Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Biomacromolecular Uyuşturucu Sitozolik Teslimat için pH-duyarlı endosomolitik Ajanlar değerlendirilmesi için Ex Vivo Kırmızı Kan Hücresi Hemoliz Testi

Published: March 9, 2013 doi: 10.3791/50166
Automatic Translation
*1,2, *1,2, *1,2, 2,3, 1, 1,2, 4, 1,2,5,6, 1,2
1Department of Biomedical Engineering, Vanderbilt University, 2Vanderbilt Institute for Nanoscale Science & Engineering, Vanderbilt University, 3Interdisciplinary Materials Science Program, Vanderbilt University, 4Monroe Carell Jr. Children's Hospital, Vanderbilt University Medical Center, 5Department of Chemical & Biomolecular Engineering, Vanderbilt University, 6Department of Cancer Biology, Vanderbilt University
* These authors contributed equally

Summary

Bir hemoliz tahlil hücre içi kargo için ilaç dağıtım sistemleri 'cytocompatibility ve endosomolitik aktivite hızlı, yüksek hacimli ekran olarak kullanılabilir. Tahlil çevresel pH bir fonksiyonu olarak eritrosit membran parçalama ölçer.

Abstract

Endo-lizozomal veziküller oluşturan çift katmanlı fosfolipidlerin hücre içi hedeflere biyolojik ilaçların teslim için bir engel teşkil edebilir. Bu engeli aşmak için, sentetik ilaç taşıyıcı bir dizi aktif endozomal zarı bozar ve sitoplazma içine kargo sunmak için tasarlanmış edilmiştir. Burada, hücre içi ilaç dağıtım sistemleri cytocompatibility ve endosomolitik etkinlik için hızlı, yüksek hacimli ekran olarak kullanılabilir hemoliz tahlil, açıklar.

Hemoliz testi, insan kırmızı kan hücreleri ve test materyalleri ekstraselüler, erken endozomal ve geç endo-lizozomal ortamlarda taklit tanımlanan pH'da tampon co-inkübe edilir. Pelet bozulmamış kırmızı kan hücreleri santrifüj basamağı sonrasında, orta salınan hemoglobin miktarı, spektrofotometrik (en iyi dinamik aralığı için 405 nm) olarak ölçülür. Yüzde kırmızı kan hücre parçalama sonra pozitif kontrol samp göre ölçülürles bir deterjan ile lize. Bu model sistemde eritrosit membran endo-lizozomal veziküller içine iki tabakalı lipid membran için bir vekil olarak hizmet vermektedir. İstenen sonucu fizyolojik pH (7.4) ve yaklaşık pH 5-6,8 gelen endo-lizozom pH aralığında sağlam hemoliz de ihmal hemoliz olduğunu.

Introduction

Hücre içinde birçok potansiyel yüksek etkili tedavi hedefleri olmasına rağmen, maddelerin hücre içi teslimat önemli bir sorun teşkil etmektedir. Sık sık, ilaçlar, özellikle biyolojik, ekzositoz yoluyla hücreler tarafından içselleştirilmesi ve veziküller içine kaçırılan ya endo-lizozom yolağı yoluyla içindekiler bozulmaya yol açan veya hücrenin geri shuttled vardır vardır. Ikincisi süreçte 1, iç pH veziküllerin enzim aktivitesi için optimum pH olan yaklaşık olarak 5-6 olana kadar asitleştirildi, bu gibi lisozim gibi bu bölme içinde işlev. 2

Son zamanlarda, malzemeleri bir dizi özel bir asitleştirme kendi kargo sitozolik teslim kolaylaştırmak için endozomlar kaldıraç için tasarlanmış edilmiştir. Bu yaklaşımın bir örneği olan temel fizyolojik pH (yani 7.4) zwitteriyonik ve şarj nötr sentetik polimer misel nanopartiküller kullanır. Bununla birlikte, pH 6.0 '- 6.5, polimerler protonlanır olmak ve misel çekirdek oynattığını net pozitif yük kazanma, ve maruz kalan polimer segmentleri ile etkileşim ve endozomal zarı bozar. Bu aktivite, onların sitosolik hedefleri erişim imkanı sağlayan, peptid ve nükleik asit-bazlı terapötiklerin endozomal kaçış teşvik etmek için gösterilmiştir. Membran bariyeri bozmak endozomal kaçış aracılık için geliştirilmiş yöntemlerin diğer örnekleri ya da 3,4 'füzojenik' peptitler yer fosfolipid çift-katlı membran füzyonu veya geçici gözenek oluşumuna aracılık eden proteinlerdir. örneğin poli (propylacrylic asit) gibi anyonik alkil akrilik asit homopolimerleri 5 diğer bir iyi incelenmiş olan bir yaklaşım, ve bu polimerler de, kolye karboksilik asit protonasyon durum geçiş belirler Endo-Lizozomal pH aralıkları bir hidrofobik, membran-yıkıcı devlet. 6,7

Endosomolitik davranışı tarama için yararlı bir model sistem ex in vivo pH bağımlı hemoliz testi. 8 Bu model sistem olarak, eritrosit membranı endo-lizozomal veziküller içine iki tabakalı lipid membran için bir vekil olarak hizmet vermektedir. Bu genellenebilir modeli hücre delici peptidler ve diğer polimerik gen aktarım sistemlerinin endosomolitik davranışlarını değerlendirmek için başkaları tarafından kullanılmaktadır. 8-11 Bu deneyde, insan kırmızı kan hücreleri ve test materyalleri taklit tanımlanan pH'da tampon birlikte kuluçkaya vardır ekstraselüler (7.4), erken (6.8) endozomal ve endo-lizozomal geç (<6.8) ortamları. Kuluçka dönemi sırasında serbest hemoglobin miktar deterjan ile lize pozitif kontrol örneklerinde serbest hemoglobin miktar ile normalize edilir kırmızı kan hücrelerinin lizisi, bir ölçüsü olarak ölçülür.

Potansiyel endosomolitik malzemeleri test küçük bir kütüphane tarama itibaren, bir pH 7.4 hiç hemoliz üretmek örnekleri anlaması, ancak önemli ölçüde yükselmiş etek olabilirpH <6.5 olan olysis, sitozolik ilaç dağıtım için en etkili ve cytocompatible adayları olacak. Bu kriterlere uyan malzemeler gelişigüzel endo-lizozomal bölmeye içselleştirilmesi sonrasında yerel pH bir düşüş maruz kadar iki tabakalı lipid membranlar (sitotoksisite neden olabilir yani) yok eylemsiz değil kalması beklenir.

Bu protokolde, eritrositler bir insan donör izole edilir ve pH 5.6, 6.2, 6.8, ya da deneysel endosomolitik ilaç dağıtım ajanları ile 7.4 'de co-inkübe. Bozulmamış eritrositler peletlenmiş, ve süpernatan (erimiş eritrositler serbest hemoglobin ihtiva eden) bir plaka okuyucu (Şekil 1) vasıtasıyla hemoglobin karakteristik absorbans için analiz edilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Tamponlar ve Test Aracıları Hazırlanması ve Sterilizasyonu

  1. 150 mM NaCl tampon: nanopure 500 ml su içinde 4.383 g NaCl kristaller eritilir.
  2. pH Tamponları: monobazik ve dibazik sodyum fosfat uygun miktarlarda karıştırılarak pH 5.6, 6.2, 6.8 ve 7.4 'de fosfat tamponlar hazırlayın. Örnekleri gibi sitrat tampon olarak daha sonra düşük pH değerleri (yani pH <5.6) daha uygun bir tampon, test edilecek ise, kullanılmalıdır. Tampon tarifleri kolayca kullanılabilir ve bir örnek burada referans verilmiştir. 12
  3. Bir şişe üstü vakumlu filtrasyon aparatı ve yeniden kontrol tampon pH aracılığıyla yukarıda belirtilen tüm tamponları sterilize edin.
  4. % 20 oranında Triton X-100 (pozitif kontrol): Karışım 20 ml saf Triton nanopure 80 ml su içinde X-100. Şiddetle Vortex ve çözülmekte sonikasyon. Kullanımdan önce gece boyunca oda sıcaklığında bırakın.

2. Eritrositler hazırlanması

  1. Kan fr 25 ml eldepıhtılaşmayı önlemek için K 2-EDTA kaplı Vacutainer tüpler içine doğrudan çizilmiş om anonim bir insan donör,.

NOT: Tüm işlemler uygun Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK), ve Damara ve kan toplama tarafından önceden onaylanmalıdır donör riskini en aza indirmek için eğitimli bir Phlebotomist tarafından yapılmalıdır. Standart flebotomi prosedürler yerde yayımlanmamış edilmiştir. 13.

  1. 5 dk, ve hematokrit düzeyleri işareti (kırmızı, alt tabaka) ve plazma (sarımsı, üst tabaka) tüp için 500 xg'de kan santrifüjleyin.
  2. Bir mikropipet ile hafifçe plazma aspire, çamaşır suyu içine ekleyin ve biyolojik tehlikeli atık içine atın.
  3. 150 mM NaCl çözeltisi ile işaretlenmiş hattı (plazma orijinal seviyesi) hematokrit tüpü doldurun. Cap ve hafifçe karıştırmak için birkaç kez ters. 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin.
  4. Tekrar kan hücreleri yıkayın adım 2,3-2,4 tekrarlayın. Sonra supernat aspirekarınca ve pH 7.4 'de PBS ile değiştirin. Karıştırmak için Invert.
  5. Test edilecek her bir pH tekabül, eşit dört tüpler içine kan Böl. Test edilecek her bir pH (5.6, 6.2, 6.8, 7.4) 'ye göre tüp etiketleyin.
  6. 5 dakika boyunca 500 xg'de kan tüpleri santrifüjleyin. Borular üzerinde seviyeleri işaretleyin, sonra süpernatant aspire.
  7. Uygun pH (as 2.6 belirtilir) tamponu ile işaretlenmiş satırı her tüp doldurun.
  8. Etiket dört 50 ml konik tüpler (test pH başına bir), ve her konik tüp içine uygun pH PBS pipet 49 ml.
  9. Bir 1:50 seyreltme için gelen tüpe eritrositler (aynı pH) 1 ml ekleyin. Görme bulanık olmalıdır ve bozulmamış bırakılırsa razı olacak seyreltilmiş kan, kontrol edin. Hiçbir pelet formlarda, hücreler lize var.

3. Lizis Testi 96 Şey Levha Kurulumu ve Sayısallaştırma

  1. Test edilecek 20x arzu edilen nihai konsantrasyonu, bütün deneysel ilaç aktarma maddelerinin stok çözelti hazırlayın (Assayilaç dağıtım ajan 10 ul + nihai test karışımının içine orijinal ilaç dağıtım aracı bir 1/20 dilüsyon giden 190 ul seyreltilmiş kırmızı kan hücreleri,) alacaktır. 20, 100, ve 800 ug / ml 'lik Stoklar, sırasıyla 1, 5, ve 40 ug / mL, nihai deney konsantrasyonu ile sonuçlanır önerilmektedir.
  2. V-dibine her stok solüsyonu 96-kuyucuğu pipetleyin 10 ul. En iyi sonuçlar için, üç kopya halinde her bir numune yüklemek veya dört misli.

NOT: kolaylığı için, ayrı bir 96-plaka plaka başına n'deki = 3-4 yüklenen (her konsantrasyonda) Her numune ile test edilecek her pH için hazırlıklı olmak gerektiğini tavsiye edilir.

  1. Pozitif kontrol kuyuları,% 20 Triton X-100, 10 ul ilave edin.
  2. Negatif kontrol kuyuları fosfat tamponu 10 ul ilave edin. Test edilecek aynı pH tampon kullanın.
  3. Seyreltilmiş Eritrositlerin Pipet 190 ul her oyuğa (2.10 'a bakın), kalır emin hücre stok solüsyonu yapmatransfer sırasında homojen. İpucu: Bu görevi kolaylaştırmak için kullanın çok kanallı pipet.
  4. Bir saat (: orbital çalkalayıcı ya da rocker kullanın Opsiyonel) için 37 ° C'de plakaları inkübe edin.
  5. 500 pelet sağlam eritrositlere xg de 5 dakika plakaları santrifüjleyin. Not: santrifüj plaka kaldırılarak ve bir sonraki adım için taşırken, dikkatli olun ve hücre pelletini bozmaya kesin olmayacak.
  6. Bir çok kanallı pipet kullanarak, açık, düz tabanlı 96-plaka içine her kuyudan süpernatant 100 ul aktarın. Not: hücre pelletini yanlışlıkla herhangi bir numune (ler) için rahatsız ise, bir süpernatant transferi işlemlerine ardından plakayı tekrar santrifüj ve.
  7. Bir plaka okuyucu ile yüzer maddelerinin absorbansı ölçülür. Bir dalga boyu aralığı (- 541 nm ilâ 400) kullanılabilir dikkat ediniz.

NOT: Farklı plaka okuyucu farklı doygunluk noktaları ve hassasiyetleri olabilir, bu yüzden benim için bir dalga boyu seçimiasurements deterjan tedavisinin yol açtığı gibi deneysel örneklerinden hemoliz veriler güvenilir maksimum hemoliz karşı normalize edilebilir olup olmadığına bağlıdır. Bu pozitif kontrol numunelerinin absorbans değerlerinin doğru bir ölçüm gerektirir.

  1. Microsoft Excel veya benzer bir veri analiz yazılımı kullanarak, her bir pH (adım 3.4) için ayarlanmış negatif kontrol örnekleri arka absorbans ölçümleri ortalama bulabilirsiniz. Bu pH ölçüldü diğer tüm numuneler bu plan absorbans Değ.Çıkar.
  2. Arka plan çıkarma sonra, pozitif kontrol ortalama absorbans deterjan işlenmiş örnekleri (adım 3.3) bulabilirsiniz. Sonra% 100 hemoliz temsil etmelidir ki, bu ortalama absorbans değeri tüm deneysel veri noktaları normalleştirmek. Nihayet, deterjan kontrolü iyi göreli her oluştu% hemoliz hesaplamak için% 100 her iyi değeriyle çarpın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Genellikle, ideal bir pH bağımlı hemolitik davranışı gösteren ilaç ajanları, nükleik asitler ya da biyolojik olarak aktif diğer moleküllerin sitosolik teslimat için yüksek bir potansiyele sahiptir. Bu pH 7.4 'de minimal hemoliz sergiler Şekil 2'de de gösterildiği gibi, Ajan # 1 örneklediği, ama endozomal pH aralıkları (<6.5) de hemolitik davranış keskin bir artış olduğunu. Bu ajanlar hemocompatible olmayabilir ve potansiyel olarak bu konsantrasyonlarda sitotoksik olabileceğini düşündürmektedir; bazı ajanlar fizyolojik pH aralığında (Şekil 2'de 40 ug / ml 'de ajan # 2), hemolitik davranışını belirgin düzeylerde sergileyebilir.

Test maddelerinin artan konsantrasyonları özellikle (- 6.2 5.6) test edilmiş düşük pH aralıklarında, hemoliz yüksek düzeyde ile uyumlu olarak Çoğu durumda, hemoliz, ayrıca doza bağımlıdır.

"Alt =" Şekil 1 "fo: content-width =" 4in "fo: src =" / files/ftp_upload/50166/50166fig1highres.jpg "/>
Şekil 1. Hemoliz Assay şematik diyagramı. Insan eritrositleri izole edilmiş ve fizyolojik (7.4) ile geç endozomlar / lizozomlar (5.6) simüle eden tampon pH aralığı, bir dizi deneysel endosomolitik ilaç taşıyıcı maddeler ile birlikte inkübe edilir. Optimal ilaç dağıtım ajanlar fizyolojik pH'da eritrositler bozmayacak ama daha asidik koşullarda sağlam hemoliz sergileyecek. Yüzde hemoliz değerlendirmek için, çevredeki ortama hemoglobin serbest bir plaka okuyucu absorbansı ölçülür.

Şekil 2,
Şekil 2. Bir Hemoliz Testinin Temsilcisi Sonuçlar İki Deney Endos Davranışı Gösterenomolytic Ajanlar. İlk olarak, aracın bir ortalama 450 (PBS) ile kontrol bu pH değerinde, diğer test edilen numuneler çıkarıldı. Daha sonra, deney örnekleri, Triton X-100 ile tedavi edilen eritrosit numune A 450 normalize edilmiş ve% 100 ile çarpılmıştır. Bu kontrol örneklere dayanarak, eritrositler lyse deneysel transfeksiyon ajanlar yeteneği hesaplanabilir. Tipik olarak, uygun endosomolitik maddeler doza-bağımlı ve pH-bağımlı hemolitik davranışı sergilerler. İdeal ajanlar (örneğin, Ajan # 1 gibi) pH 7.4 'de minimal hemoliz, ama endozomal pH aralıkları (<6.5) de hemolitik davranış keskin bir artış gösterirler. Bazı ajanlar Bu ajanların bu konsantrasyonlarda sitotoksik olabileceğini düşündüren, fizyolojik pH aralığında (40 mg / ml 'de Ajan # 2) önemli hemolitik davranışlar sergiler. Hata çubukları 4 bağımsız ölçümler standart sapma gösterir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

endosomolitik fonksiyon için tasarlanmış pH duyarlı polimerler ya da diğer maddeler gibi hızla ve etkili bir şekilde endosome karşılaşılan pH değerlerinde kırmızı kan hücrelerinin lizisi (Şekil 1 esas taranmış olabilir; pH 6.8 - erken endosome, pH 6.2 - geç endosome, pH 5,6 - Lizozom). 14-17 pH bağımlı hemoliz biomacromolecular tedavi (örn. peptidler, siRNA, ODN'ler, proteinler) endozomal serbest arabuluculuk taşıyıcılar yeteneği taranması için kullanılır olmuştur ve bu testin sonuçları intraselüler olarak performansın habercisi olabilir ilaç teslim aracı. 3,4,8,18,19 Böylece, bu tahlil bunların pH-bağımlı membran parçalama esas hücre içi ilaç teslim aracılık etmek polimerik ilaç taşıyıcıları yeteneğini ölçmek için etkili bir ekran görüntüsünü temsil eder.

Prosedüründe belirtildiği gibi, hemoliz deneysel tedavi alyuvarların süpernatantlar spektrofotometrik ölçülmesi ile tespit edilirajanlar. Bu nedenle, hemoglobin ek olarak, bu proteinler ve karbonhidratlar da dahil olmak üzere diğer eritrosit-türevi sitosolik bileşenler içermesi muhtemeldir. Bu diğer bileşenler spektrofotometrik ölçüm sinyalinin küçük bir miktar katkıda bulunabilir,% 100 hemoliz Triton X-100 ile muamele sonucunda ortaya çıkan eritrositlerin lizat ile kalibre edilmiştir. Aynı donörden tüm eritrosit hemoglobin ve diğer biyomoleküllerin benzer düzeyde içeren varsayarsak, biz güvenle 'kirletici' bileşenleri aynı kan örneği tüm testler için kullanılan, özellikle hemoliz ölçümü için herhangi eserler katkısı yoktur sonucuna varabiliriz. Bununla birlikte, bu, herhangi bir kan verici için, kan kompozisyon ve hematokrit küçük gün için günlük varyasyonları, ve bu nedenle, iç kontrol numuneleri (adım 3,3-3,4, 3,10-3,11) olmalıdır olma olasılığı vardır olasılık vurgular Tüm deneyler için analiz edildi.

Bir de her zaman yakından ham abs incelemelidirorbance veri. Şekil 2 'de gösterilen örnekte normalize veri takdir değil de, Triton gibi deterjanlar X-100, pH ne olursa olsun, etkili bir eritrosit membran destabilize ve bir pozitif kontrol olarak numune değişkenlik için çok az örnek görmek için beklemek gerekir. Triton absorbans spektrumu X-100 bu tahlil için önerilen 400-600 nm aralığında zirve noktalarını dahil değildir, ve bu nedenle, Dahası. Deneysel verilerin normalleştirilmesi ile 20 müdahale etmemelidir Negatif kontrol örnekleri için, anlamlı bir gözlemlemek olmamalıdır (yani hatta en asidik tampon genellikle bu zaman diliminde hemoliz yaratmayan) kullanılan tamponlar herhangi 1 saat inkübasyondan sonra hemoliz. Negatif kontrol örnekleri üzerinde Arkaplan okumalar yakından yaklaşık plan absorbans okuma taze tamponlar alınması gerekirken.

İdeal olarak, araştırmacılar kendi deneyimlerini karakterize etmek için tamamlayıcı stratejiler istihdam sağlayacakrimental ilaç taşıyıcı sistemler. Hemoliz testi doğal olarak biyomembranlar üzerindeki ilk endosomolitik ajan taraması için avantajlı olduğunu, ancak sitozolik teslimat ajanların test edilmesi için ilaç dağıtım araştırmacının araçları içinde birçok araçlarından sadece biri olarak düşünülmelidir. Örneğin, hemoliz tahlil bir potansiyel eksiklik o endozomal membranlar, biyolojik bir örnek olarak kırmızı kan hücresi membran kullanmasıdır. Diğer tamamlayıcı testler çeşitli endozomal membran bileşimi ve davranışını taklit etmek için geliştirilmiştir Ancak endozomal membranların makyaj ve lipid içeriği hücre tipine göre değişir ve doğru kan hücre zarı değinmeyecek olmayabilir. 1. 21, 22 Bir alternatif floresan rezonans enerji transferi (FRET) kesmeli çevreleyen medya florofor lipozomlar ve serbest unquenched sonrasında istikrarsızlığı haline floroforlar içeren lipozomlar kullanmaktır. Çalışmalar thBu yöntemde kullanmak de unquenched floroforlar miktarının onun faydalı yük endozomal kaçış aracılık etmek için bir araç yeteneği ile ilişkili olduğu tespit edilmiştir. 21,23 Mikroskopi bazlı ölçümleri için tamamlayıcı olan bir daha güçlü fakat daha düşük hacmi yöntem sağlayabilir hemoliz testi. Örneğin, boya etiketli lizozomlar (örneğin, Life Technologies tarafından LysoTracker) ile taşıyıcı arasında ko ya da ilaç kendisi belirlemek için genel olarak, ya da ticareti yollarının (örn. pHrodo ile pH-duyarlı boyalar, konjuge taşıyıcı ya da ilaç ile karakterize edilebilir Life Technologies). 24-26

Bir endosomolitik dağıtım sistemi sitozolik kargo ulaşmak için teyit edildikten sonra, hemoliz testi de endozomal kaçış oluşur hangi aracılığıyla mekanizması hakkında bilgi verebilir. Örneğin, polietilenimin dayalı gen dağıtım araçları (PEI) fosfolipid membran bozacak bir doğal yetenek eksikliğinötr veya asidik pH. 11,27 yerine de, PEI bir 'proton sünger' etkisi ile sitozolik gen aktarımı sağlıyor. Uluslararasılaşma sonra, PEI bu bölmelerin asitlemek için endozomal zarından pompalanan "emici" protonlar tarafından endosome arabelleğe alır. Sonuç olarak, bu endosome içinde aşırı proton ve bunların karşı iyonlarının oluşumuna yol açar. Ozmotik basınç, su akışı, vezikül şişlik ve endosomolysis bir artış ile sonuçlanır. Bu nedenle, proton sünger etkisi başarısını bir endosome içine PEI kritik konsantrasyon birikimi gerektirmektedir. 'Proton sünger' etkisi ile endozomal kesinti ulaşmak 27 Teslim araçlarda fiziksel ulaşmada kırmızı kan hücreleri veya lipozomlar, ve onların etkinliğini bozmayacak intrasellüler ilaç dağıtım ozmotik basınç hesaplamaları aracılığıyla değerlendirilir, ya da in vitro mikroskopi veya işlevsel çalışmalar olmalıdır.

Sonuç olarak, burada açıklanan tahlil hemolizbiyolojik ilaç hücre içi teslimatı için tasarlanmış farmasötik ajanlar taranması için güvenilir bir modeldir. Bu testte hücre içi hedefleri ile biyolojik teslim formülasyonların hızlı gelişme sağlayan, ilaç taşıyıcı araç tarama yüksek bir verimlilik aracı sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

IRB onayı: İnsan denekleri Usul Vanderbilt Üniversitesi Kurumsal İnceleme Kurulu (KİK; Protokolü # 111251) tarafından onaylanmıştır. Çıkar çatışması ilan etti.

Acknowledgments

Yazarlar Savunma Bakanlığı aracılığıyla Congressionally Yönetmen Tıbbi Araştırma Programları (# W81XWH-10-1-0445), Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH R21 HL110056) ve Amerikan Kalp Derneği (# 11SDG4890030) finanse edersiniz.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes Fisher Scientific 22-253-145 For blood collection
BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge Fisher Scientific 02-665-31 For blood collection
BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter Fisher Scientific 22-289-953 For blood collection
BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs Fisher Scientific 13-680-63 For blood collection
BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet Fisher Scientific 02-657-6 For blood collection
Hydrochloric acid (conc.) Fisher Scientific A144-500 For adjustment of pH of D-PBS.
Triton X-100 Sigma-Aldrich T8787 Positive control
Dulbecco's PBS Invitrogen 14190
Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane Fisher Scientific 09-740-44A
BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene Fisher Scientific 08-772-2C For plate-reading at the end of the assay.
BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene Fisher Scientific 08-772-17 For incubation of red blood cells with experimental agents.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th, Garland Science. (2002).
  2. Boasson, E. H. On the Bacteriolysis by Lysozyme. The Journal of Immunology. 34, 281-293 (1938).
  3. Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
  4. Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
  5. Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
  6. Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
  7. Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
  8. Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
  9. Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
  10. Behr, J. -P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
  11. Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. Data for Biochemical Research. , 3rd, Oxford University Press. (1986).
  12. Ernst, D. J. Applied Phlebotomy. , 1st, Lippincott Williams & Wilkins. (2005).
  13. Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
  14. Lackey, C. A., et al. Hemolytic Activity of pH-Responsive Polymer-Streptavidin Bioconjugates. Bioconjugate Chemistry. 10, 401-405 (1999).
  15. Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
  16. Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
  17. Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
  18. Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
  19. Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
  20. Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
  21. Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
  22. Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
  23. Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
  24. Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).

Tags

İmmünoloji Sayı 73 Hücresel Biyoloji Tıp Biyomedikal Mühendisliği Biyomühendislik Kanser Biyolojisi Moleküler Biyoloji Eritrositler Endosomlar Küçük Müdahale RNA Gen Tedavisi Nanotıp Gen teslimat Nanopartiküller endosome Escape Hücre içi Ticareti Sitozolik İlaç Taşıyıcı kırmızı Kan hücreleri tahlil
Biomacromolecular Uyuşturucu Sitozolik Teslimat için pH-duyarlı endosomolitik Ajanlar değerlendirilmesi için <em>Ex Vivo</em> Kırmızı Kan Hücresi Hemoliz Testi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Evans, B. C., Nelson, C. E., Yu, S.… More

Evans, B. C., Nelson, C. E., Yu, S. S., Beavers, K. R., Kim, A. J., Li, H., Nelson, H. M., Giorgio, T. D., Duvall, C. L. Ex Vivo Red Blood Cell Hemolysis Assay for the Evaluation of pH-responsive Endosomolytic Agents for Cytosolic Delivery of Biomacromolecular Drugs. J. Vis. Exp. (73), e50166, doi:10.3791/50166 (2013).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter