Summary
تجربة تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية ضرورية لقدرة الدماغ على التكيف استجابة للتحديات السلوكية. على
Abstract
قدرة الدماغ على تغيير استجابة لتجربة أمر ضروري لوظيفة الدماغ صحية، وتشوهات في هذه العملية تسهم في مجموعة متنوعة من 1،2 اضطرابات الدماغ. لفهم أفضل للآليات التي دوائر المخ تستجيب لتجربة الحيوان يتطلب القدرة على رصد التغيرات الجزيئية التي تعتمد على الخبرة في مجموعة معينة من الخلايا العصبية، على مدى فترة طويلة من الزمن، في الحيوانات الحية. بينما هو معروف الخبرة والنشاط العصبي لتحريك التغييرات المرتبطة التعبير الجيني في الخلايا العصبية 1،2، أكثر من الأساليب للكشف عن مثل هذه التغييرات لا تسمح المراقبة المتكررة من الخلايا العصبية نفسها خلال الأيام متعددة أو لم يكن لديك ما يكفي من القرار لمراقبة الخلايا العصبية الفردية 3 ، 4. هنا، نحن تصف طريقة يجمع بين الجسم الحي في اثنين من الفوتون المجهري مع مراسل الفلورسنت المشفرة وراثيا لتتبع التغيرات التي تعتمد على تجربة التعبير الجيني في الخلايا العصبية القشرية الفردية على بالطبع من يوم إلى يوم التجربة.
واحد من الجينات التي تعتمد على تجربة راسخة هي نشاط التنظيم البروتين يرتبط بها من هيكل الخلية (قوس) 5،6. نسخ من قوس هو بسرعة والتي يسببها النشاط المكثف للغاية من قبل الخلايا العصبية 3، والبروتين الناتج ينظم الإلتقام مستقبلات الغلوتامات من وطويلة الأجل اللدونة متشابك 7. وقد تم التعبير عن قوس تستخدم على نطاق واسع كعلامة الجزيئية لرسم خريطة الدوائر العصبية المشاركة في سلوكيات معينة 3. في معظم تلك الدراسات، تم الكشف عن قوس التعبير في الموقع التهجين أو المناعية في المخ أقسام ثابتة. على الرغم من كشف هذه الأساليب التي تم ترجمة تعبير عن قوس إلى مجموعة فرعية من الخلايا العصبية مثير بعد تجربة السلوكية، وكيف تم التحقيق في أنماط لا الخلوية التعبير القوس قد تتغير مع نوبات متعددة من التجارب المتكررة أو مميزة خلال الأيام.
ntent "> في الجسم الحي ثنائي الفوتون المجهري يوفر وسيلة قوية لدراسة تجربة تعتمد على التغيرات الخلوية في الدماغ المعيشة 8،9. لتمكين الفحص التعبير قوس في الخلايا العصبية الحية من قبل اثنين من الفوتون المجهري، ونحن ولدت في السابق للخبط في خط الماوس التي يتم وضعها مراسل GFP تحت سيطرة المروج قوس الذاتية 10. هذا البروتوكول يصف الاستعدادات والإجراءات الجراحية التصوير لتتبع التجربة التي تعتمد على أنماط التعبير GFP في قوس الفرق العصبية في الحيوانات الحية. في هذه الطريقة ، تم زرع Windows أولا الجمجمة المزمنة في قوس GFP الفئران فوق المناطق القشرية في المصالح. تم تصويرها ثم تلك الحيوانات مرارا وتكرارا من قبل اثنين من الفوتون المجهري بعد نماذج السلوك المطلوب على مدى عدة أيام، وهذا الأسلوب قد تكون قابلة للتطبيق عموما للحيوانات تحمل للصحفيين الفلورسنت الأخرى من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية 4.Protocol
تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل المعهد الوطني للصحة النفسية ورعاية الحيوان اللجنة استخدم وكانت وفقا للمعاهد القومية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. قبل العملية إعداد
- تنظيف جميع الأدوات في التعقيم حبة الساخنة قبل الجراحة العقيم، وتنظيف موقع الجراحة مع الايثانول 70٪، وانخفاض اخماد الملابس النظيفة. ارتداء قفازات معقمة. تخدير الحيوان مع الطازجة حل AVERTIN 1.2٪، عند 0.02 مل تعطى / ز، intraperitonially. بدلا من ذلك، تخدير بالغاز isoflurane من خلال مخروط الأنف، و 5٪ للتجنيد، 1.5٪ للصيانة، مع دائرة زبال السلبي. تحقق من مستوى التخدير باستخدام الذيل أو إصبع القدم القرصات لضمان تخدير كامل.
- تغطية عيون الحيوان مع مرهم معقم للعين، وحقن ديكساميثازون الطازجة (0.2 ملغ / كلغ) وكاربروفين (5 ملغ / كلغ) subcutaneouslY لمنع التورم والالتهاب في الدماغ 11. حلق شعر أكثر من الجمجمة بين الأذنين، وتعقيم الجلد مع فرك betadine وثلاثة مسحات بالتناوب من الايثانول 70٪.
- تحميل الحيوان في مرحلة جراحة التجسيمي مع earbars، مع التدفئة وسادة تحت الماء تداول مجموعة الحيوانات في 37 ° C. تحقق بانتظام مستويات التخدير الحيوان، واستكمال جرعة مخدر الأصلي حسب الحاجة.
- تضخ 200 ميكرولتر من 0.5٪ Marcaine تحت الجلد فروة الرأس لتخدير المنطقة. شق الجلد وإزالة الجلد فوق رفرف الجمجمة. إزالة السمحاق وتجفيف المنطقة مع قطعة قطن نظيفة.
2. جراحة الجمجمة نافذة المزمنة
- استخدام الحفر عالية السرعة الأسنان مع لدغ 0.5 مم لتوضيح بلطف 3-5 مم دائرة حول منطقة الدماغ من الفائدة. الرطب بشكل دوري في موقع الحفر مع 0.9٪ العقيمة المالحة الغبار العظام واضحة بعيدا مع قطعة قطن نظيفة. إذا كان ينزف العظام، استخدم زelfoam presoaked مع ملحي معقم لطخة على تنزف وانتظر حتى يتوقف.
- عند الوصول إلى طبقة العظام الماضي، رفع وإزالة العظام الجزيرة مع غرامة ذات الرؤوس ملقط. قد يكون واجه مرفقات الجافية إلى الرف السفلي من العظام إذا كان إطار يعبر خياطة العظام. يجب إزالة هذه بلطف ورفع رفرف العظام.
- مبلل بلطف لفة هلام الرغوة على الجافية يتعرض لتنظيف سطحها وانتظار أي نزيف الجافية لوقف خطوة حاسمة: لا تقم بالمتابعة حتى جميع النزيف قد توقف الجافية. الدم الذي يصبح محاصرين داخل إطار الجمجمة عادة ما يؤدي إلى نافذة معتمة.
- إذا كانت المنطقة قد تهم تحت موقع حيث الجافية سميكا خاصة، وإزالة دورا أعلاه يكون من الضروري. إذا كانت هذه هي الحالة، فصل بلطف الجافية من الحنون أدناه مع ملقط دقيق جدا، وجعل شق صغير في بلدة دورا رفع مع زوج آخر من ملقط غرامة، فهم ثم حواف قطع وبلطفتقسيم الجافية. ولكن الجافية رقيقة قوية، لذا يجب الحرص على عدم شريحة الدماغ مع حواف سليمة من دورا.
- شطف المنطقة مع ACSF معقمة أو ملحي معقم.
- إرساء ساترة زجاجية معقمة (3-5 ملم) على الجافية أو PIA خطوة حاسمة: إذا منحنيات الجمجمة المحيطة بشكل كبير، استخدم Kwiksil 12 لاصقة لملء الفراغات في دورا حيث الحنون أو لن تجعل اتصال وثيق مع ساترة في المناطق لن يمكن تصوير ذلك.
- استخدام هلام CYANOACRYLATE لتغطية اصقة المطاط الصناعي وحواف ساترة الزجاج. تغطية الجمجمة بأكملها تتعرض مع هلام CYANOACRYLATE، أو خليط الإسمنت والأسنان krazyglue خطوة حاسمة: عدم السماح لأي هلام CYANOACRYLATE لتلمس سطح الدماغ.
- تضمين رأس معدنية مصنوعة خصيصا شريط التثبيت في الطرف المقابل من الجمجمة.
- العودة الحيوان إلى غرفة الإنعاش الدافئة، بعد حقنة intraperitonial من كيتوبروفين، 5 مغ / كغ، FOص إدارة الألم. مواصلة مسكن ليومين آخرين بعد العملية.
- بعد أسبوعين من الانتعاش بعد الجراحة، تخدير الحيوان مع isoflurane (5٪ للتحريض، 1.5٪ للصيانة)، تركيبها في مرحلة المجهر حسب الطلب مع إطار وجها لتثبيت، والتحقق من النافذة الجمجمة من أجل الوضوح البصري تحت الإضاءة مع اللون الأزرق الفاتح. الأوعية الدموية في الدماغ وضوح السطح يدل عالية الجودة من النافذة في الجمجمة. إذا تم تعريف بشكل حاد الحواف الأوعية الدموية، الإطار من المرجح أن يكون صالحة للاستعمال. وأوصت لمدة أسبوعين وقت الشفاء بعد الجراحة لإتاحة الوقت الكافي للحيوان للتعافي من عملية جراحية. نوافذ الجمجمة عادة مسح وتحسين وخلال هذا الوقت، وتبقى شفافة بصريا لأسابيع إضافية لأشهر حتى إعادة نمو الجمجمة أو سماكة في دورا يحط جودة الإطار.
3. بروتوكول السلوكية والليزر المسح الضوئي ثنائي الفوتون المجهري
- ج الحيوانات مع واضحةسوف يتعرض لنوافذ ranial حافزا البيئية أو التعرض للدورة تدريبية السلوكية، وبعد ذلك التقط ثم في وقت التعبير GFP قوس القصوى. قبل البدء في بروتوكول السلوكية، يجب أن تبقى الحيوانات في قفص بيئة منزلية متسقة للحد من يوم إلى يوم التباين في مستويات خط الأساس التعبير قوس GFP.
- بدء التدريب السلوكي أو نماذج التحفيز البيئي، اعتمادا على منطقة في الدماغ من الفائدة. على سبيل المثال، يمكن أن يتعرض لبيئات الحيوانات البصرية المختلفة على مدى أيام متتالية، وتصوير كل يوم بعد التحفيز التحفيز البصري لتحديد استجابات محددة في القشرة البصرية 10.
- قوس GFP مضان عادة في الخلايا العصبية تصل إلى أعلى مستوياته بعد ساعتين التحفيز. قد يكون الأمثل الجدول الزمني التجريبية لتسهيل الكشف عن قوس GFP التعبير في الخلايا العصبية عند مستوياتها مضان الذروة.
- بعد جلسة التدريب السلوكي أو environmentaاكتمال التحفيز لتر، تخدير الحيوان مع isoflurane (5٪ للتحريض، 1.5٪ للصيانة) وجبل الحيوان في المرحلة المجهر حسب الطلب مع وجها لتثبيت الإطار تحت المجهر ثنائي الفوتون.
- يتم إصلاح الموقف الحيوان التوجه إلى الإطار وجها لتثبيت أن يربط مباشرة إلى مرحلة، وذلك باستخدام قضيب معدني مزروع في الجمجمة. يتم تزويد مستمر Isoflurane والأكسجين إلى الماوس من خلال مخروط الأنف. يتم الاحتفاظ درجة حرارة الجسم باستخدام وسادة التدفئة.
- ضمان حماية أجهزة كشف المجهر من الإضاءة المحيطة عن طريق إجراء مسح ثنائي الفوتون الليزر في غرفة مظلمة. استخدام الغمر بالماء 20X 25X أو (1.05 الفتحة العددية) عدسة للتصوير. أولا، في إطار البرنامج الموسع للتمنيع، مضان الإضاءة، والحصول على صورة من أنماط سطح الأوعية الدموية في الدماغ على المنطقة في المصالح مع كاميرا CCD لمحاذاة الصورة في المستقبل.
- بدء ثنائي الفوتون مسح بالليزر للحصول على كومة صورة 3-D. وأوليمبوس FV1000يستخدم MPE متعدد الفوتون المجهر في الإعداد لدينا. تم تعيين الإثارة موجة ذات طول ليزر ثنائي الفوتون في نانومتر 920، وتعيين قوة الليزر المنبعثة من الهدف في ما يقرب من 50 ميغاواط. تم الكشف في وقت واحد مضان المنبعثة في قنوات الأخضر والأحمر (مرآة مزدوج اللون في 570 نانومتر، والمرشحات حاجز 495-540 نانومتر في و570-625 نانومتر)، وذلك باستخدام خارجي الكشف photomutiplier نظام ثنائي القناة وضعت على مقربة من العينة. قوس GFP مضان يظهر فقط في القناة الخضراء، في حين الأنسجة لصناعة السيارات في مضان يظهر في كل القنوات 13 و 14.
- مداخن الصورة النمطية لها أبعاد حوالي 320x320x100 ميكرومتر (العرض العمق X X الطول)، والدقة الأفقية من 0.5 ميكرون / بكسل، ودقة رأسية من 3 ميكرون / بكسل.
- بعد الحصول على كومة الصورة، والعودة إلى قفص الحيوان وطنه. لا تخل الحيوان حتى السلوكية المقبل والدورة التصوير. تكرار السلوك والإجراءات التصوير عبر يوما ديزيريهأد. استخدام سطح الدماغ المكتسبة سابقا الصورة الدم السفينة لتوجيه مرة أخرى إلى الموقع نفسه التصوير.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
يصف هذا البروتوكول طريقة لتتبع التجربة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية القشرية الفردية في الحيوانات الحية. وإنشاء أول نافذة المزمنة الجمجمة على منطقة القشرية ذات الأهمية في ماوس يحمل مراسل الفلورسنت في التعبير الجيني. ويمكن بعد ذلك اثنين من الفوتون المجهري أن يقترن مع النماذج السلوكية المختلفة لمراقبة التغيرات الجزيئية الناجمة سلوكيا في الخلايا العصبية الفردية وتتبع هذه التغييرات في نفس مجموعات من الخلايا العصبية أكثر من عدة أيام (الشكل 1).
في قوس GFP الفئران، ويمكن تجربة تعتمد على التغيرات في التعبير الجيني قوس تصوير موثوق في الخلايا العصبية القشرية الفردية لأيام متعددة باستخدام هذا البروتوكول. والمعدلة وراثيا قوس GFP المغلوب في الماوس يعبر عن زعزعة استقرار بروتين الفلورية الخضراء (d2EGFP والبروتين نصف العمر حوالي ساعتين) تحت سيطرة المروج الذاتية للقوس الجينات في وقت مبكر فوري (الشكل 2).
ontent "التي حددتها> بروتوكولات سابقة تصف نوافذ الجمجمة المزمنة خطوات حاسمة في إجراء العمليات الجراحية الناجحة النافذة في الجمجمة 11. يتم بمقتضاه إرشادات إضافية في إزالة الجافية إذا لزم الأمر، مما يزيد من احتمال الحصول على Windows البصرية واضحة عندما تقع مثل هذه النوافذ على الغرز الجمجمة (انظر الخطوة 2.4).بعد التعافي من جراحة الجمجمة نافذة، هي التي شنت الحيوانات في إطار تثبيت الرأس حسب الطلب والمرحلة. الشكل 3 يصور headbar وجها لتثبيت الإطار المستخدمة أثناء التصوير ثنائي الفوتون. ويتفق الحفاظ على التصوير المجهر ثنائي الفوتون موقف المرحلة والإعداد تسهيل يوما بعد يوم إعادة ترتيب الصور عند العودة إلى منطقة الدماغ المصورة سابقا، وزيادة كفاءة عندما يتم تصوير تجريبية متعددة الحيوانات في نفس اليوم (الشكل 4).
أثناء التدريب السلوكية أو التحفيز البيئي، فإنه من المستحسنللحيوانات المنزل منفردة، وفي الموقع الصفحة الرئيسية قفص متسقة للبيئة، للحد من يوم إلى يوم التقلبات في مستويات الخلفية تفعيل قوس GFP (الشكل 1).
لافتة تنتقد نافذة مستقرة، الجمجمة واضحة هو نمط هش من الأوعية الدموية تحت برنامج التحصين الموسع-الفلورسنت الإضاءة. يجب أن هذا النمط لا تغيير الأوعية الدموية بشكل كبير عبر أيام متعددة من التصوير (الشكل 5).
الشكل 6 يوضح أنماط التعبير عن GFP قوس في الخلايا العصبية القشرية الأمامية تحت قفص حالة خط الأساس الرئيسية (A) وبعد أداء السلوك الحركي الجديد (B). يمكن طبقة II / III الخلايا العصبية القشرية في المنطقة الدماغ نفسه في نفس الحيوان تصوير موثوق بها، والخلايا العصبية نفسها أن تكون قادرة على تحديد مدى عدة أيام من التصوير. انه يعتبر نموذجا لجمع كومة صورة 3-D إلى مئات من الخلايا العصبية عينة. يجب أن تكون حواف حادة والخلايا العصبية واضحة في جميع أنحاء صورةتك. لصناعة السيارات في مضان الأنسجة في القناة الحمراء كما يوفر مؤشر وضوح الإطار. إذا كانت المنطقة المصورة يصبح أكثر قتامة بشكل كبير خلال الأيام، وتدهورت نوعية المرجح النافذة في الجمجمة. وهناك نافذة نموذجية الجمجمة تظل واضحة بصريا لمدة أسبوع على الأقل. بعد عدة أسابيع إلى أشهر، فإن إعادة نمو الجمجمة من حواف الإطار الجمجمة وسماكة في نهاية المطاف دورا منع التصوير التجارب أخرى.
الشكل 1. مخطط يحدد الخطوات التجريبية. خلال مرحلة التحضير الحيوانية، يتم تنفيذ عملية جراحية في الجمجمة نافذة على قوس GFP الفئران. يتم إعطاء الحيوانات نحو أسبوعين للتعافي من عملية جراحية في القفص وطنهم. ثم يتم فحص وضوح نوافذ الجمجمة باستخدام برنامج التحصين الموسع، مضان المجهري. إذا كانت النوافذ على استعداد للتصوير، ويضم منفردة الحيوانات في متناسقة هادئة للبيئة،الصفحة الرئيسية بيئة قفص، من حيث يمكن أن المرحلة التجريبية تبدأ الفترة الزمنية. قد تكون مصممة بروتوكول التحفيز السلوكية والفاصل الزمني التصوير للكشف عن قوس GFP مضان في ذروتها، والذي يحدث عادة بعد ساعتين من التنشيط. بعد اكتمال التحفيز السلوكية، والحيوان للتخدير وتصوير المنطقة القشرية من الفائدة من خلال النافذة الجمجمة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. ثم يتم إرجاع الحيوان إلى قفص المنزل. ويمكن تكرار الجلسات السلوكية والتصوير عبر الأيام على النحو المرغوب فيه.
الشكل 2. رسم بياني يوضح بناء GFP قوس تدق في خط الماوس، والذي ترميز الجين ببروتين يضيء بضوء أخضر زعزعة استقرار استبدال جزء من قوس الترميز الجينات في وقت مبكر فوري. في هذه السلالة من الماوس، GFP التعبير تحت سيطرة المروج قوس الذاتية. هذا المخطط هو رسم على أساسالوصف في مرجع 10.
الشكل 3. تخطيطي وأبعاد الإعداد وجها لتثبيت المستخدمة لثنائي الفوتون التصوير. يتم لصقها النصف صلبة من headbar إلى الجزء الخلفي من الجمجمة (القسم 2.8)، ويستخدم مع نهاية ثقب البرغي لإرفاق رأس الحيوان لتخدير الإطار. الإطار جها لتثبيت يتكون من لوحة معدنية رقيقة المركبة فوق قطبين مع مسامير.
الشكل 4. مثال على المسح الضوئي ليزر ثنائي الفوتون الإعداد للتصوير المجهر الفئران قوس GFP. لاحظ الغمر بالماء 25X عدسة، وسادة التدفئة والعرف مرحلة المجهر مع إطار وجها لتثبيت. وتخدير قوس GFP الماوس المبين هنا هو على استعداد لفي الجسم الحي التصوير.
الشكل 5. صور سفن الدم في الدماغ في نافذة سطح الجمجمة المزمن على مدى الأيام متعددة، والتي تبين وضوح واستقرار أنماط الأوعية الدموية مع مرور الوقت. كانت مضاءة سطح الدماغ مع الضوء الأزرق، وأخذت الصور من خلال عدسة المياه الغمر 25X كاميرا CCD بواسطة شنت على المجهر.
الشكل 6. في الجسم الحي ثنائي الفوتون الصور من أنماط التعبير قوس GFP في الخلايا العصبية القشرية الأمامية للماوس بعد التجربتين السلوكية المختلفة. (A) وبقي علي الفار في قفص وطنه قبل التصوير في اليوم الأول. (B) يقوم الماوس سلوك محرك جديد قبل التصوير في اليوم الثاني. تم الحصول عليها في وقت واحد صور الفلورسنت من المنطقة القشرية نفسه في قنوات الأخضر والأحمر. GFP مضان لم تظهر الا في قناة خضراء، في حين تألق ذاتي الأنسجة ظهرت في كل القنوات. Detectioتم تعيين المعلمات بحيث لا يوجد لصناعة السيارات في مضان الأنسجة المستويات في كل من القنوات الأحمر والأخضر كان قراءات متساوية، وكان مسك هذه المعايير في جميع أنحاء التجارب. تم طرح ثم إشارة القناة الحمراء من إشارة قناة خضراء واسعة النطاق لإزالة الأنسجة تألق ذاتي خلال خارج خط التحليل. وكان من المتوقع أن تنتج إشارات الفلورية الخضراء من 18 ميكرومتر سميكة 3 D-صورة كومة من شدة الحد الأقصى لمستوى أفقي، لتقديم وجهة نظر من أعلى إلى أسفل من أنماط الخلوية من قوس GFP التعبير. مقياس بار، و 30 ميكرومتر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وطريقة التصوير في الجسم الحي وصفها هنا يمكن فحص المتكرر للقوس التغييرات التعبير الجيني في الخلايا العصبية مجموعات نفس خلال الأيام متعددة في الحيوانات الحية. انها وسيلة فعالة ومرنة للحصول على معلومات حول الديناميات اللدونة العصبية الجزيئية ذات الصلة في الخلايا العصبية الفردية ردا على التجارب السلوكية المختلفة. يمكن الأساليب القياسية مثل النسيجية في الموقع التهجين وتحقيق المناعية وحيدة الخلية القرار 3، ولكنها تفتقر إلى القدرة على تتبع التغيرات التعبير الجيني في الخلايا العصبية نفسها خلال الأيام متعددة. يمكن طرق التصوير تلألؤ بيولوجي، بالرنين المغناطيسي، أو تعقب التغييرات النووي التعبير الجيني في نفس الحيوان من خلال صحفيين المناسبة 15، ولكنها تفتقر إلى القرار المكانية للتمييز بين مستويات التعبير في الخلايا العصبية الفردية. على هذا النحو، لا يمكن لأساليب أخرى لقياس التغيرات الحالية التعبير الجيني المباراة كل من القرار المكانية والزمانية COVوصف erage طريقة التصوير هنا.
A خطوة حاسمة في هذا الإجراء هو الجراحة النافذة في الجمجمة. يجب أن يتم تنفيذ ذلك مع المزيد من الحيطة لتجنب الصدمات إلى الدماغ أو الدم تحت ترك ساترة الزجاج، والذي يؤدي الالتهاب والحد من وضوح نوافذ الجمجمة. لجراحات الجمجمة جيدا أجريت، سوف تبقى نافذة واضحة لعدة أسابيع حتى سماكة الجافية أو إعادة نمو الجمجمة من حواف النافذة منع التصوير أخرى. يمكن إزالة الجافية إذا لزم الأمر، كما حدث لتجارب التصوير الضوئي المزمنة في الفئران والقرود 16،17، لزيادة وضوح بصرية للنوافذ الجمجمة.
وجود قيود لتقنية المجهر ثنائي الفوتون المستخدمة في هذا البروتوكول هو عمق التصوير. وعمق التصوير القصوى التي يمكن الحصول على صور عالية الجودة تعتمد على وضوح الإطار الجمجمة، والإعداد المجهر، وسطوع fluoresc الأنف والحنجرة للصحفيين. لقوس GFP الفئران، ونحن عادة ما يصل إلى 300 صورة ميكرومتر تحت سطح حنوني. لدراسة التغيرات في التعبير الجيني مناطق الدماغ العميق، يمكن تطبيق مضان microendoscopy للتغلب على قيود عمق في المجهر ثنائي الفوتون التقليدية 18.
عوامل الخلط المحتملة للتغيرات التعبير الجيني في تحديد الأسلوب مع هذا الجسم الحي التصوير تشمل أي آثار باقية من عملية جراحية في الجمجمة أو التخدير التي قد تتداخل مع الأداء السلوكي أو تحريض GFP قوس. من المهم للتحقق من مدى العام للقوس GFP تفعيل ردا على تجارب محددة في الدماغ أقسام ثابتة أولا، ومقارنة هذا إلى أقصى حد لوحظ عن طريق التصوير باستخدام المتكررة في الجسم الحي ثنائي الفوتون المجهري. ويمكن بعد فترة النقاهة بعد العمليات الجراحية والتصوير فترات متكررة تعديلها لتقليل الآثار الجانبية المحتملة للجراحة والتخدير على قوس GFP التنشيط.
_content "> طريقة التصوير وصفها هنا من المحتمل أن تكون قابلة للتطبيق عموما الفئران المعدلة وراثيا تحمل جينات صحفيين الفلورسنت لتجربة التنظيم الأخرى 4. وعلاوة على ذلك، يمكن الجمع بين ذلك مع علامات الفلورسنت التي تسلط الضوء على مورفولوجيا الخلايا العصبية المسماة 8،9، أو مؤشرات التي تعكس الأنشطة الفسيولوجية العصبية في تلك الخلايا العصبية 19 و 20. هذه التطبيقات الأخرى التي قد تقدم وجهة نظر أكثر شمولا من الخبرة التي تعتمد على التغيرات الجزيئية في الخلايا العصبية الفردية، وترتبط هذه التغيرات الجزيئية للتعديلات الهيكلية والوظيفية التي تحدث في الخلايا العصبية العادية أو خلال الخبرات المرضية.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
الكتاب أود أن أشكر L. لمعدات التصوير Belluscio الجراحة، D. كوون المساعدة للتصوير، K. ليو لتحرير الفيديو المساعدة، وماكلويد K. لجميع موسيقى خلفية. KW يعترف بدعم سخي من شعبة NIMH من برامج بحثية ضمن الجدران والجينات، والإدراك وبرنامج الذهان. وأيد هذا العمل من قبل برنامج بحوث NIMH ضمن الجدران (VC، YY، SMKW) وشعبة NIAAA من ضمن الجدران برنامج البحوث السريرية والبيولوجية (VC، RMC، DML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
References
- Leslie, J. H., Nedivi, E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).
- Flavell, S. W., Greenberg, M. E. Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).
- Guzowski, J. F., et al. Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression. Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).
- Barth, A. L. Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).
- Lyford, G. L., et al. a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).
- Link, W., et al. Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).
- Shepherd, J. D., Bear, M. F. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity. Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).
- Fu, M., Zuo, Y.
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Wang, K. H., et al. In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex. Cell. 126 (2), 389-402 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake. Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Eichhoff, G. In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology. neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).
- Chen, L. M., et al. A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey. Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).
- Kleinfeld, D., et al. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Barretto, R. P., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Stosiek, C., et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
