Summary
En enkel metod för att spela in extracellulära fält potentialer i larver zebrafisk framhjärnan beskrivs. Metoden ger en robust
Abstract
Epilepsi drabbar nästan 3 miljoner människor i USA och upp till 50 miljoner människor över hela världen. Definierades som förekomst av spontana oprovocerade anfall, kan epilepsi förvärvas som ett resultat av en förolämpning mot hjärnan eller en genetisk mutation. Arbetet med att modellen anfall hos djur har främst utnyttjat förvärvat förolämpningar (konvulsiva läkemedel, stimulering eller hjärnskada) och genetiska manipulationer (antisens ÖVERVÄLDIGANDE, homolog rekombination eller genmodifiering) hos gnagare. Zebrafisk är ett ryggradsdjur modellsystem 1-3 som kunde ge ett värdefullt alternativ till gnagare-baserad epilepsi forskning. Zebrafisk användes i stor utsträckning i studier av vertebrat genetik eller utveckling, uppvisar en hög grad av genetisk likhet med däggdjur och uttrycka homologer för ~ 85% av kända humana enda gen epilepsi mutationer. På grund av deras lilla storlek (4-6 mm i längd), kan zebrafisk larver bibehållas i fluidvolymer så låga som 100 pl under tidig utveckling och ArraYED i multi-brunnarsplattor. Reagens kan sättas direkt till den lösning i vilken embryon utvecklas, förenkla läkemedelsadministrering och möjliggöra snabb in vivo-screening av testföreningar 4. Syntetiska oligonukleotider (morpholinos), mutagenes, zinkfinger nukleas och transgena metoder kan användas för att snabbt generera gen ÖVERVÄLDIGANDE eller mutation i zebrafisk 5-7. Dessa egenskaper ger zebrafisk studier en aldrig tidigare skådad statistisk fördel maktanalys över gnagare i studien av neurologiska sjukdomar, såsom epilepsi. Eftersom den "gyllene standarden" för epilepsi forskning är att övervaka och analysera de onormala elektriska urladdningar som har sitt ursprung i en central hjärna struktur (dvs. kramper), en metod för att effektivt registrera hjärnaktivitet i larver zebrafisk beskrivs här. Denna metod är en anpassning av konventionella extracellulära inspelningstekniker och möjliggör en stabil och långsiktig uppföljning av hjärnaktivitet i intakt zebrafisk larver. Sgott inspelningar visas för akut anfall som induceras av bad tillämpning av konvulsiva läkemedel och spontana kramper registreras i en genetiskt modifierad fisk.
Protocol
1. Äggproduktion och samlingen
- Zebrafisk djurhållning följer standardprocedurer som tidigare beskrivits 8. Kortfattat vuxna zebrafisk inrättas i avel tankar med avdelare på plats. När ljuset i rummet kommer på följande morgon, är avdelare bort från avel tankar och fisk får ungefär 20 till 60 minuter av ostörd parning tid.
- Ägg från avel tankar samlas i en sil och sköljdes med ägg vatten. Ägg överförs sedan till en Petri-skål med ägg vatten. Obefruktade ägg och skräp avlägsnas med hjälp av en överföringspipett.
- Placera petriskål som innehåller de insamlade äggen i en inkubator (28-32 ° C). Efter äggen kläcks, omkring två dagar efter befruktning (DPF), ta bort chorion och andra skräp med överföringspipett.
- På önskad dag efter befruktning (3 till 8 dpf) ta bort petriskål innehållande fritt simning larver och plats på labb bänk vid rumstemperatur.
- Med hjälp av en mikropipett avdragare, dra en 1,2 mm OD borsilikatglas kapillär i två nålar och lagra i en 150 mm petriskål eller tom pipett låda genom att lägga över Silly Putty ramper. Nålar kan dras i förväg. Olika OD glaskapillärer kan användas beroende på vilken typ av förstärkare huvudsteg tillgängliga.
- Skjuta upp den mikroelektroden med extracellulära inspelning lösning (2 M NaCl) med en 1 ml spruta med en Nalgene sprutfilter (4-mm) och Microfil glödtråden (Warner precisionsinstrument) bifogas. Skaka eller knacka bolus mot nålspetsen tills det inte finns några eller inga bubblor kvar.
3. Immobilisering i agar
- Bered en färsk lösning av 1,2% låg smältpunkt agar i ägg vatten. Placera agarlösning i ett vattenbad inställd på ~ 37 ° C.
- Förbered ett täckglas med inspelning kammare och plats i frysen (5-10 min). Inspelningen Kammaren bör matcH som används på elektrofysiologi riggen. Vi använder en låg profil öppna diamant kammare bad avbildning från Warner Instruments (RC-26GLP).
- Med hjälp av en Pasteur eller överföringspipett, plats ett larver zebrafisk i en liten droppe ägg vatten i en ren petriskål plattan. Till denna droppe, tillsätt en droppe av lösning innehållande ett bedövningsmedel (0,02% tricaine) och förlamande medel (1 mg / ml α-bungarotoxin).
- Övervaka zebrafisk för förlust av rörelse (5 till 10 minuter).
- Ta bort täckglaset / inspelning kammare från frysen. Placera kammare på scenen av ett stereomikroskop. Med hjälp av en överföringspipett, blanda flera ml 1,2% agaros med låg smältpunkt med droppe och överföring lösning (med fisk) till täckglas / inspelningen kammare.
- Med användning av en pipettspets eller fin trubbig nål, läge larver i stereomikroskop så att den dorsala aspekten av fisken utsätts för agarosgelen yta. Låt agaros härda (5-10 min), sedan använda en platt spatel överföring agar Blåsa till en inspelning kammare som inrättats på ett elektrofysiologi rigg.
3. Extracellulär fält Inspelning
- Lägg 2-5 ml zebrafisk inspelningsmedia till inspelningen kammaren. Om läkemedel ändringar är nödvändiga, perfundera kammare med inspelning lösning med en hastighet av ca 1 ml / min. Ingen syresättning av inspelningen lösningen är nödvändig.
- Sätt en mikroelektrod (ungefär 1 pm spetsdiameter, 2-7 MQ) till förstärkaren huvudsteg monterad på en tredimensionell mikromanipulator. Kontrollera att mikromanipulator är i lämpligt läge för att tillåta ett rörelseområde och justering. Ta mikroelektrod spetsen i plan med tanke på mikroskopet, högt från scenen, och använder grovjustering lägre till en punkt strax ovanför och något framför huvudet på zebrafisk.
- Med förstärkaren i "ström-clamp"-läge noll elektroden.
- Använda grovjustering lägre elektrodspetsen så att den precis nuddar surface av zebrafisk, något framför framhjärnan.
- Använda Finjustering steg föra elektrodspetsen tills den punkterar huden på zebrafisk. Låt stå och föra elektroden flera mikrometer i framhjärnan.
- Registrerar elektriska aktiviteten i ström-clamp läge med Axoscope programvara. Data förvärvas till en samplingshastighet på 10 kHz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Exempel på elektrografisk anfall-liknande urladdning registreras i framhjäman av en agar-inbäddad zebrafisk larver visas i figur 1. Stor-amplitud flera spik skur urladdning i dessa prover framkallades genom bad applicering av en konvulsiv läkemedel, 40 mM pilokarpin (i A, 6 dpf) eller 1 mM pikrotoxin (i B, 8 dpf). I dessa inspelningar, immobiliserade och agar-inbäddade zebrafisk övervakas kontinuerligt i upp till 90 minuter. Fisk förbli livskraftig under dessa inspelningsförhållanden för upp till 24 timmar. Läkemedel sätts till badmediet och normalt diffunderar in i ägarn att framkalla aktivitet i larver zebrafisk framhjärna inom 30 till 45 min. Denna metod kan användas med relativt små volymer läkemedelslösning (2-5 ml) som larver behöver inte kontinuerlig perfusion och kan spelas i en statisk bad konfiguration vid behov. I panelen C, en spontan burst urladdning visas för en genetiskt modifierad zebrafisk vid 3 DPF, inspelningen gjordes i zebrafiskinspelningsmedier. Morfolino oligonukleotid injektion i 1-2 cellstadiet användes för att ÖVERVÄLDIGANDE uttrycket av en gen för Tuberös skleros Complex (tsc1a), en pediatrisk form av epilepsi i samband med kramper och autism. Extracellulära inspelningar kan även erhållas från den optiska Tectum. För exempel, se Baraban et al. (2005) 9 eller Baraban et al. (2007) 10. Såsom visas här, kan de elektriska händelserna variera i vågform och varaktighet beroende på verkningsmekanismen som används för att framkalla krampanfall.
Figur 1. Extracellulära fältinspelningar av onormal burst urladdning aktivitet registreras i framhjärnan av immobiliserade och agar-inbäddade zebrafisk larver. Inspelning elektroder är placerade under visuellobservation på en Olympus BX50 upprätt mikroskop. Inspelningar i (A) och (B) inleddes ungefär 40 till 45 minuter efter narkotika ansökan. (A) flera spik utsläpp registreras i pilokarpin, en muskarinacetylkolinreceptorn antagonist. (B) Burst utsläpp in i pikrotoxin, en GABA-A-receptor-antagonist. (C) En enda multi-spik burst urladdning som spelats in från en 3 dpf zebrafisk larver injiceras med en morfolino mot tsc1a.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den extracellulära inspelning metod som presenteras här möjliggör en mycket känslig och snabb analys av hjärnaktivitet. Dessa inspelningar är analoga med elektroencefalografiska (EEG) övervakning vanligen används för att utvärdera närvaron av onormala elektrisk urladdning (dvs. kramper) i gnagarmodeller av epilepsi 11 och patienter 12. Extracellulära inspelningar kan kombineras med farmakologiska manipulationer, som visas här. Dessa typer av inspelningar kan också användas för att utvärdera potentiella epileptiska fenotyper i genetiskt modifierade zebrafisk. Mutant zebrafisk är allmänt tillgängliga för många genmutationer som identifierats i ENU mutagenes skärmar (se Zebrafish International Resource Center, http://zebrafish.org/zirc/home/guide.php ) eller genom nya Tol2 transgen 7 och zink finger nukleotid 13 tekniker. Såsom visas här, snabb gen ÖVERVÄLDIGANDE medmorfolino oligonukleotider följt av elektrofysiologisk övervakning redan 3 dpf ger ytterligare metod för att bedöma beslag-inducerande genfel. Inspelningen elektroden kan lätt placeras i en zebrafisk struktur inklusive den optiska Tectum eller cerebellum och flera inspelning elektroder kan användas vid behov. En begränsning av dessa inspelningar är att det är svårt att bedöma den exakta placeringen av inspelningen elektrodspetsen relativt specifik hjärnkärnor. Tillgången på zebrafisk bär fluorescerande reportrar i specifik kärnor eller celltyper kommer mildra denna begränsning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författaren vill tacka Peter Castro och Matthew Dinday för deras tidiga ansträngningar för att etablera zebrafisk i laboratoriet. Detta arbete har finansierats av National Institutes of Health EUREKA bidrag (# R01NS079214-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agarose low melting | Fisher-Scientific | BP1360-100 | Dissolve in embryo media at 1.2% |
| Recording media | Fisher-Scientific | BP3581, P330-3, BP410-1, BP214-500, D16-1, C77-500 | 1 mM NaCl, 2.9 mM KCl, 10 mM HEPES, 1.2 mM MgCl2, 10 mM Dextrose, 2.1 mM CaCl2 pH to approximately 7.3 with 1 N NaOH |
| Tricaine | Argent Labs | MS-222 | 0.02% |
| α-bungarotoxin | Tocris Bioscience | 2133 | 1 mg/ml |
| Capillary glass tubing | Warner Instruments | G120TF-3 | Pull to a resistance of 2 -7 MΩ |
| Patch clamp amplifier | Warner Instruments | PC-505B | We use a Warner amplifier in current-clamp mode; Gain set at 2 mV/pA and Bessel filter set at 2K. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Filter/amplifier | Cygnus Technology | FLA-01 | We use a Cygnus pre-amplifier; Gain set at 10-20; Cut-off frequency set at 1-2K; Notch filter IN. Comparable models can be used according to manufacturer's instructions. |
| Axon A/D board and Axoscope software | Molecular Devices | Axon Digidata 1320A; Axoscope 8.2 | Data is collected in Axoscope using gap-free acquisition mode; sampling at 10 KHz. Comparable models and programs can be used according to manufacturer's instructions. |
| Egg water | Instant Ocean | 3 g Instant Ocean sea salt, 2 ml 0.1% methylene blue in 10 ml deionized water |
References
- Clark, K. J., et al. Stressing zebrafish for behavioral genetics. Reviews in Neuroscience. 22 (1), 49 (2011).
- Rinkwitz, S., et al. Zebrafish: an integrative system for neurogenomics and neurosciences. Progress in Neurobiology. 93 (2), 231 (2011).
- Penberthy, W. T., et al. The zebrafish as a model for human disease. Frontiers in Bioscience. 7, d1439 (2002).
- Letamendia, A., et al. Development and validation of an automated high-throughput system for zebrafish in vivo screenings. PLoS One. 7, e36690 (2012).
- Nasevicius, A., Ekker, S. C. Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish. Nature Genetics. 26 (2), 216 (2000).
- Haffter, P., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral line. Development. 123, 1 (1996).
- Suster, M. L., et al. Transgenesis in zebrafish with the tol2 transposon system. Methods Molecular Biology. 561, 41 (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function. J. Vis. Exp. (25), e1115 (2009).
- Baraban, S. C., et al. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131 (3), 759 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48 (6), 1151 (2007).
- Williams, P., et al. The use of radiotelemetry to evaluate electrographic seizures in rats with kainate-induced epilepsy. Journal of Neuroscience Methods. 155 (1), 39 (2006).
- Marsh, E. D., et al. Interictal EEG spikes identify the region of electrographic seizure onset in some, but not all, pediatric epilepsy patients. Epilepsia. 51 (4), 592 (2010).
- Zhu, C., et al. Evaluation and application of modularly assembled zinc-finger nucleases in zebrafish. Development. 138 (20), 4555 (2011).
