Summary
Опыт зависит от молекулярных изменений в нейронах имеют важное значение для способности мозга к адаптации в ответ на поведенческие проблемы.
Protocol
Экспериментальные процедуры, описанные ниже, были одобрены Национальным институтом психического здоровья животных и использованию комитета и были в соответствии с Национальными Институтами Здоровья Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Предоперационной подготовки
- Очистите все инструменты в стерилизатор горячий шарик до асептической хирургии, очистить хирургии сайте с 70% этанола, и положить чистую ткань капли. Носите стерильные перчатки. Анестезию животного с свежеприготовленный 1,2% Avertin решение, учитывая при 0,02 мл / г, intraperitonially. Кроме того, обезболить изофлураном газа через носовой конус, 5% для индукции, 1,5% на техническое обслуживание, с пассивной схемой поглотителя. Проверьте анестезии уровне, используя хвост или ноги щепотки для обеспечения полного успокоения.
- Крышка глаза животного стерильной глазной мазью, и придать свежеприготовленный дексаметазона (0,2 мг / кг) и карпрофена (5 мг / кг) subcutaneouslУ предотвратить отек мозга и воспалением 11. Бритье волос на череп между ушами, и стерилизуют кожу скраб бетадин и трех чередующихся мазков из 70% этанола.
- Установите животных в стереотаксической этапе операции с earbars, с отоплением циркуляции воды площадку ниже животного набора при температуре 37 ° C. Регулярно проверяйте анестезии животного уровня, а дополняют оригинальные дозу анестетика по мере необходимости.
- Inject 200 мкл 0,5% маркаина под кожу головы, чтобы обезболить область. Надрезать кожу и удалить кожный лоскут над черепом. Удалить надкостницы и высушить поверхность чистой ватные тампоны.
2. Хронический черепной хирургии Window
- Используйте высокоскоростные бормашины с 0,5 мм заусенцев осторожно наметить 3-5 мм в диаметре круг над мозгом области интереса. Периодически смачивать буровой стерильным 0,9% физиологического раствора и убрать костной ткани с чистой ватные тампоны. Если кость кровоточит, воспользуйтесь гelfoam замачивается стерильным физиологическим раствором, чтобы смыть кровотечение и ждать его остановить.
- Когда последний слой кости достигнуто, поднять и удалить кости остров с острым пинцетом. Dura приложениями к нижней полке кости могут возникнуть, если окно пересекает костного шва. Они должны быть аккуратно удалены костный лоскут поднимается.
- Рулон смоченной гель пена мягко по воздействию оболочки для очистки его поверхности и ждать любых дурального остановить кровотечение важный шаг. Не продолжать, пока все дурального кровотечение остановилось. Кровь, которая оказывается в ловушке внутри черепной окна обычно приводит к непрозрачные окна.
- Если интересующей области находится под местах, где твердой мозговой оболочки, особенно толстого, удаления твердой мозговой оболочки над ним может быть необходимым. Если это так, осторожно отделить твердую мозговую оболочку из мягкой ниже, с очень тонкой щипцы, делают небольшой разрез в поднятом оболочки с другой парой тонких щипцов, затем возьмитесь за кромки и аккуратноразделить оболочки. Длительность тонкий, но сильный, так что будьте осторожны, чтобы не порезать мозга с нетронутыми края оболочки.
- Промыть области стерильной ACSF или стерильным физиологическим раствором.
- Положите стерильной покровное стекло (3-5 мм) над твердой мозговой оболочкой или мягкой важный шаг. Если окружающие кривые черепа значительно, используйте Kwiksil 12 Клей для заполнения пространства, где твердой мозговой оболочки или мягкой не будет иметь тесный контакт с покровным в регионах , которые не будут образа.
- Используйте цианакрилатного гель для покрытия клея эластомера и края стекла покровное. Охватывать весь подвергаются череп с цианакрилатного гель или krazyglue и стоматологические цементные смеси важный шаг. Не допускайте цианакрилатного гель прикоснуться к поверхности мозга.
- Добавить на заказ металл голову фиксации бар на противоположной стороне черепа.
- Вернуть животное в теплую камеру восстановления, после внутрибрюшинное введение кетопрофена, 5 мг / кг, лГ боли. Продолжить обезболивающее еще два дня после операции.
- После двух недель послеоперационного восстановления, анестезию животного изофлураном (5% для индукции, 1,5% на обслуживании), смонтировать его в заказ столика микроскопа с головой фиксации кадра, и проверить черепно окно оптической прозрачности при освещении синим светом. Мозг поверхности кровеносных сосудов ясности весьма показателен черепно качества окна. Если края кровеносных сосудов резко определено, окна, вероятно, будет полезной. Две недели послеоперационного восстановления время рекомендуется обеспечить достаточное количество времени для животного, чтобы оправиться от операции. Черепно окна обычно очистить и улучшить за это время, и остается оптически прозрачным для дополнительных недель до нескольких месяцев до отрастания черепа или утолщение оболочки ухудшает качество окна.
3. Поведенческие протокола и лазерное сканирование Двухфотонные микроскопии
- Животные с четкими сranial окна будут подвергаться воздействию экологических стимулов или подвергнуты поведенческой тренировки, а затем после отображаемого во время максимальной Arc-GFP выражение. Перед началом поведенческий протокол, животное должно быть последовательным окружающей среды клетке дома, чтобы минимизировать изо дня в день изменения в исходных Arc-GFP уровни экспрессии.
- Начало обучения или поведенческой парадигмы экологического стимулирования, в зависимости от области мозга интерес. Например, животные могут подвергаться воздействию различных визуальных сред более дней подряд, и отображаемого каждый день после визуальной стимуляции, чтобы определить стимулы конкретных ответов в зрительной коре 10.
- Arc-флуоресцентного микроскопа в нейроны обычно достигает своего пикового уровня через два часа после стимуляции. Экспериментальные срок может быть оптимизирована для облегчения обнаружения Arc-GFP выражение в нейронах на пике своего уровнях флуоресценции.
- После поведенческой тренировки или environmentaл стимуляции завершена, анестезию животного изофлураном (5% для индукции, 1,5% для технического обслуживания) и установить животных в заказ столика микроскопа с головой фиксации кадра на основании двух-фотонного микроскопа.
- Положение головы животного крепится к голове фиксации кадра, который подключается непосредственно к сцене, с помощью имплантированных металлическим прутом по голове. Isoflurane и кислород непрерывно подается на мышь через носовой конус. Температура тела поддерживается с помощью грелки.
- Убедитесь, что микроскоп Детекторы защищены от окружающего света, проведя два фотона лазерного сканирования в темной комнате. Используйте 20x или 25x (1,05 числовая апертура) объектива погружения в воду для работы с изображениями. Во-первых, под эпи-флуоресценции освещения, получить изображение поверхности кровеносных сосудов моделей на области мозга, интересные с ПЗС-камерой для будущего выравнивания изображения.
- Начало двухфотонного лазерного сканирования на приобретение 3-D изображение стека. Olympus FV1000MPE многофотонной микроскоп используется в нашей установке. Возбуждении длиной волны двухфотонной лазер установлен на уровне 920 нм и мощность лазера испускаются из объективных установлена на уровне 50 мВт. Излучение флуоресценции одновременно обнаружены в зеленый и красный каналы (зеркальные при 570 нм, барьерный фильтр на 495-540 нм и 570-625 нм), используя внешний двухканальный photomutiplier системы обнаружения, расположенные рядом с образцом. Arc-флуоресцентного микроскопа появляется только в зеленом канале, в то время как ткани авто-флуоресценции появляется в обоих каналах 13, 14.
- Типичные стеки изображений имеют размеры около 320x320x100 мкм (ширина х длина х глубина), горизонтальным разрешением 0,5 мкм / пиксель, и вертикальное разрешение 3 мкм / пиксель.
- После получения изображений стека, вернуть животное к его дому клетке. Не беспокоить животное до следующего поведенческого и визуализации сессии. Повторите поведения и образа в принципе через дней желательностииздание Используйте ранее приобретенных поверхности мозга кровеносных сосудов изображение ориентироваться обратно в том же месте изображения.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол описывает метод для отслеживания зависящие от опыта молекулярные изменения в отдельных корковых нейронов в живых животных. Хронические черепно окно создается впервые за кортикальной области интереса в проведении мышью флуоресцентные корреспондент экспрессии генов. Двухфотонной микроскопии может быть связан с различными поведенческими парадигмами соблюдать поведенческие индуцированных молекулярных изменений в отдельные нейроны и отслеживать такие изменения в одинаковые наборы нейронов в течение нескольких дней (рис. 1).
В Arc-GFP мышей, зависящие от опыта изменения в экспрессии генов Arc может быть достоверно отражаться в отдельных нейронов коры за несколько дней с помощью этого протокола. Трансгенные Arc-GFP стук в мышь выражает дестабилизировали зеленого флуоресцентного белка (d2EGFP, белка полураспада около двух часов) под контролем промотора эндогенных непосредственных ранних генов Arc (рис. 2).
ontent "> Прошлое протоколов описания хронического черепно окна наметили важные шаги в проведении успешных операций черепно окна 11. Этот протокол содержит дополнительные указания в удалении твердой мозговой оболочки, если это необходимо, что увеличивает вероятность получения ясной оптического окна, когда такие окна расположены над швов черепа (см. Шаг 2,4).После выхода из черепной хирургии окна, животных установлены в заказных голову фиксации кадра и сцены. Рисунке 3 приведены headbar и глава фиксации кадра использовались в течение двух-фотонного изображения. Поддержание согласованного двухфотонной микроскопии изображений позицию сцены и установку будет способствовать изо дня в день перестройка изображения при возвращении к ранее отображаемого области мозга и повысить эффективность экспериментальных животных, когда несколько загружаются в тот же день (рис. 4).
Во время подготовки поведенческого или экологического стимулирования, целесообразнов доме животные поодиночке и в экологически последовательной расположение клетке дома, чтобы свести к минимуму изо дня в день колебания в фоновом режиме Arc-GFP уровня активации (рис. 1).
Критическим признаком стабильной, ясно черепно окно четкий рисунок кровеносных сосудов под эпи-флуоресцентного освещения. Эта модель кровеносного сосуда не должна существенно измениться через несколько дней томографии (рис. 5).
Рисунок 6 иллюстрирует паттерны экспрессии Arc-GFP в лобных корковых нейронов клетки базовых домашних условиях (А) и после выполнения нового поведения двигателя (B). Layer II / III корковых нейронов в той же области мозга в то же животное может быть надежно отображаемого, и те же нейроны должны быть в состоянии быть определены в течение нескольких дней визуализации. Это характерно для сбора 3-D изображение стек образца сотен нейронов. Нейрон края должны быть четко и ясно по всему изображению сгалс. Ткань авто-флуоресценции в канале красного также индекс окна ясности. Если отображаемой области становится мрачнее резко в течение нескольких дней, черепно качества окна, скорее всего, ухудшилось. Типичный черепно окно останется оптически прозрачным в течение по крайней мере недели. После нескольких недель до нескольких месяцев, подгон черепа от краев черепных окна и утолщение оболочки, в конечном счете предотвратить дальнейшие эксперименты изображений.
Рисунок 1. Схемы с изложением экспериментальных шагов. На этапе подготовки животных, черепа операции окне выполняется на Arc-GFP мышей. Животных даны около двух недель, чтобы оправиться от операции в их доме клетке. Ясность черепно окна, затем проверены с помощью эпи-флуоресцентной микроскопии. Если окна готовы для работы с изображениями, животные поодиночке расположен в тихом, экологически последовательнойГлавная клетку среде, откуда экспериментальной фазе Timeline может начаться. Поведенческий протокол стимуляции и изображений интервал может быть адаптирована для обнаружения Arc-GFP на пике флуоресценции, что обычно происходит через два часа после активации. После стимуляции поведенческих завершена, животное находится под наркозом и корковых область интереса изображается через черепную окна с помощью двух-фотонного микроскопа. Животное затем вернулся в дом клетке. Поведенческих и изображений сессий можно повторить через день по желанию.
Рисунок 2. Диаграмма, иллюстрирующая строительство Arc-GFP нокаут-мышей линии, в которых ген, кодирующий дестабилизировали зеленый флуоресцентный белок заменен кодирующей части непосредственного рано Arc ген. В этот штамм мышей, GFP выражение находится под контролем эндогенного промотора Arc. Эта диаграмма перерисовывается на основеописание в ссылке 10.
Рисунок 3. Схема и размеры головы фиксации настройки используются для двух-фотонного изображения. Сплошная половине headbar приклеена к задней части черепа (раздел 2.8), а в конце с отверстием под винт используется для прикрепления головы под наркозом животного к раме. Глава фиксации кадра состоит из тонкой металлической пластины установленный на вершине двух полюсов с помощью винтов.
Рисунок 4. Пример лазерной сканирующей двухфотонной микроскопии установки для Arc-GFP изображений мышей. Обратите внимание на 25x объектив погружением в воду, грелки и пользовательские столик микроскопа с головой фиксации кадра. Наркозом Arc-GFP мыши, показанный здесь, готовы к визуализации в естественных условиях.
Рисунок 5. Изображения поверхности мозга кровеносных сосудов в хроническую черепно окна в течение нескольких дней, с указанием ясность и стабильность модели кровеносных сосудов с течением времени. Мозг поверхность была освещена синим светом, и снимки были сделаны через 25x объектив погружением в воду на ПЗС-камеры, установленной на микроскоп.
Рисунок 6. В естественных условиях двухфотонного изображения Arc-GFP паттерны экспрессии в лобных корковых нейронов мыши после двух различных поведенческих опытом. (A) мышь осталась в своем доме клетке перед изображениями в первый день. (B) Мышь выполнена новое поведение двигателя перед изображениями на второй день. Флуоресцентные изображения одного и того же области коры были одновременно приобретенных в зеленый и красный каналы. Флуоресценции GFP появилась только в зеленом канале, в то время как ткани автофлуоресценции появился в обоих каналах. Detectioп параметры были установлены таким образом, чтобы ткань авто-флуоресценции уровней в красный и зеленый каналы имеют равные показания, и эти параметры были сохранены протяжении эксперимента. Красный сигнал канала был затем вычитается из зеленый сигнал канала для удаления широкополосного ткани автофлуоресценции во время обработки и анализа. В результате зеленые флуоресцентные сигналы от 18 мкм 3-D изображение стека были спроектированы по максимальной интенсивности к горизонтальной плоскости, чтобы обеспечить вид сверху вниз клеточных моделей Arc-GFP выражение. Шкала бар, 30 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В методе естественных изображений описанный здесь позволяет повторную экспертизу д'Арк изменения экспрессии генов в той же набор нейронов в течение нескольких дней в живых животных. Это эффективный и универсальный метод получения информации о нейронной пластичности связанных молекулярной динамики в отдельных нейронов в ответ на различные поведенческие опытом. Стандартный гистохимические методы, такие как в гибридизация и иммуноокрашивания может достичь одноклеточных резолюцию 3, но не имеют возможности отслеживать изменения экспрессии генов в нейронах же в течение нескольких дней. Методы биолюминесценции, магнитный резонанс, или ядерной визуализации могут отслеживать изменения экспрессии генов в той же животных через соответствующие журналистам 15, но не имеют пространственное разрешение различать уровни экспрессии в отдельных нейронов. Таким образом, никаких других существующих методов измерения изменения экспрессии генов может соответствовать как пространственное разрешение и временное соуerage формирования изображения методом, описанным здесь.
Важным шагом в этой процедуре черепной хирургии окна. Она должна быть выполнена с особой осторожностью, чтобы избежать травм головного мозга или крови оставив под стекло покровное, который будет вызывать воспаление и уменьшить ясность черепно окна. Для хорошо проводили черепных операций, окно будет оставаться ясным в течение нескольких недель, пока утолщение оболочки или отрастания черепа от краев окна предотвратить дальнейшее изображений. Длительность может быть удалена в случае необходимости, как это было сделано при хронических оптических экспериментов изображений на крысах и обезьянах 16,17, увеличить оптическую прозрачность черепно окна.
Ограничение для двух-фотонного микроскопа техника, используемая в данном протоколе, является глубина визуализации. Максимальная глубина изображения, при котором высокое качество изображения можно получить, будет зависеть от черепно ясности окна, микроскоп настройки и яркость fluoresc ных журналистов. Для Arc-GFP мышей, мы, как правило изображения до 300 мкм ниже поверхности мягкой мозговой оболочки. Для изучения экспрессии генов изменения в глубоких областей мозга, флуоресценция microendoscopy может быть применен для преодоления ограничение по глубине в обычных двух-фотонного микроскопа 18.
Потенциальные вмешивающихся факторов для изменения экспрессии генов определяли с этим в методе визуализации естественных включать любые длительные последствия от черепной хирургии или анестезии, которые могут помешать поведенческой производительности или индукция Arc-GFP. Важно, чтобы проверить общую степень Arc-GFP активацию в ответ на конкретный опыт в основные разделы мозга первым, и сравнить это до такой степени наблюдались повторяющиеся визуализации с использованием в естественных условиях двухфотонной микроскопии. Послеоперационный период восстановления и повторного интервалы изображения может быть отрегулирована чтобы свести к минимуму возможные побочные эффекты хирургического вмешательства и анестезии на Arc-GFP активации.
_content "> визуализации метод, описанный здесь, вероятно, будет вообще применимо к трансгенных мышей, несущих флуоресцентные журналистам на опыт других регулируемых генов 4. Кроме того, она может быть объединена с флуоресцентными маркерами, которые подчеркивают морфологию нейронов помечены 8,9, или показатели , которые отражают нейрофизиологические деятельности в этих нейронов 19, 20. Эти дополнительные приложения могут обеспечить более полное представление о зависящие от опыта молекулярных изменений в отдельные нейроны, и связать эти молекулярные изменения в структурных и функциональных изменений, которые происходят в нейронах при нормальном или патологических переживаний.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Л. Belluscio для хирургии съемках оборудования, Д. Квон для съемок помощи, K. Liu для редактирования видео помощь, и К. Маклеод для всех фоновой музыки. KW признает щедрой поддержке Отдела NIMH очной исследовательских программ и гены, познание и психоз программы. Эта работа была поддержана NIMH Внутренние программы исследований (VC, YY, SMKW) и Отдела NIAAA очной клинической и биологической исследовательской программы (VC, RMC, DML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
References
- Leslie, J. H., Nedivi, E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).
- Flavell, S. W., Greenberg, M. E. Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).
- Guzowski, J. F., et al. Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression. Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).
- Barth, A. L. Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).
- Lyford, G. L., et al. a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).
- Link, W., et al. Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).
- Shepherd, J. D., Bear, M. F. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity. Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).
- Fu, M., Zuo, Y.
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Wang, K. H., et al. In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex. Cell. 126 (2), 389-402 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake. Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Eichhoff, G. In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology. neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).
- Chen, L. M., et al. A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey. Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).
- Kleinfeld, D., et al. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Barretto, R. P., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Stosiek, C., et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
