Summary
Erfaring-avhengige molekylære endringer i nevroner er avgjørende for hjernens evne til å tilpasse seg i respons til atferdsmessige utfordringer. En
Abstract
Hjernens evne til å endre i respons til erfaring er viktig for sunn hjernefunksjon, og abnormaliteter i denne prosessen bidrar til en rekke av hjernen lidelser 1,2. For bedre å forstå de mekanismer som hjernen kretser reagerer på et dyrs opplevelse krever evne til å overvåke erfaring-avhengige molekylære endringer i et gitt sett av nevroner, over en lengre tidsperiode, i levende dyr. Mens erfaring og tilhørende nevral aktivitet er kjent for å utløse genekspresjon endringer i nevroner 1,2, til de fleste av metodene oppdage slike endringer ikke tillater gjentatt observasjon av de samme neuronene over flere dager eller ikke har tilstrekkelig oppløsning til å observere individuelle nevroner 3 , 4. Her beskriver vi en metode som kombinerer in vivo to-foton mikroskopi med en genetisk kodet fluorescerende reporter å spore erfaring-avhengige genuttrykk endringer i enkelte kortikale nevroner over løpet av dag-til-dag opplevelse.
En av de veletablerte erfaring-avhengige gener er aktivitet regulert cytoskeletal assosiert protein (Arc) 5,6. Transkripsjon av Arc er raskt og sterkt indusert av intensivert neuronal aktivitet 3, og protein produktet regulerer endocytose av glutamat reseptorer og langsiktig synaptisk plastisitet 7. Uttrykket av Arc har vært mye brukt som en molekylær markør for å kartlegge nevrale kretser som er involvert i bestemte atferd 3. I de fleste av disse studiene, ble Arc uttrykk oppdaget ved in situ hybridisering eller immunhistokjemi i faste hjernen seksjoner. Selv om disse metodene viste at uttrykket av Arc ble lokalisert til en undergruppe av eksitatoriske nevroner etter atferdsmessige erfaring, hvordan de cellulære mønstre av Arc uttrykk kan forandre seg med flere episoder av gjentatte eller særegne opplevelser over dager ble ikke undersøkt.
ntent "> In vivo to-foton mikroskopi tilbyr en effektiv måte å undersøke erfaring-avhengige celleforandringer i levende hjernen 8,9. For at undersøkelsen av Arc uttrykk i levende neuroner av to-foton mikroskopi, vi tidligere genererte en knock- i mus linje der en GFP reporter er plassert under kontroll av den endogene Arc promoter 10. Denne protokollen beskriver kirurgiske forberedelser og bildebehandling prosedyrer for sporing erfaring-avhengige Arc-GFP uttrykk mønstre i neuronal ensembler i levende dyr. I denne metoden , kroniske kraniale vinduer ble først implantert i Arc-GFP mus over kortikale regioner av interesse. Disse dyrene ble deretter gjentatte ganger avbildes av to-foton mikroskopi etter ønskede atferdsmessige paradigmer i løpet av flere dager. Denne metoden kan være gjelder generelt for dyr som bærer andre fluorescerende journalister erfaring-avhengige molekylære endringer 4.Protocol
De eksperimentelle prosedyrer beskrevet nedenfor ble godkjent av National Institute of Mental Health Animal Care og bruk komité og var i samsvar med National Institutes of Health Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr.
1. Preoperativ forberedelse
- Rengjør verktøy i en varm perle sterilisator før aseptisk kirurgi, rengjøre kirurgi området med 70% etanol, og sette ned Clean Drop kluter. Slitasje sterile hansker. Anesthetize dyret med nylagde 1,2% Avertin løsning, gitt ved 0,02 ml / g, intraperitonially. Alternativt anesthetize med isofluran gass gjennom en nese kjegle, 5% for induksjon, 1,5% for vedlikehold, med en passiv scavenger krets. Sjekk anestesi nivå ved halen eller tå klyper for å sikre full sedasjon.
- Dekker dyrets øyne med steril oftalmisk salve, og injiser tilberedes deksametason (0,2 mg / kg) og karprofen (5 mg / kg) subcutaneously for å hindre hjernen hevelse og betennelse 11. Barbere håret over skallen mellom ørene, og sterilisere huden med Betadine skrubb og tre vekslende vattpinner av 70% etanol.
- Monter dyr i en stereotaksisk kirurgi scene med earbars med vannsirkulasjon varmeputen nedenfor dyret settet ved 37 ° C. Regelmessig sjekke dyrets anestesi nivåer, og kompletterer det opprinnelige bedøvelse dose etter behov.
- Injisere 200 ul på 0,5% marcaine under hodebunnen huden til nummen området. Incise huden og fjerne huden klaff over skallen. Ta av periosteum og tørk området med rene bomullspinner.
2. Kronisk Cranial Window Kirurgi
- Bruk en høyhastighets dental drill med en 0,5 mm Burr å forsiktig skissere en 3-5 mm diameter sirkel over hjernen regionen av interesse. Periodisk våt borestedet med steril 0,9% saltvann og tydelig bort bein støv med ren bomullspinner. Hvis benet blør, bruker gelfoam presoaked med sterilt saltvann for å utslette det utfallende og vent til det å stoppe.
- Når den siste bein laget er nådd, løfte ut og fjerne bein øya med tynn tang. Dura vedlegg til nederste hylle av benet kan oppstå hvis vinduet krysser et bein sutur. Disse bør være forsiktig fjernes beinet klaff løftes.
- Roll fuktet gel skum forsiktig over eksponert dura å rengjøre overflaten og vente på noen dural slutter å blø Kritisk trinn:. Ikke gå videre før alle dural blødningen har stoppet. Blod som blir fanget inne i skallen vinduet fører vanligvis til en ugjennomsiktig vindu.
- Hvis regionen av interesse er under et sted hvor dura er spesielt tykt, fjerne dura ovenfor kan det være nødvendig. Hvis dette er tilfelle, forsiktig skille dura fra pia nedenfor med svært fine tang, lage et lite snitt i den løftet dura med et annet par av fine pinsetter, ta tak skjærekantene og forsiktigsplitte dura. Dura er tynn, men sterk, så vær forsiktig så du ikke skjære hjernen med de intakte kantene av dura.
- Skyll området med sterilt ACSF eller sterilt saltvann.
- Lay et sterilt glass dekkglass (3-5 mm) over dura eller pia Kritisk trinn:. Hvis omkringliggende skull kurvene vesentlig, bruke Kwiksil 12 klebemiddel for å fylle i rom der dura eller pia ikke ville gjøre nær kontakt med dekkglasset i regionene som ikke vil bli avbildet.
- Bruk cyanoakrylater gel å dekke elastomeren limet og kantene av dekkglass. Dekke hele eksponert skallen med cyanoacrylate gel, eller en krazyglue og dental sement blanding Kritisk trinn:. Ikke la noen cyanoakrylat gel å røre hjernen overflaten.
- Legge en skreddersydd metall hode fiksering bar i motsatt ende av skallen.
- Returner dyret til en varm utvinning kammer, etter en intraperitonial injeksjon av ketoprofen, 5 mg / kg, for smerte. Fortsette analgetiske i to dager postoperativt.
- Etter to uker med postoperative, bedøve dyret med isofluran (5% for induksjon, 1,5% for vedlikehold), montere den i en skreddersydd mikroskop scenen med et hode-fiksering ramme, og sjekk cranial vinduet for optisk klarhet under belysning med blått lys. Brain overflate blodkar klarhet er svært indikasjon på kraniale vindu kvalitet. Hvis blodkardelene kantene er skarpt definert, er vinduet sannsynlig å være brukbar. De to-ukers postoperative tid anbefales å sette av tilstrekkelig tid til at dyret gjenopprette fra kirurgi. Kraniale vinduer typisk fjerne og forbedre løpet av denne tiden, og forbli optisk transparent for flere uker til måneder før gjenvekst av skallen eller fortykkelse av dura forringer vinduet kvalitet.
3. Behavioral Protocol og Laser Scanning to-foton mikroskopi
- Dyr med klart cranial vinduer vil bli utsatt for en miljømessig stimulans eller utsatt for et atferdsmessig treningsøkt, og deretter avbildet etterpå ved maksimal Arc-GFP uttrykk. Før du starter et atferdsmessig protokollen, må dyret holdes i en konsekvent hjem bur miljø for å minimere dag-til-dag variasjon i baseline Arc-GFP uttrykk nivåer.
- Begynn atferdstrening eller miljømessige stimulering paradigmer, avhengig hjernen regionen av interesse. For eksempel, kan dyrene bli utsatt for forskjellige visuelle miljøer over påfølgende dager, og avbildes hver dag etter visuell stimulering å identifisere stimulans-spesifikke responser i den visuelle cortex 10.
- Arc-GFP fluorescens i nevroner når typisk toppnivået to timer etter stimulering. Den eksperimentelle tidslinje kan være optimalisert for å lette deteksjon av Arc-GFP uttrykk i nevroner på topp fluorescens nivåer.
- Etter et atferdsmessig treningsøkt eller Miljørettedel stimulering er fullført, bedøve dyret med isofluran (5% for induksjon, 1,5% for vedlikehold) og monter dyret i skreddersydde mikroskop scenen med head-fiksering ramme under to-foton mikroskop.
- Dyrets hode posisjon er festet til hode-fiksering ramme som kan kobles direkte til scenen ved hjelp av implanterte metallstang på skallen. Isofluran og oksygen blir kontinuerlig tilført til musen gjennom en nese kjegle. Kroppstemperatur holdes ved hjelp av en varmepute.
- Forsikre deg om at mikroskop detektorer er beskyttet mot lys fra omgivelsene ved å gjennomføre to-foton laser skanning i et mørkt rom. Bruk en 20x eller 25x (1,05 numerisk apertur) nedsenking i vann linse for bildebehandling. Først, under epi-fluorescens belysning, erverve et bilde av overflaten blodkarene mønstre over hjernen regionen av interesse med et CCD-kamera for fremtidig bildejusteringen.
- Starte to-foton laser skanning å kjøpe en 3-D bilde stabelen. Olympus FV1000OED multi-foton mikroskop brukes i oppsettet vårt. Eksitasjon bølge-lengde av de to-foton laser er satt til 920 nm, og kraften av laseren slippes ut fra målet er satt til ca 50 mW. Avgitt fluorescens er samtidig påvist i grønne og røde kanaler (dichroic speil på 570 nm, barriere filtre på 495-540 nm og 570-625 nm), ved hjelp av en ekstern tokanals photomutiplier deteksjon system plassert nær prøven. Arc-GFP fluorescens vises bare i den grønne kanalen, mens vev auto-fluorescens vises i både 13 kanaler, 14.
- Typisk bilde stabler har dimensjoner på ca 320x320x100 mikrometer (bredde x lengde x dybde), en horisontal oppløsning på 0,5 mikrometer / piksel, og en vertikal oppløsning på 3 mikrometer / pixel.
- Etter å anskaffe bildestakk, sende dyret tilbake til sitt hjem buret. Ikke forstyrr dyr til neste atferdsmessige og bildebehandling økt. Gjenta atferd og bildebehandling prosedyre tvers dager som ønskeliged. Bruk den tidligere fangede hjernen overflate blodkar bilde til orientere tilbake til samme bildebehandling plasseringen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokollen beskriver en metode for å spore erfaring-avhengige molekylære endringer i enkelte kortikale nevroner i levende dyr. En kronisk cranial vindu først opprettes over en kortikal regionen av interesse i en mus som bærer en fluorescerende reporter av genekspresjon. To-foton mikroskopi kan deretter bli kombinert med ulike atferdsmessige paradigmer å observere behaviorally induserte molekylære endringer i individuelle nevroner og spore slike endringer i de samme sett av nevroner over flere dager (figur 1).
I Arc-GFP mus, kan opplevelsen-avhengige endringer i Arc genuttrykk måles pålitelig avbildet i enkelte kortikale nevroner for flere dager med denne protokollen. Den transgene Arc-GFP knock-in mus uttrykker en destabilisert grønt fluorescerende protein (d2EGFP, protein halveringstid ca to timer) under kontroll av den endogene promoter av det umiddelbare tidlige gen Arc (figur 2).
ontent "> Tidligere protokoller som beskriver kronisk kraniale vinduer har skissert kritiske trinn i å gjennomføre vellykkede cranial vindu surgeries 11. Denne protokollen gir ytterligere veiledning i å fjerne dura om nødvendig, noe som øker sannsynligheten for å få klare optiske vinduer når slike vinduer ligger over skull suturer (se trinn 2.4).Etter utvinning fra cranial vindu kirurgi, er dyr montert i en skreddersydd head-fiksering ramme og scene. Figur 3 viser headbar og head-fiksering rammen brukes i løpet av to-foton bildebehandling. Opprettholde en konsistent to-foton mikroskop bildebehandling stadium posisjon og oppsett vil lette dag-til-dag omstillingen av bilder når tilbake til et tidligere avbildet hjerne region, og øke eksperimentell effektiviteten når flere dyr er avbildes på samme dag (figur 4).
Under atferdstrening eller miljømessige stimulering, er det tilrådeligå huse dyr enkeltvis, og på en miljømessig konsekvent hjem buret plassering, for å minimere dag-til-dag svingninger i bakgrunnen Arc-GFP aktivering nivåer (Figur 1).
En kritisk tegn på en stabil, klar kranial vinduet er den skarpe mønster av blodårer under epi-fluorescerende belysning. Dette blodåre mønsteret bør ikke endres vesentlig over flere dager bildebehandling (figur 5).
Figur 6 illustrerer de uttrykk mønstre fra Arc-GFP i frontpartiet kortikale nevroner under en baseline hjem bur tilstand (A) og etter utførelsen av en ny motor atferd (B). Layer II / III kortikale nevroner i samme hjernen regionen i samme dyr kan bli pålitelig avbildes, og de samme neuronene bør kunne bli identifisert over flere dager av avbildning. Det er typisk å samle en 3-D bildestakk å sample hundrevis av nerveceller. Nevron kanter bør være skarpt og klart hele bildet stack. Tissue auto-fluorescens i den røde kanal gir også en indeks for vindu klarhet. Hvis den avbildede regionen blir drastisk murkier over dager, er cranial vinduet kvalitet sannsynlig forverret. En typisk cranial vindu forblir optisk klart i minst en uke. Etter flere uker til måneder, vil gjenvekst av skallen fra kantene av kraniale vinduet og fortykkelse av dura slutt hindre videre bildebehandling eksperimenter.
Figur 1. Et skjema som beskriver de eksperimentelle skritt. Under Animal Forberedelsesfasen er cranial vindu operasjoner utført på Arc-GFP mus. Dyrene får omtrent to uker å komme seg etter operasjonen i sitt hjem buret. Klarheten i cranial vinduene blir så sjekket med epi-fluorescens mikroskopi. Hvis vinduene er klare for bildebehandling, dyrene enkeltvis ligger i en rolig, miljøvennlig konsekventhjem buret miljø, hvorfra den eksperimentelle Timeline fasen kan begynne. Den atferdsmessige stimulering protokollen og bildebehandling intervall kan tilpasses for å oppdage Arc-GFP på topp fluorescens, som typisk oppstår to timer etter aktivering. Etter de atferdsmessige stimulering er fullført, er dyret bedøves og kortikale regionen av interesse avbildes gjennom cranial vinduet ved to-foton mikroskopi. Dyret blir deretter returnert til hjemmet buret. De atferdsmessige og bildebehandling økter kan gjentas over dager som ønskelig.
Figur 2. Et diagram som illustrerer konstruksjonen av Arc-GFP knock-i mus linjen hvor et gen som koder for grønt fluorescerende protein destabilisert erstattet den kodende del av den umiddelbare tidlige gen Arc. I denne stamme av mus, er GFP uttrykk under kontroll av den endogene Arc promotoren. Dette diagrammet tegnes på nytt basert påbeskrivelsen i referanseeksempel 10.
Figur 3. Skjematisk og dimensjoner av hodet-fiksering oppsett brukes for to-foton avbildning. Faststoffet halvdelen av headbar limes til baksiden av skallen (seksjon 2.8), og enden med skruehullet brukes til å feste en bedøvet dyrehode til rammen. Hodet-fiksering Rammen består av en tynn metallplate montert oppå to poler med skruer.
Figur 4. Eksempel på laserskanning to-foton mikroskop oppsett for Arc-GFP mus bildebehandling. Legg merke til 25x nedsenking i vann linse, varmeputen og tilpasset mikroskop scenen med et hode-fiksering ramme. Den bedøvet Arc-GFP mus som vises her er klar for in vivo imaging.
Figur 5. Bilder fra hjernen overflate blodkar i en kronisk kranial vindu over flere dager, som viser klarhet og stabilitet av blodkar mønstre over tid. Brain overflate ble opplyst med blått lys, og bildene ble tatt gjennom en 25x vann nedsenking objektiv med en CCD-kamera montert på mikroskopet.
Figur 6. In vivo to-foton bilder av Arc-GFP uttrykk mønstre i frontpartiet kortikale nevroner av en mus etter to ulike atferdsmessige opplevelser. (A) Musen bodde i sitt hjem buret før bildebehandling på den første dagen. (B) Musen utført en ny motor atferd før bildebehandling på den andre dagen. Fluorescerende bilder av samme kortikale regionen ble samtidig kjøpt i grønne og røde kanaler. GFP fluorescens bare dukket opp i den grønne kanalen, mens vev autofluorescens dukket opp i begge kanaler. Detection parametre ble satt slik at vev auto-fluorescens nivåer i både røde og grønne kanaler hadde like målinger, og disse parametrene ble opprettholdt gjennom eksperimenter. Den røde kanalen signal ble deretter trukket fra den grønne kanalen signal å fjerne bredbånd vev autofluorescens under off-line analyse. De resulterende grønne fluorescerende signaler fra en 18 mikrometer tykke 3-D bildestakk ble anslått av maksimal intensitet til horisontalplanet, å gi en topp-ned-visning av de cellulære mønstre av Arc-GFP uttrykk. Målestokk, 30 mikrometer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo avbildning metoden beskrevet her gjør gjentatt undersøkelse av Arc genuttrykk endringer i de samme sett av nevroner over flere dager i levende dyr. Det er en effektiv og fleksibel metode for å få informasjon om nevrale plastisitet-relaterte molekylære dynamikk i enkelte nerveceller i respons på ulike atferdsmessige erfaringer. Standard histokjemiske metoder som in situ hybridisering og farging kan oppnå encellede oppløsning 3, men mangler evnen til å spore genekspresjon endringer i de samme neuronene over flere dager. Bioluminescens, magnetisk resonans, eller kjernefysiske imaging metoder kan spore genuttrykk endringer i samme dyr gjennom egnede journalister 15, men mangler romlig oppløsning for å skille de uttrykk nivåer i enkelte nerveceller. Som sådan, kan ingen andre eksisterende metoder for å måle genuttrykk endringer matche både romlig oppløsning og det timelige covtil gjennomsnittlig av imaging som beskrives her.
En kritisk trinn i denne prosedyren er den kraniale vinduet kirurgi. Det bør utføres med ekstra forsiktighet for å unngå skade på hjernen eller forlate blod under dekkglass, som vil føre til betennelse og redusere klarhet i kraniale vinduer. For godt utført kraniale operasjoner, vil vinduet forblir klare i flere uker før fortykning av dura eller gjenvekst av skallen fra kantene av vinduet hindre ytterligere avbildning. Dura kan fjernes hvis det er nødvendig, slik det er gjort for kroniske optisk imaging eksperimenter i rotter og aper 16,17, for å øke den optiske klarhet av kraniale vinduer.
En begrensning for de to-foton mikroskopi teknikk som brukes i denne protokollen er tenkelig dybde. Maksimal bildebehandling dybde hvor høy kvalitet kan oppnås, vil avhenge av den kraniale vinduet klarhet mikroskopet oppsett, og lysstyrken for fluoresc skjellige journalister. For Arc-GFP mus, vi vanligvis bildet opp til 300 mikrometer under pial overflaten. For å undersøke genuttrykk endringer i dype områder av hjernen, kan fluorescens microendoscopy brukes til å overvinne dybden begrensning i vanlig to-foton mikroskopi 18.
Potensielle konfunderende faktorer for genuttrykk endringer fastsatt med dette in vivo imaging metoden, inkluderer noen langvarig effekt av kranieoperasjon eller anestesi som kan forstyrre atferdsmessige ytelse eller induksjon av Arc-GFP. Det er viktig å sjekke det totale omfanget av Arc-GFP aktivering svar på konkrete erfaringer i faste hjernen seksjoner første, og sammenligne dette i den grad observert ved gjentatt bildebehandling med in vivo to-foton mikroskopi. Den postoperative perioden og gjentatte bildebehandling intervaller kan justeres for å minimere de potensielle bivirkninger av kirurgi og anestesi om Arc-GFP aktivering.
_content "> Den imaging som beskrives her er trolig å være generelt gjeldende for transgene mus bærer fluorescerende reportere for andre erfaring-gener 4. Videre kan det kombineres med fluorescerende markører som synliggjør morfologi av merket nevroner 8,9, eller indikatorer som gjenspeiler nevrofysiologiske aktiviteter i de 19 nevroner, 20. Disse ytterligere programmer kan gi en mer helhetlig syn på erfaring-avhengige molekylære endringer i enkelte nerveceller, og relatere disse molekylære endringer i strukturelle og funksjonelle endringer som finner sted i nevroner under normal eller patologiske erfaringer.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke L. Belluscio for kirurgi filming utstyr, D. Kwon for filming hjelp, K. Liu for videoredigering hjelp, og K. MacLeod for all bakgrunnsmusikk. KW erkjenner sjenerøs støtte fra NIMH Division of egenutført forskningsprogrammer og Genes, kognisjon og Psykose Program. Dette arbeidet ble støttet av NIMH egenutført Research Program (VC, YY, SMKW) og Niaa Seksjon for egenutført Clinical and Biological Research Program (VC, RMC, DML).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FV1000 multi-photon laser scanning microscope | Olympus | FV1000MPE | Imaging |
| Dissection microscope | Omano | 555V107 | Surgery |
| Stereotaxis surgery stage for mice | Harvard Apparatus | 726335 | Surgery |
| 20X or 25X water immersion objective | Olympus | XLPL25XWMP | Imaging |
| Microscope stage with head-fixation frame | Custom made | N/A | Imaging |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Surgery |
| Dental drill burr | Fine Science Tools | 19007-05 | Surgery |
| CCD camera | QImaging | QICAM 12-bit | Imaging |
References
- Leslie, J. H., Nedivi, E. Activity-regulated genes as mediators of neural circuit plasticity. Progress in neurobiology. 94 (3), 223-237 (2011).
- Flavell, S. W., Greenberg, M. E. Signaling mechanisms linking neuronal activity to gene expression and plasticity of the nervous system. Annual review of neuroscience. 31, 563-590 (2008).
- Guzowski, J. F., et al. Mapping behaviorally relevant neural circuits with immediate-early gene expression. Current opinion in neurobiology. 15 (5), 599-606 (2005).
- Barth, A. L. Visualizing circuits and systems using transgenic reporters of neural activity. Curr. Opin. Neurobiol. 17 (5), 567-5671 (2007).
- Lyford, G. L., et al. a growth factor and activity-regulated gene, encodes a novel cytoskeleton-associated protein that is enriched in neuronal dendrites. Neuron. 14 (2), 433-445 (1995).
- Link, W., et al. Somatodendritic expression of an immediate early gene is regulated by synaptic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92 (12), 5734-5738 (1995).
- Shepherd, J. D., Bear, M. F. New views of Arc, a master regulator of synaptic plasticity. Nature neuroscience. 14 (3), 279-284 (2011).
- Fu, M., Zuo, Y.
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nature. 4 (8), 1128-1144 (2009).
- Wang, K. H., et al. In vivo two-photon imaging reveals a role of arc in enhancing orientation specificity in visual cortex. Cell. 126 (2), 389-402 (2006).
- Mostany, R., Portera-Cailliau, C. A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging. J. Vis. Exp. (12), e680 (2008).
- Dombeck, D. A., et al. Imaging Large-Scale Neural Activity with Cellular Resolution in Awake. Mobile Mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Zipfel, W. R. Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS. 100 (12), 7075-7080 (2003).
- Eichhoff, G. In vivo calcium imaging of the aging and diseased brain. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging. 35, 99-106 (2008).
- Klohs, J., Rudin, M. Unveiling molecular events in the brain by noninvasive imaging. The Neuroscientist: a review journal bringing neurobiology. neurology and psychiatry. 17 (5), 539-559 (2011).
- Chen, L. M., et al. A chamber and artificial dura method for long-term optical imaging in the monkey. Journal of neuroscience. 113 (1), 41-419 (2002).
- Kleinfeld, D., et al. Fluctuations and stimulus-induced changes in blood flow observed in individual capillaries in layers 2 through 4 of rat neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (26), 15741-15746 (1998).
- Barretto, R. P., et al. Time-lapse imaging of disease progression in deep brain areas using fluorescence microendoscopy. Nature medicine. 17 (2), 223-228 (2011).
- Stosiek, C., et al. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100 (12), 7319-7324 (2003).
- Tian, L., et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
