מ"ל של 1X PBS, ואז מוסיף 35 מ"ל של גליצרול ומערבבים עד מלא הומוגנית. על ידי premixing עם PBS, אבקת DABCO נמסה מהר מאוד. פתרון הרכבת חנות ב -20 ° C.
  • שקופיות זכוכית, coverslips

ציוד

  • Nutating מיקסר
  • pipettor רב ערוצים
  • מיקרוסקופ פלואורסצנטי
  1. להכין תמיסת PBTB, המכילה PBT 1% + חלב יבש ללא שומן (בדרך כלל 50-100 מ"ל מספיק עבור כל הדגירה מגיבה איתור וצעדי כביסה).
  2. חסום את הדגימות למשך 10 דקות בטמפ החדר בPBTB / מדגם μl 100 בעוד מתנדנד על nutator.
    3. <li> הסרת חסימה מפתרון עוברים ודגימות דגירה במשך 1.5-2 שעות בטמפרטורת חדר עם μl / מדגם 100 פתרון חד השבטי ביוטין אנטי DIG הנוגדן (בדילול 1/400 ממניות לPBTB) עם נדנדה.
  3. לשטוף דגימות 6 פעמים למשך 5 דקות כל אחד עם PBTB 100 μl / מדגם עם נדנדה.
  4. דגירת 1.5 שעות בטמפרטורת חדר עם 75 מ"ל / מדגם של streptavidin-HRP פתרון (בדילול 1/100 ממניות בPBTB, 10 מיקרוגרם / מיליליטר ריכוז סופי) עם נדנדה.
  5. לשטוף דגימות 6 פעמים למשך 5 דקות כל אחד 100 PBTB / מדגם μl עם נדנדה (לcounterstaining-DNA, לדלל DAPI לריכוז עבודת 1X בPBTB ולהשתמש בפתרון זה בשלב השטיפה הראשון).
  6. יש לשטוף את עוברים בעלי PBT, לאחר מכן לשטוף 2 פעמים למשך 5 דקות עם PBS.
  7. דגירת דגימות עבור 2 שעות בטמפרטורת החדר בnutator עם 50 μl / מדגם של פתרון Cy3-tyramide (בדילול 1/50 בחיץ ההגברה Tyramide). מהשלב הזה ב, הקפד לשמור דגימות בקיבול מוגן אור. </ Li>
  8. לשטוף דגימות 6 פעמים למשך 5 דקות כל אחד עם / מדגם PBS μl 100 בnutator.
  9. הסר PBS ולהוסיף 100-125 μl / מדגם של פתרון גובר המכיל גליצרול 70% ו -2.5% (DABCO). דגימות חנות ב 4 ° C. דגימות אלו יכולות להיות מאוחסנות במשך מספר שנים.
  10. שימוש קצה רחב ומשעמם, resuspend את העוברים על ידי pipetting בעדינות את הדגימות ולהעביר 25 μl של עוברים על גבי זכוכית, ואז למקם coverslip על העוברים וכלב הים על גבי השקופית עם לכה לציפורניים.
  11. לנתח דגימות עובר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

כאשר בצעו בהצלחה, הליך זה מציע רמה להדהים משופרת של פרטים במרחב ובזמן הניתוח הזמני של ביטוי גנים ודינמיקת לוקליזציה mRNA במהלך ההתפתחות עוברת תסיסנית מוקדם. ואכן, כפי שמודגם באיור 3 א לננס זוג השלטון הגנטי הקלסי (ריצה), ניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לבחון ביטוי גני אירועים באמצעות זיהוי של מוקדי תמליל המתהווים בקבוצות של הבעת גרעינים. בנוסף, כפי שמוצג בפסיפס העובר באיור 3B, השיטה מאפשרת הדמיה של תכונות לוקליזציה mRNA ברזולוציה גבוהה.

איור 1
איור 1. קווי מתאר של הליך הכנת חללית רנ"א. () ייצוג סכמטי של האסטרטגיה שלנו לסינתזת RNA Dig בדיקות שכותרתו על ידי שעתוק במבחנת usinתבנית ה-DNA ליניארי ga מוקף עם אלמנטים של פרומוטר RNA פולימראז bacteriophage. (ב) תמונה של תקן 1% agarose ג'ל מראה דוגמאות של תעתיקי רנ"א בבדיקות מבחנה לh2a היסטון, הריצה וRNAs doc transposon. אנחנו בדרך כלל לבצע אלקטרופורזה Side-by-צד של שניהם תבנית PCR ובדיקת רנ"א. רנ"א מופיע בדרך כלל כלהקה דיסקרטית אינטנסיבית עם ניידות גבוהה יותר בהשוואה לתבנית

איור 2
איור 2. ייצוג סכמטי של גילוי הבדיקה בשיטת FISH. בעקבות הכלאת בדיקה לעוברים מעובדים, בדיקות Dig שהכותרת מוכר באמצעות נוגדן α-Dig biotinylated, שלאחר מכן ומורכב לstreptavidin HRP-מצומדות. הגברת אות Tyramide (TSA) לאחר מכן, וכתוצאה מכך בצעה את הפיכתו של מגיב tyramide לתוך t צורה הרדיקלית החופשיhrough הפעילות של HRP. רדיקלים חופשיים tyramide transiently תגובתי קוולנטית להיקשר לשאריות ארומטיים של חלבונים סמוכים, ומונעים את התפשטותם מהמיקום החללי. מצע tyramide הוא ומורכב לצבעי ניאון, שניתן לאתר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

איור 3
איור 3. דוגמאות לתוצאות שהושגו באמצעות הליך הדג הזה מדגיש את הגיוון של ביטוי mRNA ודפוסי לוקליזציה subcellular בעוברי תסיסנית. () ניתוח דגים של גן זוג השלטון לפעול בשלבים שונים של התפתחות עוברת מגלה כיצד הביטוי הרחב הראשוני באמצע החלק של העובר בשלב עוברי 4 הם מעודנים לפס דפוס מפולח בשלבים מאוחר יותר. (ב) תיאור פסיפס של תוצאות דגים מראים זנים שונים של mRNA localizatioדפוסי n בעוברים בשלבים 4-7. דגים בוצעו באמצעות Dig-שכותרתו בדיקות antisense שהכלאה וזוהו על ידי incubations הרציף עם הנוגדן אנטי biotinylated Dig, streptavidin-HRP, וCy3 tyramide. רנ"א = כחול, DNA = אדום. סרגל קנה מידה ב() = 25 מיקרומטר, בעוד שב( B) = 50 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

לצעדי סינתזת בדיקה, אנחנו בדרך כלל לייצר חלליות ניגרו antisense RNA שעתוק במבחנה על ידי מcDNAs תסיסנית באורך מלא מוגבר מפלסמידים נמצאו בדרוזופילה ג'ין האוסף (DGC), משאב המפורט באתר הבא: http://www .fruitfly.org / DGC / index.html 14,15. גישה זו נמצאת בשימוש נרחב במחקרי איש בקנה מידה גדולים שנועדו ביטוי מיפוי גנטי ודפוסי לוקליזציה mRNA בעוברי זבובים 9,16. פלסמידים DGC ניתן להזמין מתסיסנית הגנום מרכז המשאבים (https://dgrc.cgb.indiana.edu/vectors/). הגמישות בהפעלת חומרים ועיצוב מותאמים אישית עם פריימרים T7, SP6, או מסוכך T3 מאפשרת ליצור בקלות בדיקות לגילוי isoforms mRNA הספציפי (לדוגמה: גרסות שחבור החלופי) or ללא קידוד RNAs שאינם מיוצגים באוספי cDNA הסטנדרטיים. כאשר שוקלים בדיקות תכנון איזופורם ספציפיים, מצא כי תבניות הנעות בין 250-1,000 בסיסים יכולות להניב תוצאות דגים מעולות.

לדגים בעוברי זבובים, אנחנו לא שבר הבדיקות שלנו על ידי טיפול קרבונט, אלא אנו משתמשים ניגרו תמלילים באורך מלא, שיכול לנוע בגודל בין 500-5,000 בסיסים. בעת ביצוע דגים ברקמות אחרות, כי הם פחות חדירים לבדיקות גדולות, פיצול עלול אכן להעדיף חדירת חללית. עם זאת, אנו מעדיפים את האופציה של הכנת בדיקות תוך שימוש בתבניות DNA PCR מוגבר-קטנות יותר, או איגום בדיקות מרובות בנפרד מסונתזות-קטנות ביחד, במקום לבצע פיצול כימי של חלליות גדולות אשר עשוי לתת תוצאות משתנות ולהקטין את איכות בדיקה כוללת.

כפי שתואר בשלבי איסוף העובר, אנחנו בדרך כלל מוסיפים רסק שמרים לפלטות איסוף העובר. רסק שמרים מאודלהגדיל את מספר הביצים שהטילו את הזבובים, כייצור ביצים תלויות בסביבת 17 התזונתיים. בנוסף, זבובי תסיסנית יהיו לעתים קרובות מטילים את ביציהן ישירות לתוך עיסת השמרים. עוברים אלה יכולים בקלות להיות שנאספו על ידי המסת השמרים להדביק במים באמצעות מברשת צבע קטנה ועובר את התערובת דרך סל איסוף. עבור שלב dechorionation, 3% בתמיסת כלור, שהוכנה על ידי דילול האקונומיקה מסחרית (ריכוז 6% בדרך כלל) 01:01 במים, משמש ברוב הפרוטוקולים 13,18,19. מניסיוננו, אנחנו רואים שדוגרים עוברים עם 3% בתמיסת כלור ל90 שניות מציעה dechorionation היעיל. פרמטרים אלה ייתכן שיצטרכו להיות מותאמים בהתאם לתמיסת כלור המסחרית שזמינה, אבל צריך להיזהר שלא לחשוף יותר מדי את העוברים לאקונומיקה שכן זה יכול לפגוע בדגימות. כדי לפקח על הליך dechorionation יותר מקרוב, אפשר להסתכל על העוברים תחת מיקרוסקופ לאo לוודא תגובת dechorionation היא מוחלטת, כלומר לאבד את עוברי ספיחי גבם כאשר הם dechorionated. לבסוף, כדי להבטיח קיבוע עובר תקין, אנו משתמשים בפתרוני פורמלדהיד טרי, כמו פתרונות ישנים נוטים לשקוע. לפרטים נוספים, הליך זה כבר תאר במאמרים קודמים שיטות 13,18,19.

לצעדים הנוגעים לpermeabilization של רקמות עובריות עם proteinase K, או חומרים כימיים כגון גילוי הנוגדנים ותוצאות אופטימליות Cy3-Tyramide, שמצאנו באמצעות הדילולים המתוארים בפרוטוקול זה. עם זאת, בשל שינויים בסביבות מעבדה ומניות מגיבים, אנו ממליצים שכל מעבדה לבדוק אמפירית ריאגנטים שלהם כדי לקבוע את ריכוזי העבודה הטובים ביותר עבור הצרכימים הספציפיים שלהם. בנוסף, מצאו הריכוזים המגיבים האופטימליים עשויים להשתנות בהתאם לרקמות שנותחו.

כדי להבטיח שהליך הדגים אניזה נותן תוצאות באופן עקבי לשחזור, אנו ממליצים תמיד הוספת מספר פקדים חיוביים לבדיקה, אשר יכולים לכלול בדיקות עבור תמלילים עם ביטוי מוגדר היטב / דפוסי לוקליזציה (למשל ריצה). תעתיקים עם דפוסי לוקליזציה mRNA בולטים במהלך ההתפתחות עוברת תסיסנית המוקדמת ניתן למצוא באתר האינטרנט של טוס דגים (http://fly-fish.ccbr.utoronto.ca/). לעומת זאת, לשליטה לגילוי אותות רקע, כאמור, אחד צריכה לכלול גם 'ללא בדיקה' ו / או בדיקת דגימות RNA תחושה.

בנוסף להצמוד tyramide Cy3 המתואר בפרוטוקול זה, יש מגוון של חומרים כימיים אחרים זמין מסחרי fluorochrome-מצומדות tyramide ממדעי פרקין אלמר חיים או בדיקות מולקולריות (Invitrogen, קנדה, Inc), אשר יכול לספק גמישות נוספת לניסויי ססגוניות הדמיה . בעוד ששיטה זו מתארת ​​proced הבסיסי שלנויור לדגי RNA בודדים, וריאציות של שיטה זו ניתן ליישם עבור ניסויים מורכבים יותר, כגון דגים הכפולים RNA או RNA-חלבון שיתוף זיהוי. לפרטים הנוגעים להליכים אלה, מומלץ לבצע את ההליכים המתוארים בשיטות דגים קיימות ניירות 18-20.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

העבודה שנערכה במעבדת Lécuyer נתמכת על ידי מימון מהלאומיים למדעים והנדסת המועצה של קנדה (NSERC), מכון הקנדי לבריאות מחקר (CIHR) וFonds דה המשוכללת והנדירה en סנטה קוויבק (FRSQ). פאביו אלקסיס לפבר וגאל Moquin-ודרי נתמכת על ידי מחקר לתואר הראשון studentships NSERC, בעוד קרול Iampietro נתמך על ידי מלגת דוקטורט אנג'לו Pizzagalli.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
T7, T3 or SP6 RNA Polymerase Fermentas Life Sciences EP0101,EP0111,EP0131 Kits contain reaction buffer.
DIG RNA Labeling Mix Roche Applied Science 11 277 073 910
RNAguard Amersham Biosciences 27-0816-01
3M sodium acetate
Cold 100% ethanol.
Cold 70% ethanol.
Chlorine bleach solution diluted 1:1 with water.
Heptane
Methanol
proteinase K Sigma Aldrich Oakville, ON, Canada Catalog No. P2308
40% formaldehyde solution, freshly prepared
PBS-Tween solution (PBT) 1xPBS, 0.1% Tween-20
Glycine solution 2 mg/ ml glycine in PBT
HRP-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc 200-032- 156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
HRP-conjugated sheep monoclonal anti-DIG Roche Applied Science, Laval, QC 1 207 733 1/500 dilution of stock solution in PBTB
Biotin-conjugated mouse monoclonal anti-DIG Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA 200-062-156 (1/400 dilution of a 1 mg/ml stock solution in PBTB
Streptavidin-HRP conjugate Molecular Probes, Eugene OR, USA S991 (1/100 dilution of a 1 μg/ml stock

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wilcox, J. N. Fundamental principles of in situ hybridization. J. Histochem. Cytochem. 41, 1725-1733 (1993).
  2. Tautz, D., Pfeifle, C. A non-radioactive in situ hybridization method for the localization of specific RNAs in Drosophila embryos reveals translational control of the segmentation gene hunchback. Chromosoma. 98, 81-85 (1989).
  3. Lecuyer, E., Tomancak, P. Mapping the gene expression universe. Curr Opin Genet Dev. 18, 506-512 (2008).
  4. Tomancak, P., et al. Global analysis of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 8, 2007-208 (2007).
  5. Thisse, B., et al. Spatial and temporal expression of the zebrafish genome by large-scale in situ hybridization screening. Methods Cell Biol. 77, 505-519 (2004).
  6. Quiring, R., et al. Large-scale expression screening by automated whole-mount in situ hybridization. Mech. Dev. 121, 971-976 (2004).
  7. Pollet, N., et al. An atlas of differential gene expression during early Xenopus embryogenesis. Mech. Dev. 122, 365-439 (2005).
  8. Lein, E. S., et al. Genome-wide atlas of gene expression in the adult mouse brain. Nature. 445, 168-176 (2007).
  9. Lecuyer, E., et al. Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function. Cell. 131, 174-187 (2007).
  10. Imai, K. S., Levine, M., Satoh, N., Satou, Y. Regulatory blueprint for a chordate embryo. Science. 312, 1183-1187 (2006).
  11. Bell, G. W., Yatskievych, T. A., Antin, P. B. GEISHA, a whole-mount in situ hybridization gene expression screen in chicken embryos. Dev. Dyn. 229, 677-687 (2004).
  12. Wilkie, G. S., Shermoen, A. W., O'Farrell, P. H., Davis, I. Transcribed genes are localized according to chromosomal position within polarized Drosophila embryonic nuclei. Curr. Biol. 9, 1263-1266 (1999).
  13. Rothwell, W. F., Sullivan, W. Drosophila embryo dechorionation. CSH Protoc. , (2007).
  14. Stapleton, M., et al. The Drosophila gene collection: identification of putative full-length cDNAs for 70% of D. melanogaster genes. Genome Res. 12, 1294-1300 (2002).
  15. Rubin, G. M., et al. A Drosophila complementary DNA resource. Science. 287, 2222-2224 (2000).
  16. Tomancak, P., et al. Systematic determination of patterns of gene expression during Drosophila embryogenesis. Genome Biol. 3, (2002).
  17. Terashima, J., Bownes, M. Translating available food into the number of eggs laid by Drosophila melanogaster. Genetics. 167, 1711-1719 (2004).
  18. Lecuyer, E., Parthasarathy, N., Krause, H. M. Fluorescent in situ hybridization protocols in Drosophila embryos and tissues. Methods Mol. Biol. 420, 289-302 (2008).
  19. Lecuyer, E. High resolution fluorescent in situ hybridization in Drosophila. Methods Mol. Biol. 714, 31-47 (2011).
  20. Kosman, D., et al. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846 (2004).

Tags

ביולוגיה התפתחותית גיליון 71 ביולוגיה תאית ביולוגיה מולקולרית גנטיקה גנומיקה, עובר פלורסנט דגים תבנית ביטוי גנים לוקליזציה רנ"א רנ"א הגברת אותות Tyramide TSA נוקאאוט זבוב פרות כל הר embryogenesis מודל חיה
הר כולו RNA פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Legendre, F., Cody, N., Iampietro,… More

Legendre, F., Cody, N., Iampietro, C., Bergalet, J., Lefebvre, F. A., Moquin-Beaudry, G., Zhang, O., Wang, X., Lécuyer, E. Whole Mount RNA Fluorescent in situ Hybridization of Drosophila Embryos. J. Vis. Exp. (71), e50057, doi:10.3791/50057 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter