Summary
Protein-komplekser katalyserer vigtige cellulære funktioner. Detaljeret funktionel og strukturel karakterisering af mange essentielle komplekser kræver rekombinant produktion. MultiBac er et baculovirus / insektcelle-systemet særligt skræddersyet til at udtrykke eukaryote proteiner og deres komplekser. MultiBac blev gennemført som en åben adgang platform og standard operationelle procedurer er udviklet til at maksimere sin nytte.
Abstract
Proteomics forskning afslørede imponerende kompleksitet eukaryote proteomer i hidtil usete detaljer. Det er nu et almindeligt accepteret begreb, at proteiner i celler hovedsagelig eksisterer ikke som isolerede enheder, men udøver deres biologiske aktivitet i forbindelse med mange andre proteiner, i mennesker ti eller mere, danner samlebånd i cellen for de fleste hvis ikke alle vitale funktioner. 1. , 2 Kendskab til funktion og arkitektur af disse multiprotein forsamlinger kræver deres bestemmelse i fineste kvalitet og tilstrækkelig mængde til detaljeret analyse. Knapheden på mange protein komplekser i cellerne, især i eukaryoter, forbyder deres udvinding fra native kilder, og nødvendiggør rekombinant produktion. Baculovirus ekspressionsvektor systemet (BEVS) har vist sig at være særlig anvendelig til at producere eukaryote proteiner, hvis aktivitet ofte afhængig posttranslationel processering som andre almindeligt anvendte ekspressionssystemer ofte kanikke understøtter. 3 BEVS bruge en rekombinant baculovirus, hvori genet af interesse blev indsat til at inficere insekt-cellekulturer, som igen producerer proteinet af valg. MultiBac er en BEVS der har været særligt skræddersyet til produktion af eukaryote protein komplekser, der indeholder mange underenheder. 4 A afgørende forudsætning for effektiv produktion af proteiner og deres komplekser er robuste protokoller for alle trin involveret i et udtryk eksperiment, der ideelt set kan gennemføres som standard operationelle procedurer (SOP) og efterfulgt også af ikke-specialiserede brugere med sammenlignende problemer. Den MultiBac platform på European Molecular Biology Laboratory (EMBL) bruger standardforskrifter for alle trin involveret i en multiprotein komplekst udtryk eksperiment, startende fra indsættelse af gener i en manipuleret baculoviral genom optimeret til heterologe protein produktion egenskaber små analyse af proteinet prøver produceret. 5-8 Platformensinstalleres i en åben adgang tilstand ved EMBL Grenoble og har støttet mange videnskabsfolk fra den akademiske verden og industrien til at fremskynde protein komplekse forskningsprojekter.
Introduction
Biologisk aktivitet styres af samlinger af proteiner og andre biomolekyler, der virker i fællesskab at katalysere cellulære funktioner. Bemærkelsesværdige eksempler omfatter maskiner, der transcribes den arvelige oplysningerne i DNA i messenger RNA. Hos mennesker kommer mere end 100 proteiner sammen i en defineret og reguleret proces at transskribere gener, danner store multiprotein komplekser med 10 og flere underenheder, herunder RNA-polymerase II, og de generelle transkriptionsfaktorer såsom TFIID, TFIIH og andre. 9 Andre eksempler er ribosomet, bestående af mange proteiner og RNA-molekyler, der katalyserer proteinsyntese, eller den nukleare pore kompleks, der er ansvarlig for shuttling biomolekyler gennem kernemembranen i eukaryoter. En detaljeret arkitektonisk og biokemiske dissektion af væsentlige alt flerkomponent-maskiner i cellen er vigtigt at forstå deres funktion. Strukturen belysning af prokaryote og eukaryotic ribosomer, for eksempel, udgjorde kendetegnende begivenheder der giver en hidtil uset indblik i, hvordan disse makromolekylære maskiner udfører deres udpegede funktioner i cellen. 10,11
Ribosomer kan opnås i tilstrækkelig kvalitet og mængde for detaljeret undersøgelse ved oprensning af endogent materiale fra dyrkede celler, på grund af det faktum, at op til 30% af den cellulære masse består af ribosomer. RNA-polymerase II er allerede mindre rigelige af størrelsesordener, og mange tusinde liter af gær kultur skulle behandles for at få en detaljeret atomar baggrund af denne afgørende kompleks centralt for transkription. 12. Det overvældende flertal af de andre væsentlige komplekser er dog til stede i meget lavere beløb i native celler, og dermed ikke kan renses tilstrækkeligt fra native kildemateriale. At gøre sådanne komplekser tilgængelige for detaljeret strukturel og funktionel analyse kræver heterolog produktion ved hjælp af rekombinant techniques.
Rekombinant protein produktion haft en stor indflydelse på livet forskning. Mange proteiner blev produceret rekombinant, og deres struktur og funktion dissekeret høj opløsning. Strukturel genomforskning programmer har draget fordel af en belysning af genomer af mange organismer at løse genproduktet repertoire af hele organismer i high-throughput (HT) mode. Tusinder af protein strukturer er således blevet bestemt. Til dato har det mest prolifically anvendte system til produktion af rekombinante proteiner blevet E. coli, og mange ekspressionssystemer er blevet udviklet og forfinet gennem årene for heterolog produktion i denne vært. De plasmider huser et væld af funktionaliteter for at aktivere protein produktion i E. coli fylder hele kataloger af kommercielle udbydere.
Men E. coli har visse begrænsninger, som gør det uegnet til at producere mange eukaryote proteiner, og i partikulære protein komplekser med mange underenheder. Derfor har proteinproduktion i eukaryote værter blevet stadig den foretrukne metode i de seneste år. Et særligt velegnet system til at producere eukaryote proteiner er baculovirusekspressionsvektor systemet (BEVS), der bygger på en rekombinant baculovirus bærer de heterologe gener til at inficere insekt cellekulturer dyrket i laboratoriet. Det MultiBac systemet er en mere nyligt udviklede BEVS der er særligt tilpasset til fremstilling af eukaryote protein komplekser med mange underenheder (figur 1). MultiBac blev først indført i 2004. 13. Siden lanceringen har MultiBac løbende blevet forfinet og strømlinet at forenkle håndteringen, forbedre target protein kvalitet og generelt gøre systemet tilgængeligt for ikke-specialiserede brugere ved at designe effektive standardprocedurer (SOP). 4 MultiBac er blevet implementeret i mange laboratorier verden over, i academia og industri. På EMBL i Grenoble blev transnationale adgang til programmer indført af Europa-Kommissionen til at yde sagkyndig uddannelse på MultiBac platform for videnskabsfolk, der ønskede at bruge dette produktionssystem for at fremme deres forskning. Struktur og funktion af mange protein komplekser, der var hidtil ikke er tilgængelige blev belyst ved hjælp af prøver produceret med MultiBac. 4. I det følgende er de væsentlige skridt i MultiBac produktion opsummeret i protokoller, som de er i drift på MultiBac facilitet på EMBL Grenoble.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1.. Tandem Recombineering (TR) for at skabe multigenfamilie ekspressionskonstruktioner
- Planlægning af co-ekspression strategi. Design tilgang til at indsætte dine gener af interesse i og-acceptorer. Potentielle fysiologiske undermoduler af dit kompleks, bør samles på bestemte acceptorer og donorer. Brug Multiplikation Modul bestående af Homing endonuklease (HE) - BstXl pairs at kombinere ekspressionskassetter på individuel Donor-og acceptor plasmider 7,8 Oprette alle relevante konstruktioner i silico og validere strategi grundigt, før man går videre til eksperimentelt arbejde.. For eksempel bør gener af interesse kontrolleres ikke at indeholde HE eller andre restriktionssteder og tilstedeværelsen af korrekte åbne læserammer (ORF'er) skal valideres. Overveje at bestille syntetiske gener optimeret til insektcelle kodonanvendelse og mRNA sekundær struktur for at forbedre protein produktionsniveau samt fjernelse af enhver existikke HE websteder fra generne af interesse. Overvej at placere rensning tags baseret på data fra litteraturen om fleksibel eller udsat N-eller C-terminalerne af dine proteiner af valg. Overveje at anvende polyprotein strategier, der sigter på at producere flere proteinunderenheder i din kompliceret, hvis de relative mængder af de enkelte proteiner skal kontrolleres på grund af støkiometri spørgsmål i komplekset. 4. udarbejde detaljerede "How-To" dokument (elektronisk lab bog anbefales), der indeholder alle forventede eksperimentelle trin i projektet fører op til den fuldstændige multigene konstruktion (r). Oprette elektroniske filer af Cre-loxP smeltet plasmider for eksempel ved hjælp af Cre-ACEMBLER software, som kan downloades fra Berger gruppen hjemmeside ( www.embl.fr/multibac/ multiexpression_technologies / cre-acembler ).
- Sæt dine gener af interesse i udvalgte donorer ogAcceptorer ved hjælp af restriktionsenzymer og ligase, eller alternativt ved hjælp af ligation uafhængige metoder efter offentliggjorte protokoller. 5,6,14 Hvis du har adgang til en væskehåndtering arbejde-station, og hvis du planlægger en lang række konstruktioner, der skal genereres ( for eksempel til kombinatoriske metoder) overveje at bruge robotteknologi scripts udviklet og implementeret af Berger gruppe (Figur 2). 14,15 Hvis væskehåndtering arbejde-station ikke er tilgængelig, manuel betjening med mikrotiterplader tillader geninsertion i en HT lignende måde.
- Begrænsninger, som behovet for at kontrollere støkiometri de udtrykte subunits kan materialisere. I tilfælde af støkiometrisk ubalancerede ekspressionsniveauer af individuelle subunits af et protein kompleks, overveje at anvende polyprotein strategier til conjoin flere underenheder af din kompleks og en specifik protease (f.eks tobak etch virus nia protease) i enkelt stor ORF'er afstand af sÆRLIG proteolytiske sites. 4,8 Overvej co-udtrykkende en eller flere polyproteiner med enkelt ekspressionskassetterne, hvis du har et meget stort kompleks med mange underenheder og bredt spænder molekylvægt enkelte subunits. Overveje coekspression flere gener, der koder for det samme protein i en polyprotein eller som flere identiske ekspressionskassetter, hvis dette protein er kendetegnet ved lav produktion udbytte. 4,13
- Validere alle donoren og acceptoren konstruktioner klonet ved restriktionskortlægning (eventuelt i high-throughput) og sekventering. Fortsæt at fusionere Donor-acceptor kombinationer af Cre-LoxP rekombination at generere multigenfamilie ekspressionskonstruktioner af valg. Valider renset Acceptor-Donor fusion plasmider ved restriktionskortlægning, anvende elektroniske sekvenser skabt af Cre-ACEMBLER eller lignende programmer som en reference.
- Opbevar rensede og valideret Donorer, acceptorer og Donor-acceptor fusioner ved -20 ° C eller -80 ° C. Arkiv plasmids og deres sekvenser (Microsoft Excel, Filemaker, andre) omhyggeligt til senere brug.
2.. Composite multigenfamilie Baculovirus Generation, Forstærkning og opbevaring
- Integrer multigenfamilie transfervektorer den MultiBac baculoviral genomet ved omdanne til DH10 celler, der huser det virale genom og de funktionaliteter, der kræves for Tn7 gennemførelse. Bemærk, at Multibac baculoviral genom kan præinstalleret med bestemte gener af interesse (YFP markør, chaperones osv.) i sit eget LoxP site (manipuleret i genomet distalt for Tn7 vedhæftede webstedet) af en in vivo Cre reaktion forud Tn7 integration. 13 Efter Tn7 gennemførelse, mens celler med sammensatte baculovirus indeholdende generne af interesse udvalgt af blå / hvid screening (vellykkede TN7 gennemførelse resulterer i tab af α-komplementering af β-galactosidase, og derfor kolonier med korrekt Tn7 gennemførelse forbliver hvidt på selektiv etgar plader indeholdende X-gal), og genomet fremstilles ved alkalisk lysering og ethanol / isopropanol udfældning. 5,6
- Transfektion og indledende virusproduktion. Sted 6-brønds vævskulturplade i steril hætte. Fra log-fase Sf21 insekt cellekultur, frø ud portioner af celler i brøndene og transficere ved tilsætning af oprensede baculovirale genom og et transfektionsreagens blandet i dyrkningsmedier som beskrevet. 6 Harvest indledende virus efter 48-60 timer ved at fjerne mediet ( høj kvalitet, lav titer virus V 0, typisk 3 ml per brønd). Supplere frisk medium, og test for proteinproduktion (og, hvis en YFP markør er til stede, til fluorescens) efter yderligere 2-3 dage. 6,7
- Forstærkning af virus, lav MOI regime. Brug V 0-virus til at inficere 25-50 ml celler i log-fase (celletæthed <1x10 6 celler per ml) i små (100-250 ml) Erlenmeyer rystekolber ophidsedepå orbital platform shakere (figur 3). Tæl celler og opdele hver 24 timer, indtil cellerne stopper fordobling (proliferation anholdelse). Følg en lav MOI (mangfoldigheden af infektion dvs antal viruspartikler per celle) regime: Cellerne skal fordoble (mindst) én gang (MOI <1), ellers gentages eksperimentere med et mindre volumen V 0 tilføjet. Normalt er 3 ml V 0 anvendt til at inficere 25 ml Sf21 insektceller med en densitet på 0.5x10 6 celler / ml. Det er vigtigt at undgå skadelig over-forstærkning og auto-sletning af virus, der kan resultere i tab af de heterologe gener af interesse. Høst V 1-virus (25-50 ml) efter 48-60 timer ved pelletering celler og fjerne medier, der indeholder virus. Supplér med friske medier og test for YFP og protein produktion ved at fjerne 1x10 6 celler hver 12 eller 24 timer, pelletering og validering protein produktion og markør protein (YFP) signal. 6 Amplify virus (tilV 2) yderligere, hvis større udtryk volumener er rettet mod ved at inficere op til 400 ml celler i 2 L shaker kolber med V 1-virus respekterer ovenstående lav MOI regime (celler skal fordobles mindst én gang efter infektion med V 1). Stringent test proteinproduktion og markørprotein signal under amplifikation for at undgå ophobning af defekte vira ikke længere indeholder dine gener af interesse. 5-7 Brugt cellepellets akkumulere ved hver amplifikationer trin allerede for etablering oprensningsprotokoller for det udtrykte protein kompleks af interesse.
- BIIC lagring af produktionen virus. Vi anbefaler kraftigt at gemme V 2-virus som produktionen virus ved hjælp af BIIC (B aculovirus-i nfected jeg nsect c alen) metoden, for at forhindre ændringer (f.eks tab af genet af interesse) af det rekombinante virus og bevare høj ekspression niveaus 16 Pellet inficerede celler 24 timer efter spredning anholdelse er observeret -. På dette stadium celler indeholder komplette viruspartikler lige før de ville blive løsladt (ved knopskydning) i medierne. Fjern mediet og fryse portioner af cellepelleten i flydende nitrogen og opbevares på ubestemt tid. 7,16
3.. Protein Produktion og Downstream Processing
- Inficere store (r) kulturer og overvågning YFP. Brug V 1, V 2 eller frosne BIIC alikvoter at inficere større cellekulturer til produktionsanlæg kørsler (typisk 400 ml i 2 L kolber). Overhold lav MOI regime (afpas virus lydstyrke bruges til infektion, således at inficerede kultur fordobler mindst én gang). Forstør inficerede kulturvolumener om nødvendigt ved at multiplicere antallet af kolber. Hvis YFP markørprotein er til stede, trække på bestemte intervaller 1x10 6 celler, pellet og lysere cellerne og overvåge udviklingen i YFP signal, indtil et plateau er nået indicating maksimal produktion af rekombinante proteiner. YFP-niveauer kan måles i et standard 96-brønds plade-læser kan optage fluorescenssignaler (f.eks Tecan SPECTRAFluor). Harvest celler på dette stadium. Opbevar cellepellets ved -20 ° C (kortvarigt) eller -80 ° C (lang sigt).
- Cellelyse og fraktionering. Lyse celler ved din foretrukne metode til valg, der er skræddersyet til kravene i din protein (fryse-tø, lydbehandling franske presse, andre). 5-7 fraktionering cytosol og kerner og test for tilstedeværelsen af dine proteiner af interesse. Udvikle oprensningsprotokoller baseret på de resultater, der forenkler proteinoprensning. Overveje at anvende iblødsætning procedurer til at udtrække din protein fra det nukleare fraktion under høje KCl vilkår, hvis dine proteiner bor i kernen. 7,18
- Proteinoprensning (mikro-skala, stor skala). Bemærk, at der ofte små mængder (10 eller 25 ml) af cellekultur er sufficient til opnåelse cellepellets til oprensning væsentlige mængder af dine proteiner af interesse på grund af de typisk høje eller meget høje produktionsniveauer af heterologe proteiner i baculovirus / insekt cellesystemer (ofte 10-100 mg protein pr L kultur og mere). I forbindelse med mikro-rensning (flerbrøndsplader, microtip metoder, GE Healthcare ÄKTAmicro system, andre) er det muligt at opnå biokemiske og aktivitet data og også ofte tilstrækkelig mængde af de ønskede proteiner og komplekser til nanoliter skala high-throughput krystallisering (HTX ). Overveje at bruge metal affinitetsoprensning (Clonetech Takara TALON, Qiagen NiNTA metalchelator harpikser) og en oligo-histidin (6-10 rester) tag på udsatte underenheder af din protein kompleks for at lette oprensning, sammenholdt med ionbytning og gelpermeationskromatografi i små volumener ved f.eks ÄKTAmicro eller en lignende lille volumen rensning maskine (figur 4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stærk co-ekspression af heterologe proteiner opnået med MultiBac system er vist i figur 1d (prober taget 48 timer efter smitte en suspension cellekultur). De overudtrykte proteinbånd er tydeligt synlige i hele celleekstrakt (SNP), og den klarede lysat (SN). Kvaliteten og kvantiteten af det producerede protein materiale er ofte tilstrækkelig til, at struktur bestemmelse af protein-komplekser, såsom mitotiske checkpoint kompleks MCC vist i figur 1e. 17.
Figur 2 viser den work-flow af et gen forsamling eksperiment ved robot-assisteret tandem recombineering (TR). Robuste DNA samling protokoller var scripted i robotteknologi rutiner for paralleliseret samling af multigenfamilie ekspressionskonstruktioner. Individuelle robot trin er vist i snap-shots (figur 2c, I - IV). DNA komponenter, der skal samles, er dannet ved PCR og kvalitet kontrolleres afe-geler (figur 2d, til venstre), de samlede multigene konstruktionerne er ligeledes valideret ved PCR med specielt designet sæt primere (figur 2d, højre) 14,15.
Rekombinant baculovirus generering og forstærkning følger standard operationelle procedurer (skematisk vist i figur 3a). Snapshots af celler dyrket i et monolag er vist (figur 3b, I. & II.) Efter infektion med en MultiBac virus.
Videre forarbejdning af de rekombinante protein komplekser kan miniaturiseres ved hjælp af multi-brønds-plade eller mikrospids-baseret chromatografi til affinitetsoprensning efterfulgt af gelpermeationskromatografi (SEC) af komplekserne ved indarbejdning af work-flow små systemer såsom ÄKTAmicro (figur 4a). Et repræsentativt SEC profil af en ~ 700 kDa human transkriptionsfaktor kompleks vises. Prøve oprenset ved hjælp afden ÄKTAmicro i begrænset omfang, er typisk tilstrækkeligt til karakterisering ved biokemiske og biofysiske midler, herunder elektronmikroskopi (figur 4b).
Figur 1. MultiBac platform teknologi til multiprotein kompleks produktion. (A) gener af interesse er integreret i Multibac baculoviral genomet ved hjælp Tn7 gennemførelse i forbindelse med blå / hvid screening. En LoxP site på virus rygraden tillader tilføjelse af yderligere funktioner såsom en fluorescerende markør-protein til at overvåge virus ydeevne og heterolog proteinproduktion. (B) Baculovirus vedtager en langstrakt pind form og er kendetegnet ved en fleksibel konvolut, der kan forøge at rumme store (> 130 kb) cirkulært dobbeltstrenget DNA-genom. Store heterologe genindsætninger i genomet tolereres by forlængede konvolutten. (c) Standard Erlenmeyerkolber på orbitalryster platforme kan anvendes til dyrkning af store insekt cellekulturer til heterologues proteinproduktion. (d) MultiBac systemet effektivt producerer rekombinante proteiner, som ofte tydeligt allerede i den hel- celle ekstrakt (SNP). (e) Strukturen af mitotiske checkpoint komplekset blev belyst ved røntgendiffraktion fra krystaller dyrkes fra prøve produceret med MultiBac systemet. 17. Klik her for at se større figur .
Figur 2. (Automated) Tandem Recombineering (TR). (A) Tandem recombineering udnytter små arrays af syntetiske plasmid DNA-molekyler kaldet og-acceptorer til samling multigene ekspressionskonstrukter, eventuelt i robot-assisteret tilstand via en væskehåndtering arbejde-station (til højre). (b) TR workflow vises. SLIC står for sekvens og ligatur uafhængig kloning, ska står for Cre-loxP fusion concatenating og-acceptorer i hvilke gener af interesse er blevet indsat ved SLIC. Multigenfamilie ekspressionskonstrukter genereret af denne recombineering procedure ved hjælp SLIC og Cre i tandem derefter integreret i MultiBac baculovirusgenomet og anvendes til stor og lille skala udtryk i insekt cellekulturer inficeret med det rekombinante virus. (C) Snapshots af robottens-assisteret TR proces er vist herunder tilvejebringelse af template-DNA og primere (I), fremstilling af PCR-reaktioner i flerhulsplader (II), PCR-amplifikation af DNA (III) og udarbejdelse af multigene konstruktioner dyrkes i bakteriekultur ved alkalisk lysering i multi-brønd plader ( IV). (d) PCR-produkter, der anvendes til TR visualiseres ved osfunktionen E-gel-system (til venstre). Afsluttede multigene konstruktioner valideret af analytiske PCR-reaktioner læsset på en e-gel (til højre). Klik her for at se større figur .
Figur 3. MultiBac virus generation, forstærkning, opbevaring. (A) Den standardprocedure (SOP) i MultiBac platform på EMBL Grenoble er vist i en skematisk. Rekombinant MultiBac virus identificeres ved blå-hvid screening og fremstillet af bakteriekulturer. Indledende transfektion foregår på 6-brønds plader podet med monolag af insektceller (Sf21, Sf9, Hi5, andre). Virus forstærkes og target protein produceret i Erlenmeyer shakers. Virus er gemt ved at fastfryse portioner af inficerede insektceller (BIIC). Florescence registreres som et analytisk redskab, hvisYFP (eller anden fluorescerende protein) er blevet integreret som en markørprotein for eksempel i loxP stedet stede på MultiBac baculovirale genom. (B) Snapshots af insektceller inficeret med baculovirus MultiBac er vist. Cellerne stoppe prolifererende, vokse i størrelse (I.). Cellefusioner observeres (II). Virus budded off de inficerede celler i medierne opsamles og bruges til at inficere større cellekulturer til protein-kompleks produktion (III, IV). Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Protein kompleks produktion og ned-stream processing. Protein kompleks prøve kan allerede bekvemt oprenses fra små indledende cellekulturer ved at udnytte miniaturiserede oprensningsmetoder såsom flerlags eller microtip-baseret oprensning, eventuelt i forbindelse med små mængder kromatografisystemer (venstre). Ofte udbyttet af allerede disse "analytiske" rensning kørsler (i midten) er tilstrækkelig til at analysere strukturen og funktionen af det oprensede kompleks ved en række midler, herunder elektronmikroskopi (højre). Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Video snapshot i figurerne 2 og 3 viser hele processen fra robot-assisteret generation fra cDNA fra multigenfamilie ekspressionskonstruktionerne hele vejen til infektion af insekt cellekulturer til proteinproduktion. Nye reagenser (plasmider og virus) og robuste protokoller er blevet udviklet til at muliggøre en rørledning afhængige standardforskrifter. Hele pipeline er blevet implementeret som en platform teknologi på EMBL i Grenoble. Den MultiBac platformen er blevet besøgt af mange forskere fra den akademiske verden og industrien, der er involveret i multiprotein forskning. Uddannelsen adgang understøttes af dedikeret adgang, der finansieres af Europa-Kommissionen (P-CUBE, BioSTRUCT-X).
Tilgængeligheden af standardforskrifter at udføre protein komplekst udtryk ved at bruge MultiBac systemet har gjort denne teknologi let modtagelig også til ikke-specialiserede brugere. Robot-assisteret betjening accelererer multiprotein kompleks produktion i particular når et tilstrækkeligt stort antal af komplekser, for eksempel varianter og mutanter af et eksemplar af interesse, skal genereres parallelt. Men manuel betjening ved lav-til medium gennemløb også i høj grad nyder godt af tilgængeligheden af standardforskrifter. Det er vores erfaring, behov processer, der kunne være held scripted i robotteknologi rutiner til at blive forfinet først med betydelig indsats indtil det er tilstrækkeligt robuste protokoller blev opnået, der er kompatible med at bruge en robot. Sådanne protokoller udgør grundlaget for vores standardprocedurer. 5,6,14,15 Faktisk gennemførelsen af disse robuste protokoller for robotten føre til en meget betydelig effektivitetsgevinst også manuelle operationer i vores laboratorium.
Mange proteiner og protein komplekser har været og bliver fremstillet ved hjælp af MultiBac system, som vi har udviklet, og næsten 500 laboratorier verden over har opnået reagenserne. MultiBac har katalyseret forskning, ikke blot i strukturel biologi, men også i mange othdre områder af biovidenskab, der undersøger eller udnytte samspillet mellem proteiner i store forsamlinger. MultiBac er også blevet anvendt til at producere proteiner med betydelig farmakologisk interesse, herunder virus-lignende partikler, som kan blive anvendelige vaccinekandidater. 4. For nylig er MultiBac også blevet anvendt til at levere gener i mammale celler og cellekulturer, eller endda hele organismer ved genterapi. 4. Vi forventer, at metoder som dem, der er illustreret i dette bidrag vil vise sig at være nyttig for mange forskningsområder involverer multiprotein forsamlinger og komplekst samspil af biologiske makromolekyler, der danner grundlag for cellulære processer i sundhed og sygdom.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IB er opfinder af patenter og patentansøgninger beskriver dele af teknologien her beskrevet.
Acknowledgments
Vi takker Christoph Bieniossek, Simon Trowitzsch, Daniel Fitzgerald, Yuichiro Takagi, Christiane Schaffitzel, Yvonne Hunziker, Timothy Richmond og alle tidligere og nuværende medlemmer af Berger laboratorium for hjælp og rådgivning. Den MultiBac platform og dets udvikling har været og er generøst støttet af finansieringsorganer, herunder den schweiziske National Science Foundation (SNSF), Agence Nationale de Recherche (ANR), og Centre National de Recherche Scientifique (CNRS), og Europa-Kommissionen (EF) i rammeprogrammer (RP) 6 og 7. Støtte til tværnational adgang leveres af EF FP7-projekter P-Cube ( www.p-cube.eu ) og BioStruct-X ( www.biostruct-x.eu ). Det franske Videnskabsministeriet er især anerkendt for at støtte MultiBac platform ved EMBL gennem Investissement d'Avenir projekt FRISBI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bluo-Gal | Invitrogen | 15519-028 (1 g) | |
| Tetracycline | Euromedex | UT2965-B (25 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| Kanamycine | Euromedex | EU0420 (25 g) | 1,000X at 50 mg/ml |
| Gentamycine | SIGMA | G3632 (5 g) | 1,000X at 10 mg/ml |
| IPTG | Euromedex | EU0008-B (5 g) | 1,000X at 1M |
| Cre-recombinase | New England BioLabs | M0298 | |
| X-Treme GENE HP transfection reagent | Roche | 06 366 236 001 | |
| Hyclone SFM4 Insect | Thermo Scientific | SH 30913.02 | |
| 6-well plate Falcon | Dominique Dutscher | 353046 | |
| 2 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357507 | |
| 5 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357543 | |
| 10 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357551 | |
| 25 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357535 | |
| 50 ml pipette Falcon | Dominique Dutscher | 357550 | |
| 50 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352070 | |
| 15 ml tube Falcon | Dominique Dutscher | 352096 | |
| 1.8 ml cryotube Nunc | Dominique Dutscher | 55005 | |
| 100 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211917 | |
| 250 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211918 | |
| 500 ml shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211919 | |
| 2 L shaker flasks Pyrex | Dominique Dutscher | 211921 | |
| Certomat Orbital Shaker + plateau | Sartorius | 4445110, 4445233 | |
| Liquid nitrogen tank dewar 35 L | Fisher Scientific | M76801 | |
| Biological Safety Cabinet Faster | Sodipro | FASV20000606 | |
| Optical Microscope | Zeiss | 451207 | |
| Sf21 Insect cells | |||
| Hi5 Insect cells | Invitrogen | B855-02 | |
| Tecan freedom EVO running Evoware plus | TECAN | ||
| 10 μl conductive tips (black), | TECAN | 10 612 516 | |
| 200 μl conductive tips (black) | TECAN | 10 612 510 | |
| disposable trough for reagents, 100 ml | TECAN | 10 613 049 | |
| twin.tec PCR plate 96, skirted | Eppendorf | 0030 128.648 | |
| 96 well V bottom, non sterile | BD falcon | 353263 | |
| 96 deepwell plate color natural, PP) | Fisher | M3752M | |
| PS microplate, 96 well flat bottom | Greiner | 655101 | |
| 96 deepwell plate | Thermo scientific | AB-0932 | |
| 24 well blocks RB | Qiagen | 19583 | |
| DpnI restriction enzyme | NEB | R0176L | 20 U/uL |
| NEBuffer 4 10X | NEB | B7004S | |
| 2X phusion mastermix HF | Finnzyme | ref F-531L | |
| 2X phusion mastermix GC | Finnzyme | ref F-532L | |
| DGLB 1.5X | homemade | 7.5% glycerol, 0.031% Bromophenol blue, 0.031% Xylen cyanol FF | |
| High DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10496-016 | |
| Low DNA Mass Ladder for e-gel | Life Technologies | 10068-013 | |
| E-gel 48 1% agarose GP | Life Technologies | G8008-01 | |
| Nucleo Spin- robot-96 plasmid kit | Macherey Nagel | 740 708.24 | |
| PCR clean-up kit, Nucleospin Robot-96 Extract | Macherey Nagel | 740 707.2 | |
| Gotaq green master mix | Promega | M7113 | |
| T4 DNA polymerase, LIC-qualified | Novagen | 70099-3 | |
| DTT 100 mM | homemade | ||
| Urea 2 M | homemade | ||
| EDTA 500 mM pH 8.0 | Homemade | ||
| LB broth (Miller) 500 g | Athena ES | 103 |
References
- Nie, Y., Viola, C., Bieniossek, C., Trowitzsch, S., Vijay-Achandran, L. S., Chaillet, M., Garzoni, F., Berger, I. Getting a Grip on Complexes. Curr. Genomics. 10 (8), 558-572 (2009).
- Robinson, C. V., Sali, A., Baumeister, W.
- Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nat. Biotechnol. 23 (5), 567-575 (2005).
- Bieniossek, C., Imasaki, T., Takagi, Y., Berger, I. MultiBac: expanding the research toolbox for multiprotein complexes. Trends Biochem. Sci. 37 (2), 49-57 (2012).
- Fitzgerald, D. J., Berger, P., Schaffitzel, C., Yamada, K., Richmond, T. J., Berger, I. Protein complex expression by using multigene baculoviral vectors. Nat. Methods. 3 (12), 1021-1032 (2006).
- Bieniossek, C., Richmond, T. J., Berger, I. MultiBac: multigene baculovirus-based eukaryotic protein complex production. Curr. Protoc. Protein Sci. Chapter 5, Unit 5.20 (2008).
- Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Nie, Y., Garzoni, F., Berger, I. New baculovirus expression tools for recombinant protein complex production. J. Struct. Biol. 172 (1), 45-54 (2010).
- Vijayachandran, L. S., Viola, C., Garzoni, F., Trowitzsch, S., Bieniossek, C., Chaillet, M., Schaffitzel, C., Busso, D., Romier, C., Poterszman, A., Richmond, T. J., Berger, I. Robots, pipelines, polyproteins: enabling multiprotein expression in prokaryotic and eukaryotic cells. J. Struct. Biol. 175 (2), 198-208 (2011).
- Thomas, M. C., Chiang, C. M. The general transcription machinery and general cofactors. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 41 (3), 105-178 (2006).
- Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Ban, N.
- Melnikov, S., Ben-Shem, A., Garreau de Loubresse, N., Jenner, L., Yusupova, G., Yusupov, M. One core, two shells: bacterial and eukaryotic ribosomes. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (6), 560-567 (2012).
- Cramer, P., Bushnell, D. A., Fu, J., Gnatt, A. L., Maier-Davis, B., Thompson, N. E., Burgess, R. R., Edwards, A. M., David, P. R., Kornberg, R. D. Architecture of RNA polymerase II and implications for the transcription mechanism. Science. 288 (5466), 640-649 (2000).
- Berger, I., Fitzgerald, D. J., Richmond, T. J. Baculovirus expression system for heterologous multiprotein complexes. Nat. Biotechnol. 22 (12), 1583-1587 (2004).
- Bieniossek, C., Nie, Y., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Collinson, I., Romier, C., Berger, P., Richmond, T. J., Steinmetz, M. O., Berger, I. Automated unrestricted multigene recombineering for multiprotein complex production. Nat. Methods. 6 (6), 447-450 (2009).
- Nie, Y., Bieniossek, C., Frey, D., Olieric, N., Schaffitzel, C., Steinmetz, M. O., Berger, I. ACEMBLing multigene expression constructs by recombineering. Nat. Protocols. , (2009).
- Wasilko, D. J., Lee, S. E., Stutzman-Engwall, K. J., Reitz, B. A., Emmons, T. L., Mathis, K. J., Bienkowski, M. J., Tomasselli, A. G., Fischer, H.D. titerless infected-cells preservation and scale-up (TIPS) method for large-scale production of NO-sensitive human soluble guanylate cyclase (sGC) from insect cells infected with recombinant baculovirus. Protein Expr. Purif. 65 (2), 122-132 (2009).
- Chao, W. C., Kulkarni, K., Zhang, Z., Kong, E. H., Barford,
- Yamada, K., Frouws, T. D., Angst, B., Fitzgerald, D. J., DeLuca, C., Schimmele, K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Structure and mechanism of the chromatin remodelling factor ISW1a. Nature. 472 (7344), 448-453 (2011).
