Neuroscience

In vivo שני פוטוני הדמיה של שינויים מולקולריים ניסיון תלוי בנוירונים בקליפת מוח

Published: January 5, 2013 doi: 10.3791/50148

Vania Y. Cao^1,2, Yizhou Ye¹, Surjeet S. Mastwal¹, David M. Lovinger³, Rui M. Costa⁴, Kuan H. Wang¹

¹Unit on Neural Circuits and Adaptive Behaviors, Genes Cognition and Psychosis Program, National Institute of Mental Health, ²Department of Neuroscience, Brown University - National Institutes of Health Graduate Partnership Program, ³Section on Synaptic Pharmacology, Laboratory for Integrative Neuroscience, National Institute on Alcohol Abuse and Alcoholism, ⁴Champalimaud Neuroscience Programme, Champalimaud Center for the Unknown

Summary

שינויים מולקולריים חוויה תלויה בתאי עצב חיוניים ליכולתו של המוח להסתגל בתגובה לאתגרים התנהגותיים.

Abstract

יכולתו של המוח להשתנות בתגובה לניסיון חיונית לתפקוד המוח בריא, והליקויים בתהליך זה תורמים למגוון של הפרעות ^1,2 המוח. כדי להבין טובים יותר את המנגנונים שבאמצעותם מעגלים חשמליים במוח מגיבים לניסיון של בעל חיים דורש את היכולת לעקוב אחר השינויים המולקולריים חוויה התלויה במערך נתון של נוירונים, על פני תקופה ממושכת של זמן, בחי. למרות הניסיון והפעילות עצבית המשויך לו ידוע לגרום לשינויים בביטוי גני נוירונים ^1,2, רוב השיטות כדי לזהות שינויים כאלה אינם מאפשרים התבוננות חוזרת ונשנית של אותם נוירונים מעל ימים מרובים או אין לך רזולוציה מספיקה להתבונן נוירונים בודדים ^{3 , 4.} כאן, אנו מתארים שיטה שמשלבת בvivo מיקרוסקופ שני פוטונים עם כתב ניאון מקודד גנטי כדי לעקוב אחר שינויי ביטוי גני חוויה תלויות בנוירונים בקליפת המוח בודדים מעל במהלך ניסיוני היום יום.

אחד מהגנים ומבוססי ניסיון התלויים הוא חלבון פעילות מוסדרת cytoskeletal המשויך (ארק) ^5,6. התעתיק של Arc הוא במהירות וביותר הנגרם על ידי פעילות עצבית מוגברת ^3, והמוצר שלה החלבון מסדיר אנדוציטוזה של קולטני גלוטמט ופלסטיות ארוכת טווח הסינפטי ^7. הביטוי 'ארק כבר בשימוש נרחב כסמן מולקולרי למיפוי מעגלים עצביים מעורבים בהתנהגויות ספציפיות ^3. במרבית המחקרים אלה, ביטוי ארק זוהה על ידי כלאה באתרו או אימונוהיסטוכימיה בחלקי מוח קבועים. למרות השיטות האלה גילו כי הביטוי 'ארק היה מקומי לקבוצת משנה של הנוירונים מעוררים לאחר ניסיון התנהגותי, איך את הדפוסים הסלולר של ביטוי ארק עשויים להשתנות עם אפיזודות מרובות של חוויות חוזרות או ייחודיות מעל ימים לא נחקר.

ntent "> בחי מיקרוסקופ שני פוטונים מציע דרך רבה עצמה כדי לבחון שינויים תאיים חוויה תלויה במוח החי ^8,9. כדי לאפשר בחינה של ביטוי ארק נוירונים בחיים על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים, יצרו דפיקה בעבר בתור עכבר שבכתב GFP מוצב תחת השליטה של אמרגן ארק אנדוגני ^10. פרוטוקול זה מתאר את הכנות כירורגיות ונהלי הדמיה למעקב אחר דפוסי ביטוי Arc-GFP חוויה תלוי בהרכבים עצביים בחי. בשיטה זו , חלונות גולגולת כרוניים היו מושתלים הראשון בעכברי Arc-GFP מעל אזורי קליפת הריבית. אלה חיות אז צלמו שוב ושוב על ידי מיקרוסקופ שני פוטונים לאחר פרדיגמות התנהגות רצויה במשך כמה ימים. שיטה זו עשויה להיות רלוונטית לכלל בעלי חי נושאים כתבי ניאון אחרים של שינויים מולקולריים ניסיון תלויים ^4.

Protocol

הפרוצדורות המתוארות להלן אושרו על ידי המכון הלאומי לבריאות נפש ובריאות בעלי חי ועדת שימוש והיו בהתאם למכונים הלאומיים לבריאות מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.

1. הכנה לפני הניתוח

נקה את כל הכלים במעקר חרוז חם לפני הניתוח מזוהם, לנקות את אתר הניתוח עם אתנול 70%, והניח את כיסוי בד נקי. ללבוש כפפות סטריליות. הרדם את החיה עם 1.2% פתרון מוכן טרי Avertin, בהתחשב ב0.02 מ"ל / גרם, intraperitonially. לחלופין, להרדים בגז isoflurane דרך חרטום, 5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה, עם מעגל נבלות פסיבית. בדקו את רמת ההרדמה באמצעות צובט זנב או בוהן כדי להבטיח הרגעה מלאה.
כסה את עיניו של בעלי החיים עם משחת עיניים סטרילי, ולהזריק dexamethasone המוכן טרי (0.2 מ"ג / ק"ג) וcarprofen (5 מ"ג / ק"ג) subcutaneously כדי למנוע נפיחות ודלקת מוח ^11. לגלח את השיער מעל הגולגולת בין האוזניים, ולחטא את העור עם שיחי פולידין ושלוש ספוגיות מתחלפות של אתנול 70%.
הר החיה בשלב ניתוח stereotaxic עם earbars, עם כרית חימום זרימת מים מתחת לקבוצת בעלי החיים ב 37 ° C. בדוק באופן סדיר רמות ההרדמה של בעלי החיים, ולהשלים את מינון חומר ההרדמה המקורי כנדרשים.
להזריק 200 μl של Marcaine 0.5% מתחת לעור הקרקפת כדי להרדים את האזור. חתוך העור ולהסיר את דש העור מעל הגולגולת. הסר את קרום העצם ולייבש את האזור עם ספוגיות כותנה נקיות.

2. כירורגיה חלון גולגולת כרונית

השתמש תרגיל שיניים במהירות גבוהה עם 0.5 מ"מ Burr עדינות להתוות עיגול בקוטר מ"מ 3-5 מעל האזור במוח של עניין. מעת לעת להרטיב את הקידוח עם 0.9% אבק מלוח וברור משם עקר עצם עם ספוגיות כותנה נקיות. אם דימומי העצם, השתמש גרמתיelfoam presoaked עם סליין סטרילי כדי לספוג את הדימום ולחכות שזה ייפסק.
כאשר שכבת העצם האחרונה הוא הגיע, להרים ולהסיר את אי העצם עם מלקחיים עדינים בקצוות. קבצים מצורפים דורה למדף התחתון של העצם עשויים להיתקל אם החלון חוצה תפר עצם. אלה יש להסיר בעדינות כדש העצם הרים.
רול טבול קצף ג'ל עדינות מעל הדורה נחשפה לניקוי פני השטח שלו ולחכות לדימום dural לעצור צעד קריטי:. לא להמשיך עד שכל דימום dural הפסיק. דם שהופך לכוד בתוך החלון גולגולתי בדרך כלל מוביל לחלון אטום.
אם האזור של עניין הוא במיקום שבו הדורה היא עבה במיוחד, הסרת הדורה לעיל זה עשוי להיות נחוץ. אם זה מקרה, בעדינות להפריד את הדורה מפיא למטה עם מלקחיים עדינים מאוד, לעשות חתך קטן בדורה הרימה עם עוד זוג מלקחיים עדינים, ואז לתפוס את הקצוות החתוכים ובעדינותלפצל את הדורה. הדורה היא דקה אבל חזקה, אז ייזהר לא לחתוך את המוח עם הקצוות השלמים של הדורה.
שטוף את האזור עם ACSF סטרילית או תמיסת מלח סטרילית.
שכבתי coverslip זכוכית סטרילית (3-5 מ"מ) מעל הדורה או פחז צעד קריטי:. עיקולי הגולגולת מסביב משמעותי אם, השתמש ¹² דבק Kwiksil כדי למלא את החללים שבי הדורה או הפחז לא ליצור קשר קרוב עם coverslip באזורים שלא צלם.
השתמש בג'ל cyanoacrylate לכסות דבק אלסטומר ואת הקצוות של coverslip הזכוכית. כיסוי כל הגולגולת החשופה עם ג'ל cyanoacrylate, או בתערובת מלט וkrazyglue שיני צעד קריטי:. אל תאפשרו לאף ג'ל cyanoacrylate כדי לגעת במשטח המוח.
שבץ בר מחוייט מתכת ראש קיבוע בקצה השני של הגולגולת.
להחזיר את החיה לחדר התאוששות חם, לאחר הזרקת intraperitonial של ketoprofen, 5 מ"ג / ק"ג, חצניהול כאב r. המשך משכך כאבים לעוד ימים שלאחר ניתוח.
אחרי שבועות של החלמה שלאחר הניתוח, להרדים את החיה עם isoflurane (5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה), להרכיב אותה בשלב מיקרוסקופ מחוייט עם מסגרת ראש קיבעון, ובדוק את החלון גולגולתי לבהירות אופטית תחת תאורה עם אור כחול. בהירות כלי דם משטח המוח מעידה מאוד של איכות חלון גולגולתי. אם את קצות כלי הדם מוגדרים בחדות, החלון עשוי להיות שמיש. זמן ההחלמה לאחר הניתוח של השבועות מומלץ לאפשר מספיק זמן לחיה כדי להתאושש מניתוח. חלונות גולגולת בדרך כלל לנקות ולשפר בזמן הזה, ולהישאר שקוף אופטי לשבועות נוספים לחודשים, עד לצמיחה מחודשת של גולגולת או עיבוי של הדורה מדרדרת איכות חלון.

3. פרוטוקול וליזר התנהגות סריקה מיקרוסקופי שני פוטונים

חיות עם ג הברורחלונות ranial יהיו חשופים לגירוי סביבתי או נתון לאימון התנהגותי, ולאחר מכן צלמו לאחר מכן בעת הביטוי מקסימאלי Arc-GFP. לפני תחילת פרוטוקול התנהגותי, בעלי החיים צריכים להיות כל זמן בסביבת כלוב הביתה עקבית למזער וריאציה מהיום ליום ברמות ביטוי Arc-GFP בנקודת ההתחלה.
בגין אימון התנהגותי או פרדיגמות גירוי סביבתיות, בהתאם לאזור במוח של עניין. לדוגמה, בעלי חיים יכולים להיות חשופים לסביבה חזותית שונה על פני ימים רצופים, וצלמו בכל יום לאחר גירוי חזותי כדי לזהות תגובות לגירוי ספציפיים בקליפת המוח הראייתית ^10.
Arc-GFP פלואורסצנטי בנוירונים בדרך כלל יגיע לרמת שיא שעות לאחר גירוי. ציר הזמן הניסיוני עשוי להיות מותאם כדי להקל על זיהוי של ביטוי Arc-GFP בתאי עצב ברמות קרינת השיא שלהם.
לאחר אימון התנהגותי או environmentaגירוי l הושלם, להרדים את החיה עם isoflurane (5% לזירוז, 1.5% לתחזוקה) ולצאת לחיים בשלב מיקרוסקופ מחוייט עם מסגרת ראש קיבעון מתחת למיקרוסקופ שני פוטונים.
תנוחת הראש של החיה קבועה למסגרת ראש הקיבוע שמתחבר ישירות לבמה, תוך שימוש בסרגל המתכת המושתלת בגולגולת. Isoflurane וחמצן מסופקים ברציפות לעכבר בחרטום. טמפרטורת גוף נשמרת באמצעות כרית חימום.
ודא כי גלאי מיקרוסקופ מוגנים מפני אור הסביבה על ידי ביצוע סריקת ליזר שני פוטון בחדר חשוך. השתמש 20x או 25x (1.05 צמצם מספרי) עדשת טבילה במים להדמיה. ראשית, תחת תאורה עלית פלואורסצנטי, לרכוש תמונה של דפוסי כלי הדם על פני השטח מעל האזור במוח עניינים עם מצלמת CCD ליישור תמונת עתיד.
התחל ליזר שני פוטוני סריקה לרכוש מחסנית תמונה 3-D. אולימפוס FV1000מיקרוסקופ רב פוטון MPE משמש בהגדרה שלנו. גל באורך העירור של ליזר שני הפוטונים מוגדר בננומטר 920, ואת כוחו של הליזר המופק ממטרה מוגדר בכ 50 mW. פלואורסצנטי נפלט הוא זוהה במקביל בערוצים ירוקים ואדום (ראי Dichroic ב570 ננומטר, מסנני מכשול ב495-540 ננומטר ו570-625 ננומטר), תוך שימוש במערכת חיצונית שני ערוצי photomutiplier זיהוי הממוקם קרוב לדגימה. Arc-GFP פלואורסצנטי מופיע רק במסלול הירוק, ואילו רקמות האוטומטיות פלואורסצנטי מופיעה בשני ערוצים ^{13, 14.}
ערימות תמונה אופייניות בממדים של כ 320x320x100 מיקרומטר (רוחב x אורך x עומק), ברזולוציה אופקית של 0.5 מיקרומטר / פיקסלים וברזולוציה אנכית של 3 מיקרומטר / פיקסל.
לאחר שרכש את מחסנית התמונה, להחזיר את בעל חיים לכלוב בבית שלה. אל תפריעו לחיים עד התנהגותית הבאים ומפגש הדמיה. חזור על ההתנהגות והליך הדמיה פני ימים כדסירed. השתמש בתמונה רכשה בעבר במוח פני השטח של כלי הדם כדי לכוון חזרה לאותו מיקום הדמיה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מתאר שיטה למעקב אחר שינויים מולקולריים חוויה תלויה בנוירונים בקליפת מוח בודדים בבעלי חיים. חלון גולגולתי כרוני נוצר לראשונה מעל אזור קליפת מוח של עניין בעכבר נושא כתב ניאון של ביטוי גנים. מיקרוסקופ שני פוטונים אז יכול להיות בשילוב עם פרדיגמות התנהגות שונות להתבונן שינויים מולקולריים הנגרמים התנהגותית בנוירונים בודדים ולעקוב אחר שינויים כאלה באותם סטים של תאי עצב מעל ימים מרובים (איור 1).

בעכברי Arc-GFP, שינויי חוויה תלויה בביטוי גני ארק ניתן הדמיה אמינה בנוירונים בקליפת מוח נפרדים עבור ימים מרובים באמצעות פרוטוקול זה. הדפיקה במהונדסת-Arc-GFP עכבר מבטאת חלבון פלואורסצנטי ירוק מעורער (d2EGFP, חלבון מחצית חיים כשעות) תחת השליטה של האמרגן אנדוגני של ארק הגן מוקדם המיידי (איור 2).

ontent "> פרוטוקולים קודמים המתארים חלונות גולגולת כרוניים התוו שלבים קריטיים בביצוע ניתוחי window גולגולת מוצלחת ^11. פרוטוקול זה מספק הנחיות נוספות בהסרת הדורה במידת צורך, מה שמגביר את הסיכוי להשגת חלונות אופטיים ברורים כאשר חלונות כאלה נמצאים מעל תפרי גולגולת (ראה שלב 2.4).

לאחר התאוששות מניתוח חלון גולגולתי, בעלי חיים הם רכובים במסגרת מחוייט ראש קיבעון ובמה. איור 3 מתאר headbar ומסגרת ראש קיבעון שימוש במהלך הדמית שני פוטונים. שמירה על עמדתו עקבית שני פוטוני מיקרוסקופ הדמית במה והתקנה תאפשר התכנסות מהיום ליום של תמונות כאשר חוזר לאזור במוח בעבר צלם, ולהגביר את היעילות ניסיונית כאשר חיות מרובות הם צלמו באותו היום (איור 4).

במהלך אימון התנהגותי או גירוי סביבתי, רצוילבית חיות ביחידות, ובמיקום כלוב הביתה לסביבה עקבית, כדי למזער את התנודות מיום ליום ברמות הפעלת Arc-GFP רקע (איור 1).

סימן קריטי של חלון יציב, ברור גולגולתי הוא הדפוס הפריך של כלי דם תחת תאורת הניאון עלית. דפוס כלי דם זה לא צריך לשנות באופן משמעותי על פני ימים רבים של הדמיה (איור 5).

איור 6 מדגים את דפוסי הביטוי של Arc-GFP בנוירונים בקליפת מוח קדמיים תחת תנאי כלוב הביתה בסיסי () ואחרי ההופעה של התנהגות מנוע חדשה (ב '). שכבת נוירונים בקליפת מוח II / III באותו האזור במוח באותה החיה ניתן הדמיה באופן מהימן, ואת אותם נוירונים צריכים להיות מסוגלים לזהות את הימים מרובים של הדמיה. זה אופייני לאיסוף ערימת תמונה 3-D למאה דוגמאות של נוירונים. קצוות הנוירונים צריכים להיות חדים וברורים בכל תמונה שלטקטיקה. רקמה האוטומטית פלואורסצנטי במסלול האדום גם מספקת מדד של בהירות חלון. אם אזור ההדמיה הופך עכור בצורה דרסטית על פני ימים, איכות החלון גולגולתי הוא התדרדר סביר. חלון גולגולתי טיפוסי יישאר ברור אופטי לפחות בשבוע. לאחר מספר שבועות עד חודשים, לצמיחה המחודשת של גולגולת מקצות החלון ועיבוי הגולגולת של דורת סופו של דבר למנוע ניסויי הדמיה נוספות.

איור 1. סכמה המפרטת את השלבים הניסיוניים. במהלך שלב הכנת בעלי החיים, ניתוחי window גולגולת מבוצעים על עכברי Arc-GFP. בעלי החיים מקבלים כשבועות כדי להתאושש מהניתוח בכלוב הבית שלהם. הבהירות של חלונות הגולגולת ואז בדקה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עלית. אם החלונות מוכנים להדמיה, החיות הם שוכנו ביחידים בשקט, לסביבה עקביתסביבת בית כלוב, ומשם השלב הניסויי ציר הזמן יכול להתחיל. פרוטוקול הגירוי ההתנהגותי ומרווח ההדמיה יכולים להיות מותאם לאיתור Arc-GFP פלואורסצנטי בשיאו, אשר מתרחש בדרך כלל בשעות אחרי הפעלה. לאחר הגירוי ההתנהגותי הוא מוחלט, החיים הם מורדמים ואזור קליפת המוח של ריבית צלם דרך החלון גולגולתי באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים. אז החיה חזרה לכלוב בבית. המפגשים התנהגותיים והדמיה ניתן לחזור על פני ימים כמבוקשים.

איור 2. דיאגרמה המתאר את הבנייה של Arc-GFP עקום בקו עכבר, שבו קידוד גנטי ערער חלבון פלואורסצנטי ירוק הוחלף חלק הקידוד של ארק הגן מוקדם מידי. בזן זה של עכבר, ביטוי של GFP הוא תחת השליטה של אמרגן ארק אנדוגני. תרשים זה מצויר מחדש על הבסיסהתיאור בעיון 10.

איור 3. סכמטי וממדים של התקנת ראש הקיבעון משמשת להדמית שני פוטונים. המחצית המוצקה של headbar מודבקת לחלק האחורי של הגולגולת (סעיף 2.8), וסופו של דבר עם חור הבורג משמש כדי לצרף את ראשו של בעל החיים המורדמים למסגרת. מסגרת ראש הקיבוע מורכב מלוחית מתכת דקה רכובה על גבי שני קטבים עם ברגים.

איור 4. דוגמה של סריקת ליזר התקנת מיקרוסקופ שני פוטוני הדמית עכברי Arc-GFP. שים לב לעדשת 25x מי הטבילה, כרית חימום ושלב מיקרוסקופ מותאם אישית עם מסגרת ראש קיבעון. עכבר Arc-GFP הרדים המוצג כאן הוא מוכן לדימות vivo.

איור 5. תמונות של כלי דם במוח על פני שטח בחלון גולגולתי כרוני מעל ימים מרובים, המראים את הבהירות והיציבות של דפוסי כלי דם לאורך זמן. משטח המוח היה מואר באור כחול, ואת התמונות צולמו דרך עדשת טבילה במי 25x ידי מצלמת CCD רכוב על המיקרוסקופ.

איור 6. בחי תמונות של שני פוטונים של דפוסי ביטוי Arc-GFP בנוירונים בקליפת המוח קדמיים של עכבר, לאחר שתי חוויות התנהגותיות שונות. () העכבר נשאר בכלוב בביתה לפני ההדמיה ביום הראשון. (ב) העכבר בצע התנהגות מנוע חדשה לפני ההדמיה ביום השני. תמונות ניאון של אותו אזור קליפת המוח נרכשו במקביל בערוצים ירוקים ואדום. GFP פלואורסצנטי הופיע רק במסלול הירוק, ואילו רקמות autofluorescence הופיעה בשני הערוצים. Detectioפרמטרי n נקבעו כך שרמות קרינה אוטומטית רקמות בערוצים הן אדומים וירוקים היו שווה קריאה, ופרמטרים אלה נשמרים לאורך ניסויים. אותות הערוץ אדומים ואז נגרע מאות המסלול הירוקה להסרת רקמת autofluorescence פס הרחבה במהלך ניתוח מצב לא מקוון. אותות הניאון הירוקים כתוצאה מ18 מיקרומטר עבה 3-D מחסנית תמונה הוקרנו על ידי עוצמתו המרבית למישור האופקי, כדי לספק מבט מלמעלה למטה של הדפוסים הסלולר של ביטוי Arc-GFP. סרגל קנה מידה, 30 מיקרומטר.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בשיטת הדמית vivo המתוארת כאן מאפשר בדיקה חוזרת של שינויי ביטוי גני Arc באותם סטים של תאי עצב מעל ימים מרובים בחי. זה הוא שיטה יעילה ותכליתית כדי להשיג מידע על דינמיקה מולקולרית הקשורים לפלסטיות עצבית בנוירונים בודדים בתגובה לחוויות התנהגותיות שונות. שיטות סטנדרטיות כגון histochemical בהכלאה וimmunostaining אתר יכולות להשיג תא בודד ^{3 החלטה,} אבל חוסר היכולת לעקוב אחר שינויי ביטוי גנים באותם ימים על תאי עצב מרובים. פליטת אור תהודה, מגנטית, או גרעינית שיטות הדמיה יכולות לעקוב אחר שינויים בביטוי גנים באותו בעל החיים באמצעות כתבים המתאימים ^15, אבל חוסר הרזולוציה מרחבית כדי להבחין בין רמות הביטוי בנוירונים בודדים. ככזה, אין שיטות קיימות אחרות למדידת שינויי ביטוי גנים יכולות להתאים גם הרזולוציה מרחבית וcov הזמניerage של שיטת ההדמיה שתואר כאן.

שלב קריטי בהליך זה הוא ניתוח החלון גולגולתי. זה צריך להתבצע בזהירות כדי להימנע מטראומה למוח או הדם עוזב מתחת coverslip הזכוכית, דבר שיגרום לדלקת ולהפחית את הבהירות של חלונות גולגולת. לניתוחי גולגולת מנוהל היטב, החלון יישאר ברור כמה שבועות עד עיבוי של הדורה או הצמיחה המחודשת של הגולגולת מקצות החלון למנוע הדמיה נוספת. הדורה ניתן להסיר במקרה צורך, כפי שנעשה לניסויי הדמיה אופטיים כרוניים בחולדות וקופים ^16,17, כדי להגביר את הבהירות האופטית של חלונות גולגולת.

הגבלה לטכניקה המיקרוסקופית שני הפוטונים השתמשה בפרוטוקול זה היא עומק ההדמיה. העומק המרבי שבי ההדמיה ניתן לקבל תמונות באיכות גבוהה יהיה תלוי בבהירות גולגולתי חלון, התקנת מיקרוסקופ, ובהירות של fluoresc כתבי ent. לעכברי Arc-GFP, אנחנו בדרך כלל תמונה של עד 300 מיקרומטר מתחת לפני שטח pial. כדי לבחון את שינויי ביטוי גנים באזורי מוח עמוקים, פלואורסצנציה microendoscopy ניתן להחיל להתגבר על מגבלת העומק במיקרוסקופ שני פוטונים קונבנציונליים ^18.

ערפלנים אפשריים לשינויי ביטוי גנים שנקבעו לכך בשיטת הדמית vivo כוללים כל תופעות משתהות מניתוח או הרדמת גולגולת שעלולה להפריע לתפקוד התנהגותי או האינדוקציה של Arc-GFP. זה חשוב לבדוק את ההיקף הכולל של הפעלת Arc-GFP בתגובה לחוויות ספציפיות בחלקי מוח הקבועים הראשונים, ולהשוות את זה במידה שנצפתה על ידי הדמיה חוזרת באמצעות מיקרוסקופיה in vivo שני פוטונים. תקופת ההחלמה לאחר הניתוח ואת מרווחי הדמיה החוזרת והנשנים אז יכולים להיות מותאמת כדי למזער את תופעות לוואי האפשריות של ניתוח והרדמה על הפעלת Arc-GFP.

_content "> שיטת ההדמיה המתוארת כאן עשוי להיות רלוונטי לכלל עכברים הטרנסגניים שנשאו עיתונאי ניאון לגנים אחרים חוויה מוסדרת ^4. יתר על כן, זה יכול להיות בשילוב עם סמני ניאון המדגישים את המורפולוגיה של תאי ^עצב, שכותרת ^8,9 או אינדיקטורים המשקף את הפעילות נוירופיזיולוגיים בנוירונים אלה ^{19, 20.} יישומים נוספים אלו עשויים לספק תמונה מקיפה יותר של שינויים מולקולריים חוויה תלויה בנוירונים בודדים, והם מתייחסים לשינויים מולקולריים אלה לשינויים המבניים ותפקודיים שמתרחשים בתאי עצב במהלך נורמלי או חוויות פתולוגיים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

אין ניגודי האינטרסים הכריזו.

Acknowledgments

המחברים מבקשים להודות ל 'Belluscio לציוד הסרטת ניתוח, ד' קוון לצילום סיוע, ק יו לעריכת וידאו סיוע, וק מקלאוד לכל מוסיקת הרקע. ק"ו מודה לתמיכה הנדיבה של אגף NIMH של תוכניות מחקר מו"פ אזרחיות והגנים, קוגניציה ותכנית פסיכוזה. עבודה זו נתמכה על ידי תכנית מחקר NIMH ביצוע העצמית (VC, י.י., SMKW) והחטיבה של תכנית מחקר הקלינית והביולוגית של בין חומות NIAAA (VC, RMC, DML).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
FV1000 multi-photon laser scanning microscope	Olympus	FV1000MPE	Imaging
Dissection microscope	Omano	555V107	Surgery
Stereotaxis surgery stage for mice	Harvard Apparatus	726335	Surgery
20X or 25X water immersion objective	Olympus	XLPL25XWMP	Imaging
Microscope stage with head-fixation frame	Custom made	N/A	Imaging
Fine forceps	Fine Science Tools	11251-20	Surgery
Dental drill burr	Fine Science Tools	19007-05	Surgery
CCD camera	QImaging	QICAM 12-bit	Imaging