Summary
Un saggio di emolisi può essere usato come un rapido, ad alta resa di schermo citocompatibilità sistemi di rilascio di farmaci e l'attività endosomolytic per la consegna del carico intracellulare. Il saggio misura la rottura di membrane eritrocitarie in funzione del pH.
Abstract
Doppi strati di fosfolipidi che costituiscono endo-lisosomiale vescicole possono rappresentare un ostacolo alla consegna di farmaci biologici a bersagli intracellulari. Per superare questo ostacolo, una serie di trasportatori di farmaci sintetici sono stati progettati per interrompere attivamente la membrana endosomiale e consegnare cargo nel citoplasma. Qui, descriviamo il saggio emolisi, che può essere usato come un rapido, ad alta resa per la schermata citocompatibilità e attività endosomolytic dei sistemi intracellulari drug delivery.
Nel saggio emolisi, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che imitano extracellulari, endosomali precoce e tardiva endo-lisosomiali ambienti. A seguito di una fase di centrifugazione a pellet intatti cellule rosse del sangue, la quantità di emoglobina rilasciata nel terreno viene misurata spettrofotometricamente (405 nm per migliore dinamica). Il rosso per cento rottura delle cellule del sangue viene poi quantificato rispetto al controllo positivo samples lisate con un detergente. In questo sistema modello la membrana eritrocitaria funge da surrogato per la membrana lipidica a due strati che racchiudono endo-lisosomiale vescicole. Il risultato desiderato è emolisi trascurabile a pH fisiologico (7,4) ed emolisi robusta in endo-lisosomiale intervallo di pH da circa pH 5-6,8.
Introduction
Sebbene vi siano molti potenziali obiettivi terapeutici impatto elevato all'interno della cellula, la consegna intracellulare di agenti rappresenta una sfida significativa. Spesso, i farmaci biologici, in particolare, vengono internalizzati dalle cellule e trafficata in vescicole che o portare al degrado del loro contenuto tramite l'endo-lisosomiale via, o vengono trasportati indietro fuori dalla cellula tramite esocitosi. 1 In quest'ultimo processo, il pH interno delle vescicole viene acidificata a circa 5-6, che è il pH ottimale per l'attività di enzimi che funzionano in questo vano, ad esempio il lisozima. 2
Recentemente, un certo numero di materiali sono stati specificamente progettati per sfruttare l'acidificazione di endosomi per facilitare l'erogazione citosolico del loro carico. Un esempio di questo approccio utilizza nanoparticelle polimeriche sintetiche, micelle cui anima è zwitterionici e carica neutra a pH fisiologico (cioè 7,4). Tuttavia, a pH 6,0- 6,5, i polimeri diventano protonati e acquisire una carica positiva netta che destabilizza il nucleo micelle, e segmenti polimerici esposti interagire e distruggere la membrana endosomiale. Questa attività è stato dimostrato per promuovere la fuga endosomiale di peptidi e acido nucleico-terapie basate, consentendo loro di accedere ai bersagli citosolico. 3,4 Altri esempi di metodi sviluppati per mediare fuga endosomiale che distruggere la barriera membrana includono 'fusogenico' peptidi o proteine che possono mediare la fusione della membrana o transitoria formazione di pori nel doppio strato fosfolipidico. 5 omopolimeri di acidi acrilici anionici alchile come acido poli (propylacrylic) sono un altro approccio ben studiato, e in questi polimeri, lo stato di protonazione di acido carbossilico detta sospensione transizione in una idrofobica, membrana dirompente stato in endo-lisosomiale intervalli di pH. 6,7
Un sistema modello utile per lo screening di comportamento endosomolytic è l'indirizzox pH-dipendente vivo dosaggio emolisi. 8 In questo sistema modello, la membrana eritrocitaria serve come un surrogato della membrana a doppio strato lipidico che racchiudono endo-vescicole lisosomiali. Questo modello generalizzabile è stato utilizzato da altri per valutare il comportamento endosomolytic di penetrazione cellulare peptidi e altri sistemi polimerici consegna del gene. 8-11 In questo esperimento, globuli rossi umani e materiali di prova sono co-incubate in tampone a pH definiti che mimano extracellulari (7.4), precoce endosomali (6.8), e la fine del endo-lisosomiale (<6.8) ambienti. La quantità di emoglobina rilasciata durante il periodo di incubazione è quantificato come misura di lisi dei globuli rossi, che viene normalizzato alla quantità di emoglobina rilasciata in campioni di controllo positivi lisate con un detergente.
Da screening di una piccola libreria di materiali di prova potenzialmente endosomolytic, si può dedurre che i campioni che non producono emolisi a pH 7.4, ma orlo significativamente elevatiolysis a pH <6.5, saranno i candidati più efficaci e cytocompatible per la consegna della droga citosolico. Materiali che soddisfano questi criteri dovrebbe rimanere inerte e non indiscriminatamente distruggere le membrane a doppio strato lipidico (cioè che potrebbe causare citotossicità) fino ad essere esposto ad una diminuzione del pH locale dopo interiorizzazione in endo-compartimenti lisosomiali.
In questo protocollo, eritrociti sono isolati da un donatore umano e co-incubate a pH 5,6, 6,2, 6,8, 7,4 o con agenti farmaci sperimentali endosomolytic consegna. Eritrociti intatti sono pellettizzati, ei surnatanti (contenenti emoglobina rilasciata da eritrociti lisati) vengono analizzati per l'assorbanza caratteristica di emoglobina mediante un lettore di piastre (Figura 1).
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Protocol
1. Preparazione e sterilizzazione di buffer e agenti di test
- 150 mM NaCl tampone: sciogliere 4,383 g di cristalli di NaCl in 500 ml di acqua Nanopure.
- Buffer pH: Preparare tamponi fosfato a pH 5.6, 6.2, 6.8, e 7.4 mescolando quantità appropriate di monobasico e sodio fosfato bibasico. Se i campioni devono essere sottoposti a valori di pH più bassi (pH <5.6) poi un buffer più appropriato, come il tampone citrato, dovrebbe essere usato. Ricette del buffer sono facilmente disponibili, e un esempio di riferimento è stato fornito qui 12.
- Sterilizzare tutti i buffer notato in precedenza attraverso una bottiglia-top gli aspiratori per filtrazione e ricontrollare tampone di pH.
- 20% Triton X-100 (controllo positivo): Mescolare 20 ml puro Triton X-100 in 80 ml di acqua Nanopure. Vortex vigorosamente e ultrasuoni per sciogliere. Lasciare a temperatura ambiente per una notte prima dell'uso.
2. Preparazione di eritrociti
- Ottenere 25 ml di sangue from un donatore anonimo umano, disegnato direttamente in K 2-EDTA rivestite vacutainer per prevenire la coagulazione.
NOTA: Tutte le procedure devono essere pre-approvato dal Consiglio appropriata revisione istituzionale (IRB) e prelievo venoso e raccolta del sangue deve essere eseguita da un flebotomo addestrato al fine di minimizzare il rischio per il donatore. Procedure standard di flebotomia sono stati pubblicati altrove 13.
- Centrifugare il sangue a 500 xg per 5 minuti, ed i livelli di ematocrito marchio (rosso, strato inferiore) e plasma (giallo, strato superiore) sul tubo.
- Aspirare delicatamente plasma tramite una micropipetta, aggiungere in candeggina, e gettare in rifiuti a rischio biologico.
- Riempire tubo di ematocrito alla linea marcata (livello iniziale del plasma) con 150 mM di soluzione di NaCl. Chiudere e capovolgere un paio di volte per mescolare delicatamente. Centrifugare a 500 xg per 5 min.
- Ripetere il passaggio 2,3-2,4 per lavare le cellule del sangue di nuovo. Poi aspirare Supernatformica e sostituirlo con PBS a pH 7,4. Capovolgere per miscelare.
- Dividere il sangue in modo uniforme in quattro tubi, corrispondente a ciascun pH che sarà testato. Etichettare i tubi secondo ognuna pH da testare (5,6, 6,2, 6,8, 7,4).
- Centrifugare provette a 500 xg per 5 min. Segna i livelli su tubi, quindi aspirare il surnatante.
- Riempire ogni provetta di linea contrassegnata con tampone di pH adeguato (come indicato in 2.6).
- Etichettare quattro provette da 50 ml coniche (uno per pH a test), e pipettare 49 ml di PBS a pH appropriato in ciascuna provetta conica.
- Aggiungere 1 ml di eritrociti (pH stesso) nel tubo corrispondente per una diluizione 1:50. Ispezionare visivamente il sangue diluito, che deve essere torbida e si sistemerà, se lasciati indisturbati. Se nessuna forma di pellet, le cellule sono lisate.
3. Lysis Assay 96 pozzetti Piastra di supporto e di quantificazione
- Preparare soluzioni di base di tutti gli agenti sperimentali di consegna della droga, a 20 volte la concentrazione finale desiderata da sottoporre a prova (testavrà 10 ml di agente di consegna della droga + 190 ul cellule rosse del sangue diluito, che portano ad una diluizione 1/20 di un agente originale di somministrazione di farmaci in miscela di prova finale). Stock di 20, 100, e 800 pg / ml sono suggeriti, risultante in concentrazioni finali di 1, 5, e 40 pg / ml, rispettivamente.
- Pipettare 10 ml di ciascuna soluzione madre in fondo a V da 96 pozzetti. Per ottenere risultati ottimali, caricare ciascun campione in triplicato o quadruplicato.
NOTA: per facilità, si raccomanda una distinta piastra a 96 pozzetti deve essere preparato per ciascun pH da testare, con ciascun campione (per ogni concentrazione) caricato con n = 3-4 per piastra.
- Per pozzetti di controllo positivi, aggiungere 10 ml di 20% Triton X-100.
- Per i pozzetti di controllo negativo, aggiungere 10 ml di tampone fosfato. Utilizzare tampone al pH stesso da testare.
- Dispensare 190 ml di eritrociti diluiti (vedi 2.10) in ogni pozzetto, assicurandosi soluzione madre cella rimaneomogenea durante il trasferimento. Suggerimento: Utilizzare pipetta multicanale per semplificare questo compito.
- Incubare le piastre a 37 ° C per un'ora (Opzionale: Utilizzare un agitatore orbitale o rocker).
- Centrifugare piastre per 5 min a 500 xg per eritrociti pellet intatti. Nota: quando si rimuove la placca dalla centrifuga e il trasporto al passo successivo, maneggiare con cura ed essere certi di non disturbare il pellet.
- Usando una pipetta multicanale, trasferire 100 pl di surnatante da ciascun pozzetto in una chiara, a fondo piatto da 96 pozzetti. Nota: se il pellet cellulare è accidentalmente disturbato per ogni campione (s), si può ri-centrifugare la piastra e quindi procedere con il trasferimento supernatante.
- Misurare assorbanza di supernatanti con un lettore di piastre. Si noti che un intervallo di lunghezze d'onda possono essere utilizzati (400-541 nm).
NOTA: lettori di piastre diverse possono avere punti di saturazione e sensibilità diverse, in modo che la scelta di una lunghezza d'onda per measurements dipende se i dati di emolisi campioni sperimentali può essere normalizzati affidabile contro emolisi massima indotta dal trattamento detergente. Questo richiede una misurazione precisa valori di assorbanza dei campioni di controllo positivi.
- Utilizzo di Microsoft Excel o un simile software di analisi dei dati, trovare la media delle letture di assorbanza lo sfondo da campioni di controllo negativo create per ogni pH (punto 3.4). Sottrarre questo valore assorbanza di fondo da tutti gli altri campioni che sono stati misurati in quel pH.
- Dopo sottrazione del fondo, trovare l'assorbanza media del controllo positivo detergente trattati con campioni (punto 3.3). Poi normalizzare tutti i punti dati sperimentali a questo valore medio di assorbanza, che dovrebbe rappresentare il 100% emolisi. Infine, moltiplicare ogni valore ben del 100% per calcolare emolisi% che si è verificato in ogni singolo pozzetto rispetto al controllo detergente.
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Representative Results
In genere, gli agenti che presentano ideale pH-dipendente comportamento emolitica hanno il più alto potenziale per la consegna citosolico di farmaci, acidi nucleici, o altre molecole bioattive. Questo è esemplificato da Agent # 1 come rappresentato in figura 2, che presenta emolisi minima a pH 7,4, ma un forte aumento comportamento emolitica a intervalli di pH endosomiali (<6,5). Alcuni agenti possono esibire livelli significativi di comportamento emolitica a intervalli di pH fisiologici (Agente # 2 a 40 pg / ml; Figura 2), suggerendo che questi agenti non possono essere emocompatibilità e potrebbe potenzialmente essere citotossici a queste concentrazioni.
Nella maggior parte dei casi, emolisi è dose-dipendente, come concentrazioni crescenti dei materiali di prova corrispondono con alti livelli di emolisi, soprattutto a valori di pH più bassi studiati (5,6-6,2).
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Figura 1. Diagramma schematico di rosso saggio emolisi Globulo. Eritrociti umani sono isolati e incubati con gli agenti di droga sperimentali endosomolytic di consegna in una serie di buffer che simulano l'intervallo di pH da fisiologici (7.4) per endosomi tardivi / lisosomi (5.6). Gli agenti ottimali di somministrazione di farmaci non ostacolerà la eritrociti a pH fisiologico, ma sarà presente emolisi robusta in condizioni più acide. Per valutare emolisi cento, il rilascio di emoglobina nel mezzo circostante viene misurata tramite assorbanza su un lettore di piastre.
Figura 2. Rappresentante dei risultati di un test emolisi Dimostrazione comportamento di due Endos sperimentaliAgenti omolytic. Innanzitutto, la media A 450 del veicolo (PBS) è stata sottratta dagli altri campioni testati in quel pH. Successivamente, i campioni sperimentali sono stati normalizzati alla A 450 campioni di Triton X-100 eritrociti trattati e moltiplicato per 100%. Sulla base di questi campioni di controllo, la capacità di agenti di trasfezione sperimentali per lisare gli eritrociti può essere calcolato. In genere, ideali agenti endosomolytic esporre dose-dipendente e pH-dipendente comportamento emolitica. Ideale agenti (ad esempio Agent # 1) presentano emolisi minimo a pH 7.4, ma un forte aumento dei comportamenti emolitica a intervalli di pH endosomali (<6.5). Alcuni agenti mostrano sostanziale comportamento emolitica a intervalli di pH fisiologici (Agente # 2 a 40 pg / ml), suggerendo che questi agenti possono essere citotossici a queste concentrazioni. Le barre di errore indicano la deviazione standard di 4 misurazioni indipendenti.
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Discussion
pH-sensibili polimeri o altri agenti destinati endosomolytic funzione può essere rapidamente ed efficacemente proiettato sulla base di lisi dei globuli rossi a pH incontrate in endosomi (Figura 1; pH 6,8 - endosoma precoce, pH 6,2 - endosoma tardi, pH 5,6 - lisosoma). 14-17 pH-dipendente emolisi è stato utilizzato per schermare la capacità dei vettori di mediare endosomal rilascio di peptidi terapeutici biomacromolecular (ad esempio, siRNA, ODN, proteine), ed i risultati di questa analisi può essere predittiva di performance come intracellulare consegna veicolo farmaco. 3,4,8,18,19 Pertanto, questo test rappresenta un efficace schermo per misurare la capacità dei trasportatori di farmaci polimerici per mediare immissione intracellulare farmaco basato sulla loro pH-dipendente interruzione membrana.
Come osservato nella procedura, emolisi viene rilevata mediante misurazione spettrofotometrica dei supernatanti di globuli rossi trattati con sperimentaleagenti. Pertanto, oltre a emoglobina, esso può contenere altri componenti citosolici eritrociti derivati, comprese le proteine e carboidrati. Mentre questi altri componenti possono contribuire una piccola quantità di segnale per la misurazione spettrofotometrica, emolisi 100% è stato calibrato al lisato eritrociti risultante dal trattamento con Triton X-100. Supponendo eritrociti tutti dallo stesso donatore contengono livelli simili di emoglobina e di altre biomolecole, possiamo concludere con sicurezza che il 'contaminanti' componenti non contribuirà eventuali artefatti alla misurazione emolisi, soprattutto se il campione di sangue viene utilizzato lo stesso per tutte le prove. Tuttavia, questo mette in evidenza la possibilità che, per ogni donatore di sangue dato, ci sono probabilità di essere piccoli giorno per giorno le variazioni nella composizione del sangue e dell'ematocrito, e quindi, campioni di controllo interno (passi 3,3-3,4, 3,10-3,11) dovrebbero essere analizzati per tutti gli esperimenti.
Si dovrebbe anche sempre in attento esame la prima absdati orbance. Anche se non può essere apprezzato nei dati normalizzati di esempio mostrato nella Figura 2, detergenti come Triton X-100 efficace destabilizzare membrane eritrocitarie indipendentemente pH, e si dovrebbe aspettare di vedere campione molto piccolo campione di variabilità nei controlli positivi. Lo spettro di assorbanza di Triton X-100 non comprende picchi nell'intervallo 400-600 nm raccomandato per questo saggio, e pertanto, non dovrebbe interferire con la normalizzazione dei dati sperimentali. 20 Inoltre, per i campioni di controllo negativo, non si dovrebbe osservare significativa emolisi dopo l'incubazione 1 ora in qualsiasi dei buffer utilizzati (cioè anche il tampone più acida non generano tipicamente emolisi su questo periodo). Letture di sfondo sui campioni di controllo negativo deve seguire da vicino approssimativi letture di assorbanza di fondo dato seguito alle tamponi freschi.
Idealmente, i ricercatori utilizzano strategie complementari per caratterizzare il loro esperienzerimental Drug Delivery Systems. Il saggio emolisi è vantaggioso per lo screening iniziale agente endosomolytic sulla presenti naturalmente biomembrane, ma dovrebbe essere considerato solo come uno dei tanti strumenti in armamentario del ricercatore di consegna farmaco per il test di agenti di consegna citosoliche. Ad esempio, un difetto potenziale del saggio emolisi è che utilizza la membrana globuli rossi come modello biologico per membrane endosomali. Tuttavia, il contenuto di make-up e lipidica delle membrane endosomal varia dal tipo cellulare e non può essere accuratamente ricapitolato dalla membrana cellulare del sangue. 1 Una varietà di altri saggi complementari, sono stati sviluppati per imitare composizione endosomiale membrana e comportamento. 21, 22 Una alternativa è quella di utilizzare liposomi contenenti fluorescenza di trasferimento di energia di risonanza (FRET)-fluorofori temprati, che diventano inappagata destabilizzazione seguito dei liposomi e di rilascio dei fluorofori a mezzo circostante. In th studiad assumere questo metodo, la quantificazione dei fluorofori unquenched è stato trovato in correlazione con la capacità di un veicolo per mediare fuga endosomal del suo carico. 21,23 Microscopia misurazioni basate possono fornire un metodo più robusto ma inferiore throughput che è complementare l'emolisi dosaggio. Ad esempio, è comune per valutare colocalizzazione del vettore o farmaco stesso con colorante etichettati lisosomi (es. LysoTracker da Life Technologies), o le vie di traffico possono essere caratterizzati mediante pH-sensibile coloranti coniugato del vettore o farmaco (ad esempio da pHrodo Life Technologies). 24-26
Una volta che un sistema di consegna endosomolytic è stata confermata per raggiungere consegna citosolica carico, il saggio emolisi può anche fornire informazioni sul meccanismo attraverso cui si verifica fuga endosomiale. Per esempio, i veicoli di consegna del gene basato su polietilenimmina (PEI) manca una capacità intrinseca di perturbare membrane fosfolipidichea casa di pH neutro o acido. 11,27, invece, raggiunge la consegna PEI citosolico gene attraverso un effetto 'spugna protone'. Dopo l'internalizzazione, PEI buffer dell'endosoma da "assorbire" i protoni che vengono pompati attraverso la membrana degli endosomi ad acidificare i diversi compartimenti. Alla fine, questo porta alla formazione di protoni in eccesso e le loro contro-ioni all'interno degli endosomi. Ciò si traduce in un aumento della pressione osmotica, afflusso dell'acqua, gonfiore vescicolare, e endosomolysis. Pertanto, il successo di effetto spugna protone richiede l'accumulo di una massa critica di PEI in un endosomi. Consegna 27 veicoli che ottengono interruzione endosomiale attraverso l'effetto 'protone spugna' non disturbare fisicamente globuli rossi o liposomi, e la loro efficacia nel raggiungimento somministrazione di farmaci intracellulare deve essere valutato attraverso il calcolo della pressione osmotica, o in microscopia vitro, o studi funzionali.
In conclusione, il saggio qui descritti emolisiè un modello affidabile per lo screening di agenti farmaceutici progettati per immissione intracellulare di farmaci biologici. Questo test fornisce un mezzo di screening ad alto rendimento veicolo di consegna della droga, consentendo il rapido sviluppo di formulazioni in grado di offrire prodotti biologici con bersagli intracellulari.
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Disclosures
IRB di approvazione: Procedure che coinvolgono soggetti umani sono stati approvati dal Comitato di Revisione Vanderbilt University Consiglio Istituzionale (IRB; protocollo # 111251). Nessun conflitto di interessi dichiarati.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono il finanziamento attraverso il Dipartimento della Difesa dal Congresso Regia programmi di ricerca medica (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056), e American Heart Association (# 11SDG4890030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
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