Summary
Cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti nei neuroni sono essenziali per la capacità del cervello di adattarsi in risposta alle sfide comportamentali. Un
Abstract
La capacità del cervello di cambiare in risposta alle esperienze è essenziale per la funzione cerebrale sano, e anomalie in questo processo contribuiscono a una varietà di disturbi cerebrali 1,2. Per meglio comprendere i meccanismi con cui i circuiti cerebrali reagiscono all'esperienza di un animale richiede la capacità di monitorare i cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti in un dato insieme di neuroni, per un periodo di tempo prolungato, nell'animale vivo. Mentre l'esperienza e le relative attività neurale è noto per innescare cambiamenti di espressione genica nei neuroni 1,2, la maggior parte dei metodi per rilevare i cambiamenti e non consentono l'osservazione ripetuta dei neuroni stessi più di più giorni o non hanno una risoluzione sufficiente per osservare i singoli neuroni 3 , 4. Qui, descriviamo un metodo che combina in due fotoni microscopia in vivo con un giornalista geneticamente codificato fluorescente per monitorare l'esperienza-dipendenti cambiamenti di espressione genica nei singoli neuroni corticali sul corso del giorno per giorno l'esperienza.
Uno dei consolidata esperienza-dipendenti geni è regolata attività proteine del citoscheletro associato (Arc) 5,6. La trascrizione d'Arco è rapidamente e altamente indotta da attività neuronale intensificata 3, e il suo prodotto proteico regola l'endocitosi dei recettori del glutammato e lungo termine plasticità sinaptica 7. L'espressione di Arc è stato ampiamente utilizzato come marcatore molecolare per mappare circuiti neuronali coinvolti in comportamenti specifici 3. Nella maggior parte di questi studi, espressione Arc stata rilevata mediante ibridazione in situ o immunoistochimica in sezioni di cervello fisse. Benché questi metodi ha rivelato che l'espressione di Arc è stato localizzato a un sottoinsieme di neuroni eccitatori, dopo l'esperienza del comportamento, come i modelli cellulari di espressione Arc potrebbe cambiare con episodi multipli di esperienze ripetute o distintivo più giorni non è stato studiato.
S copi "> In vivo a due fotoni microscopia offre un modo efficace per esaminare i cambiamenti cellulari esperienza-dipendenti nel cervello vivente 8,9. Per consentire l'esame di espressione Arc nei neuroni vivi da microscopia a due fotoni, abbiamo precedentemente generato un knock- in linea di topi in cui un reporter GFP è posto sotto il controllo del promotore endogeno Arc 10. Questo protocollo descrive le preparazioni chirurgiche e le procedure di imaging per tracciamento esperienza-dipendenti Arc-GFP espressione modelli in formazioni neuronali nel animale vivo. In questo metodo , croniche finestre del cranio sono stati impiantati in Arc-GFP topi sulle regioni corticali di interesse. Tali animali sono stati quindi più volte ripreso da microscopia a due fotoni dopo desiderati paradigmi comportamentali nel corso di diversi giorni. Questo metodo può essere generalmente applicabili agli animali che trasportano altri reporter fluorescenti di cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti 4.Protocol
Le procedure sperimentali descritte di seguito sono state approvate dal National Institute of Mental Cura la salute degli animali e del Comitato uso ed erano in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura ed uso di animali da laboratorio.
1. Preparazione pre-operatoria
- Pulire tutti gli strumenti in autoclave a caldo tallone prima dell'intervento chirurgico asettico, pulire il sito chirurgico con il 70% di etanolo, e mettere giù teli puliti. Indossare guanti sterili. Anestetizzare l'animale con una soluzione preparata 1,2% avertin, dato a 0,02 ml / g, intraperitonially. In alternativa, anestetizzare con gas isoflurano attraverso un cono, 5% per induzione, 1,5% per la manutenzione, con un circuito passivo scavenger. Controllare il livello di anestesia con pizzichi di coda o del piede per garantire la sedazione completa.
- Coprire gli occhi dell'animale con pomata oftalmica sterile, e iniettare desametasone preparata (0,2 mg / kg) e carprofen (5 mg / kg) subcutaneously per prevenire il gonfiore e l'infiammazione cerebrale 11. Radersi i capelli sul cranio tra le orecchie, e sterilizzare la pelle con scrub betadine e tre tamponi alternati di etanolo al 70%.
- Montare l'animale in una fase chirurgica stereotassico con earbars, con un cuscinetto riscaldante circolazione dell'acqua sotto il set animale a 37 ° C. Controllare regolarmente i livelli di anestesia dell'animale, e completare la dose di anestetico originale, se necessario.
- Iniettare 200 ml di 0,5% Marcaine sotto la pelle del cuoio capelluto per intorpidire la zona. Incidere la pelle e rimuovere il lembo cutaneo sul cranio. Rimuovere il periostio e asciugare la zona con tamponi di cotone pulito.
2. Cronica Chirurgia Finestra cranico
- Utilizzare un trapano ad alta velocità dentale con un diametro fresa da 0,5 a delineare delicatamente un cerchio del diametro di 3-5 mm sopra la regione del cervello di interesse. Periodicamente bagnare il sito di perforazione con polvere sterile salina allo 0,9% delle ossa e chiaro via con tamponi di cotone pulito. Se le ossa sanguina, utilizzare gelfoam ammollo con soluzione salina sterile per cancellare al vivo e aspettare che si fermi.
- Quando lo strato ultimo osso è raggiunto, sollevare e rimuovere l'isola osso con punta fine pinze. Dura allegati al ripiano inferiore dell'osso può essere rilevato se la finestra attraversa una sutura ossea. Questi dovrebbero essere delicatamente rimosso come il lembo osseo viene sollevato.
- Rotolo inumidito schiuma gel delicatamente sopra dura esposta per pulire la superficie ed attendere per qualsiasi sanguinamento durale per fermare passaggio critico:. Non procedere fino a quando tutto il sanguinamento si è fermato durale. Sangue che resta intrappolato all'interno della finestra del cranio di solito porta ad una finestra opaca.
- Se la regione di interesse è in una posizione in cui la durata è particolarmente spesso, rimuovendo la dura sopra può essere necessario. Se questo è il caso, separare delicatamente la dura dalla pia sotto con pinze molto fini, una piccola incisione nella sollevato dura con un altro paio di pinze sottili, quindi afferrare i bordi di taglio e delicatamentedividere la dura madre. La dura madre è sottile ma resistente, quindi fate attenzione a non tagliare il cervello con i bordi intatti della dura.
- Sciacquare la zona con ACSF sterile o soluzione fisiologica sterile.
- Posare un vetrino sterile di vetro (3-5 mm) sulla durata o pia passaggio critico:. Se le curve cranio circostanti in modo significativo, utilizzare Kwiksil 12 adesivo per riempire spazi in cui la dura madre e pia non avrebbe stretto contatto con il coprioggetto in regioni che non sarà ripreso.
- Utilizzare gel cianoacrilato a coprire l'adesivo elastomero e bordi del vetrino coprioggetto. Coprire l'intero teschio esposto con cianoacrilato gel, o una miscela di cemento e krazyglue dentale passaggio critico:. Non lasciare che il gel di cianoacrilato a toccare la superficie del cervello.
- Incorporare una misura testa barra metallica di fissaggio dalla parte opposta del cranio.
- Rispedire l'animale verso una camera di recupero calda, dopo un'iniezione intraperitonial di ketoprofene, 5 mg / kg, for gestione del dolore. Continua l'analgesico per altri due giorni dopo l'intervento.
- Dopo due settimane di recupero post-operatorio, anestetizzare l'animale con isoflurano (5% per l'induzione, 1,5% per la manutenzione), montarlo in una misura palco microscopio con una testa di fissaggio telaio, e controllare la finestra del cranio per chiarezza ottica con l'illuminazione con luce blu. Superficie dei vasi sanguigni del cervello chiarezza è altamente indicativo di qualità finestra cranica. Se i bordi dei vasi sanguigni sono nettamente definita, la finestra può essere utilizzabile. Le due settimane di post-operatorio i tempi di recupero si consiglia di disporre del tempo sufficiente per consentire all'animale di riprendersi da un intervento chirurgico. Finestre craniche tipicamente chiaro e migliorare in questo periodo, e restano otticamente trasparente per settimane supplementari per mesi fino a quando la ricrescita del cranio o ispessimento della dura degrada la qualità finestra.
3. Protocollo di comportamento e di scansione laser a due fotoni Microscopia
- Gli animali con chiara cfinestre ranial saranno esposti ad uno stimolo ambientale o sottoposto ad una sessione di formazione comportamentale, e poi successivamente ripreso al momento del massimo Arc-GFP espressione. Prima di iniziare un protocollo comportamentale, l'animale deve essere conservato in un ambiente coerente gabbia di casa per ridurre al minimo giorno per giorno variazione della linea di base Arc-GFP livelli di espressione.
- Iniziare la formazione comportamentale o paradigmi stimolazione ambientale, a seconda della regione del cervello di interesse. Per esempio, gli animali possono essere esposti a diversi ambienti visivi per più giorni consecutivi, e ripreso ogni giorno dopo la stimolazione visiva per identificare stimoli-risposte specifiche nella corteccia visiva 10.
- Arc-GFP fluorescenza nei neuroni in genere raggiunge il suo livello massimo due ore dopo la stimolazione. La timeline sperimentale può essere ottimizzato per facilitare l'individuazione di Arc-GFP espressione nei neuroni al loro livello di picco di fluorescenza.
- Dopo una sessione di formazione comportamentale o environmentastimolazione l è completata, anestetizzare l'animale con isoflurano (5% per l'induzione, 1,5% per la manutenzione) e montare l'animale nella misura palco microscopio con testa di fissaggio telaio sotto il microscopio a due fotoni.
- Posizione della testa dell'animale è fissato alla testa di fissazione cornice che si collega direttamente alla fase, utilizzando la barra di metallo impiantato sul cranio. Isoflurano e ossigeno vengono continuamente fornita al mouse tramite un cono. La temperatura corporea è mantenuta utilizzando una piastra elettrica.
- Assicurarsi che i rivelatori microscopio sono protetti dalla luce ambientale, conducendo a due fotoni di scansione laser in una stanza buia. Utilizzare un 20x o 25x (1,05 apertura numerica) obiettivo a immersione in acqua per l'imaging. Primo, sotto epi-fluorescenza illuminazione, acquisire un'immagine di modelli di superficie del vaso sanguigno oltre la regione del cervello di interesse con una camera CCD per allineamento dell'immagine futuro.
- Inizia a due fotoni di scansione laser per acquisire un 3-D serie di immagini. Una Olympus FV1000MPE multi-fotone microscopio è usato nel nostro setup. La lunghezza d'onda di eccitazione dei due fotoni laser è fissata a 920 nm, e la potenza del laser emesso dall'obiettivo è fissato a circa 50 mW. Fluorescenza emessa viene rilevata contemporaneamente nei canali verde e rosso (specchio dicroico a 570 nm, filtro barriera a 495-540 nm e 570-625 nm), utilizzando un esterno a due canali sistema di rilevazione photomutiplier posizionato vicino al campione. Arc-GFP fluorescenza appare solo nel canale verde, mentre i tessuti auto-fluorescenza appare in entrambi i canali 13, 14.
- Stack di immagini tipiche hanno dimensioni di circa 320x320x100 micron (larghezza x lunghezza x profondità), una risoluzione orizzontale di 0,5 micron / pixel e una risoluzione verticale di 3 micron / pixel.
- Dopo aver acquisito la pila di immagini, rispedire l'animale verso la sua gabbia casa. Non disturbare l'animale fino alla prossima sessione di imaging e comportamentali. Ripetere la procedura di comportamento e di imaging in giorni come auspicabileed. Utilizzare il precedentemente acquisito superficie del cervello immagine dei vasi sanguigni per orientare nuovamente nella posizione di imaging stessa.
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Representative Results
Questo protocollo descrive un metodo per tenere traccia delle modifiche molecolari esperienza-dipendenti nei singoli neuroni corticali di animali vivi. Una finestra cronica craniale viene creato su una regione corticale di interesse in un topo che porta un reporter fluorescente dell'espressione genica. Due-fotone microscopia può essere accoppiato con diversi paradigmi comportamentali da osservare comportamentale indotti cambiamenti molecolari in singoli neuroni e tenere traccia delle modifiche negli stessi gruppi di neuroni più giorni (Figura 1).
In Arc-GFP topi, l'esperienza-dipendenti cambiamenti nell'espressione genica Arc può essere attendibilmente ripreso in singoli neuroni corticali per più giorni che utilizzano questo protocollo. L'Arc-transgenico GFP topo knock-in esprime una destabilizzato proteina fluorescente verde (d2EGFP, proteine emivita di circa due ore), sotto il controllo del promotore endogeno del Arc immediata gene precoce (Figura 2).
ONTENUTO "> protocolli precedenti descrivono croniche finestre del cranio hanno illustrato i passaggi critici di successo nella realizzazione di interventi di chirurgia finestra cranici 11. Questo protocollo fornisce ulteriori indicazioni nel rimuovere la dura madre, se necessario, che aumenta la probabilità di ottenere chiare finestre ottiche quando le finestre si trovano su tali suture craniche (vedere il punto 2.4).Dopo il recupero da un intervento chirurgico finestra cranica, gli animali sono montati in una misura testa-fissaggio cornice e palcoscenico. Figura 3 illustra la headbar e la testa di fissazione telaio usato durante l'imaging a due fotoni. Mantenendo un costante due fotoni di imaging posizione microscopio fase di installazione e faciliterà giorno per giorno riallineamento delle immagini quando ritorno ad una regione del cervello precedentemente imaged, e aumentare l'efficienza sperimentale quando più animali vengono esposte lo stesso giorno (Figura 4).
Durante l'addestramento comportamentale o stimolazione ambientale, è consigliabileper alloggiare gli animali singolarmente, e in una posizione coerente sul piano ambientale gabbia casa, per ridurre al minimo giorno per giorno le fluttuazioni sfondo Arc-GFP livelli di attivazione (Figura 1).
Un segno importante di una stalla, finestra trasparente del cranio è il modello fresco di vasi sanguigni sotto epi-illuminazione fluorescente. Questo modello di vaso sanguigno non dovrebbe cambiare in modo significativo tra più giorni di imaging (Figura 5).
La Figura 6 illustra i pattern di espressione di Arc-GFP in neuroni corticali frontali sotto una condizione basale gabbia casa (A) e dopo l'esecuzione di un nuovo comportamento motorio (B). Layer II / III neuroni corticali nella stessa regione cerebrale nello stesso animale può essere ripreso affidabile, e gli stessi neuroni devono poter essere identificati più giorni di imaging. È tipico per raccogliere un 3-D pila di immagini a centinaia campione di neuroni. Bordi Neuron dovrebbe essere nitida e chiara in tutta s l'immagine deltack. Tissue auto-fluorescenza nel canale rosso fornisce anche un indice di chiarezza finestra. Se la regione con immagine diventa drasticamente più oscuro per più giorni, la qualità finestra cranica è probabilmente deteriorata. Una finestra tipica del cranio rimane otticamente chiaro per almeno una settimana. Dopo diverse settimane o mesi, la ricrescita del cranio dai bordi della finestra cranica e ispessimento della dura finirà impedire ulteriori esperimenti di imaging.
Figura 1. Uno schema che illustra le misure sperimentali. Durante la fase di preparazione degli animali, ambulatori finestra cranici vengono eseguite su Arc-GFP topi. Gli animali sono dati circa due settimane per recuperare da un intervento chirurgico nella loro gabbia casa. La chiarezza del cranica finestre è poi verificata con epi-fluorescenza microscopia. Se le finestre sono pronti per l'imaging, gli animali sono alloggiati singolarmente in una zona tranquilla, coerente sul piano ambientaleambiente gabbia di casa, dove la fase sperimentale Timeline può iniziare. Il protocollo di stimolazione comportamentale e l'intervallo di imaging può essere adattato per rilevare Arc-GFP al suo picco di fluorescenza, che si verifica in genere due ore dopo l'attivazione. Dopo la stimolazione comportamentale è completa, l'animale è anestetizzato e la regione corticale di interesse viene esposta attraverso la finestra cranica usando microscopia a due fotoni. L'animale viene quindi restituito alla gabbia a casa. Le sessioni di comportamento e di imaging può essere ripetuta in giorni come desiderato.
Figura 2. Un diagramma che illustra la costruzione del Arc-GFP knock-in linea di topi, in cui un gene che codifica la proteina fluorescente verde destabilizzato sostituito la parte codificante del gene precoce immediato Arc. In questo ceppo di topo, espressione GFP è sotto il controllo del promotore endogeno Arc. Questo diagramma viene ridisegnato basela descrizione in riferimento 10.
Figura 3. Schema e dimensioni della testa di fissazione installazione utilizzato per due fotoni imaging. Il mezzo solido del headbar è incollato alla parte posteriore del cranio (Sezione 2.8), e l'estremità con il foro viene utilizzato per fissare la testa dell'animale anestetizzato al telaio. La testa di fissazione telaio è costituito da una sottile lastra metallica montato sopra due poli con viti.
Figura 4. Esempio di scansione laser a due fotoni configurazione microscopio per Arc-GFP immagini topi. Si noti la lente 25x immersione in acqua, rilievo di riscaldamento e la fase microscopio personalizzato con un testa-telaio di fissaggio. Il anestetizzato Arc-GFP topo mostrato qui è pronto per l'imaging in vivo.
Figura 5. Immagini di navi di superficie sanguigni del cervello in una finestra cronica cranica più giorni, che mostrano la chiarezza e la stabilità dei modelli di vasi sanguigni nel corso del tempo. Superficie cerebrale è stata illuminata con luce blu, e le immagini sono state prese attraverso una lente 25x immersione in acqua da una telecamera CCD montata sul microscopio.
Figura 6. In vivo a due fotoni immagini di Arc-GFP pattern di espressione in neuroni corticali frontali di un mouse dopo due esperienze diverse comportamentali. (A) Il mouse alloggiato nella gabbia prima di imaging casa il primo giorno. (B) Il mouse eseguito un nuovo comportamento del motore prima di imaging il secondo giorno. Immagini fluorescenti della stessa regione corticale sono stati acquisiti simultaneamente nei canali verde e rosso. Fluorescenza GFP è apparsa soltanto nel canale verde, mentre autofluorescenza dei tessuti è apparso in entrambi i canali. Detection parametri sono stati impostati in modo che il tessuto auto-fluorescenza livelli in entrambi i canali rosso e verde avuto letture uguali, e questi parametri sono mantenuti nell'arco esperimenti. Il segnale di canale rosso è stato poi sottratto dal segnale di canale verde per rimuovere larga banda autofluorescenza tessuto durante analisi off-line. I relativi segnali verdi fluorescenti da 18 micron di spessore 3-D serie di immagini venivano proiettate da intensità massima al piano orizzontale, per fornire una visione top-down dei modelli cellulari di Arc-GFP espressione. Barra della scala, 30 micron.
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Discussion
Il metodo in vivo immagini qui descritto consente l'esame ripetuto di cambiamenti genetici Arc espressione negli stessi gruppi di neuroni più di più giorni in animale vivo. Si tratta di un metodo efficace e versatile per ottenere informazioni sulla dinamica molecolare plasticità neurali legate a singoli neuroni in risposta a varie esperienze comportamentali. Standard metodi istochimici come ibridazione in situ e colorazione può realizzare singola cella di risoluzione 3, ma manca la capacità di tenere traccia delle modifiche di espressione genica nei neuroni stessi più giorni. Metodi di imaging bioluminescenza, risonanza magnetica, o nucleari in grado di monitorare i cambiamenti di espressione genica nello stesso animale con i giornalisti del caso 15, ma non hanno la risoluzione spaziale di distinguere i livelli di espressione di singoli neuroni. In quanto tale, non ha altri metodi esistenti per misurare le variazioni di espressione genica può abbinare sia la risoluzione spaziale e temporale coverage del metodo descritto qui di imaging.
Un passo fondamentale in questa procedura è la chirurgia finestra cranica. Si deve essere eseguita con particolare attenzione per evitare traumi al cervello o di sangue lasciando sotto il vetrino di vetro, che provoca l'infiammazione e ridurre la chiarezza delle finestre craniche. Per ben condotti interventi chirurgici cranici, la finestra rimane chiaro per diverse settimane fino ispessimento della dura o ricrescita del cranio dai bordi della finestra di imaging prevenire ulteriore. La dura può essere rimosso, se necessario, come è stato fatto per croniche esperimenti di imaging ottico in ratti e scimmie 16,17, per aumentare la chiarezza ottica di finestre cranici.
Un limite per i due fotoni tecnica di microscopia utilizzata in questo protocollo è la profondità di imaging. La profondità massima alla quale l'imaging immagini di alta qualità può essere ottenuta dipenderà dalla chiarezza finestra cranica, la configurazione microscopio, e la luminosità della fluoresc ent giornalisti. Per Arc-GFP topi, di solito l'immagine fino a 300 micron sotto la superficie piale. Per esaminare i cambiamenti di espressione genica nelle regioni cerebrali profonde, microendoscopia fluorescenza può essere applicato per superare la limitazione in profondità convenzionale a due fotoni microscopia 18.
I potenziali fattori di confondimento per i cambiamenti di espressione genica effettuate con questo metodo in imaging in vivo includono gli effetti persistenti della chirurgia cranica o anestesia che possono interferire con le prestazioni comportamentali o l'induzione di Arc-GFP. E 'importante controllare che la quantità totale di Arc-GFP attivazione in risposta a esperienze specifiche in sezioni di cervello fisso prima, e confrontare questo per quanto osservato da immagini ripetuti con l'utilizzo in vivo a due fotoni microscopia. Il post-operatorio periodo di recupero e gli intervalli di imaging ripetuti può essere regolato per ridurre al minimo i potenziali effetti collaterali della chirurgia e anestesia su Arc-GFP attivazione.
_content "> Il metodo descritto qui di imaging è probabile che sia generalmente applicabile per topi transgenici portatori reporter fluorescenti per altri geni regolati esperienza 4. Inoltre, esso può essere combinato con marcatori fluorescenti che evidenziano la morfologia dei neuroni etichettati 8,9, o indicatori che riflettono le attività neurofisiologiche in quei neuroni 19, 20. Queste ulteriori applicazioni possono fornire una visione più completa dei cambiamenti molecolari esperienza-dipendenti in singoli neuroni, e si riferiscono queste modifiche molecolari delle modificazioni strutturali e funzionali che avvengono nei neuroni durante il normale o esperienze patologiche.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori desiderano ringraziare L. Belluscio per le apparecchiature per la chirurgia riprese, D. Kwon per le riprese di assistenza, K. Liu per il video editing di assistenza, e K. MacLeod per tutta la musica di sottofondo. KW riconosce il generoso sostegno della Divisione NIMH dei programmi di ricerca intramurale e le Geni, Cognizione e Programma psicosi. Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale NIMH (VC, YY, SMKW) e la Divisione di NIAAA Intramural programma di ricerca clinica e biologica (VC, RMC, DML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
References
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