Summary
En hemolys analys kan användas som en snabb, hög genomströmning skärm av läkemedelsavgivningssystem "cytocompatibility och endosomolytic aktivitet för intracellulär leverans last. Analysen mäter störningar i erytrocytmembran som en funktion av miljön pH.
Abstract
Fosfolipid dubbelskikt som utgör endo-lysosomala vesikler kan utgöra ett hinder för leverans av biologiska läkemedel till intracellulära mål. För att övervinna detta hinder, har ett antal syntetiska läkemedelsbärare konstruerats för att aktivt störa det endosomala membranet och leverera gods in i cytoplasman. Här beskriver vi den hemolys analys, som kan användas som en snabb, hög genomströmning skärm för cytocompatibility och endosomolytic aktivitet av intracellulära läkemedelsavgivningssystem.
I hemolys analysen är humana röda blodkroppar och material testa saminkuberas i buffertar vid definierade pH-värden som efterliknar extracellulära, tidig endosomala, och sen endo-lysosomala miljöer. Efter ett centrifugeringssteg för att pelletera intakta röda blodkroppar, är mängden hemoglobin frigjort i mediet spektrofotometriskt uppmätta (405 nm för bästa dynamikområde). Den procentuella röda blodkroppar störningar sedan kvantifieras i förhållande till positiv kontroll SAMPles lyseras med rengöringsmedel. I detta modellsystem erytrocyt membranet fungerar som ett surrogat för lipidbiskiktmembranet som innesluter endo-lysosomala vesiklar. Det önskade resultatet är försumbar hemolys vid fysiologiskt pH (7,4) och robust hemolys i endo-lysosomala pH-område från ca pH 5-6,8.
Introduction
Även om det finns många potentiella stor genomslagskraft terapeutiska mål inuti cellen, utgör den intracellulära tillförsel av medel en stor utmaning. Ofta är läkemedel, särskilt biologiska, internaliseras av celler och smugglas in vesiklar som antingen leder till nedbrytning av deras innehåll genom endo-lysosomala vägen, eller pendlade tillbaka ut ur cellen via exocytos. 1 I den senare processen, den inre pH av vesiklarna surgöres till ca 5-6, vilket är det optimala pH för aktivitet av enzymer som fungerar i denna avdelning, såsom lysozym. 2
Nyligen har ett antal material har utvecklats särskilt för att utnyttja försurning av endosomer att underlätta cytosoliskt leverans av sin last. Ett exempel på detta tillvägagångssätt använder syntetiska, polymermicell nanopartiklar vars kärna är zwitterjoniska och laddnings-neutralt vid fysiologiskt pH (dvs 7,4). Emellertid, vid pH 6,0- 6,5, blir polymererna protoneras och förvärva en positiv nettoladdning som destabiliserar micellen kärnan, och de exponerade polymersegmenten interagerar med och störa det endosomala membranet. Denna verksamhet har visat sig främja endosomala flykten av peptid och nukleinsyra-baserade läkemedel, så att de kan komma åt sina cytosoliska mål. Inkluderar "fusogena" peptider eller 3,4 Andra exempel på metoder som utvecklats för att förmedla endosomal flykt som stör membranet barriären proteiner som kan mediera membranfusion eller övergående porbildning i fosfolipid dubbelskiktet. 5 Homopolymerer av anjoniska alkyl akrylsyror såsom poly (propylacrylic syra) är en annan väl studerade strategi, och i dessa polymerer, dikterar protonering tillstånd vidhängande karboxylsyra övergång till ett hydrofobt, membran-störande tillstånd i endo-lysosomala pH-områden. 6,7
En användbar modell för screening endosomolytic beteende är eX vivo pH-beroende hemolys analys. 8 I denna modell system tjänar erytrocyt membran som ett surrogat för lipidbiskiktmembranet som omsluter endo-lysosomala vesikler. Denna generaliserbar modell har använts av andra för att utvärdera endosomolytic beteende cellpenetrerande peptider och andra polymera gen leveranssystem. 8-11 I detta experiment humana röda blodkroppar och material testa är saminkuberas i buffertar vid definierade pH-värden som efterliknar extracellulära (7,4), tidig endosomala (6,8), och sen endo-lysosomala (<6,8) miljöer. Mängden hemoglobin frigörs under inkubationsperioden kvantifieras som ett mått på röda blodkroppar lys, som normaliseras till mängden hemoglobin frigörs i positiva kontrollprover lyserade med en detergent.
Från screening ett litet bibliotek av potentiellt endosomolytic testmaterial, kan en dra slutsatsen att prover som producerar ingen hemolys vid pH 7,4, men signifikant förhöjd fållolysis vid pH <6,5, kommer att vara de mest effektiva och cytocompatible kandidater för cytosoliskt drug delivery. Material som passar dessa kriterier skulle förväntas förbli inert och inte urskillningslöst förstör lipiddubbelskikts membran (dvs. som kan orsaka cytotoxicitet) tills att utsättas för en nedgång i den lokala pH-efter internalisering i endo-lysosomala fack.
I detta protokoll används erytrocyter isolerade från en human donator och sam-inkuberas vid pH 5,6, 6,2, 6,8 eller 7,4 med experimentella endosomolytic ämnen drug delivery. Intakta erytrocyter pelleteras, och supernatanterna (innehållande hemoglobin frigörs från lyserade erytrocyter) analyseras för karakteristiska absorbans av hemoglobin genom en plattläsare (figur 1).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Beredning och Sterilisering av Buffertar och ombud Test
- 150 mM NaCl-buffert: Lös 4,383 g NaCl kristaller i 500 ml nanorent vatten.
- pH-buffertar: Förbered fosfatbuffertar vid pH 5,6, 6,2, 6,8, och 7,4 genom att blanda lämpliga mängder av monobasiskt och dibasiskt natriumfosfat. Om proverna ska testas vid lägre pH-värden (dvs. pH <5,6) sedan en mer lämplig buffert, såsom citratbuffert, bör användas. Buffer recept är lätt tillgängliga, och ett exempel referens har lämnats här. 12
- Sterilisera alla buffertar som angivits ovan genom en flaska-topp vakuumfiltrering apparater och åter kontrollera buffert pH-värden.
- 20% Triton X-100 (positiv kontroll): Blanda 20 ml ren Triton X-100 i 80 ml nanorent vatten. Skaka kraftigt och sonikera att lösa. Lämna vid rumstemperatur över natten före användning.
2. Framställning av Erytrocyter
- Erhålla 25 ml blod frOM en anonym mänsklig donator, dras direkt till K 2-EDTA-belagda Vacutainer rör för att förhindra koagulering.
OBS: Alla procedurer måste i förväg godkännas av lämpliga institutionella Review Board (IRB), och venpunktion och blodinsamling måste utföras av en utbildad phlebotomist för att minimera risken för donatorn. Standard flebotomi förfaranden har publicerats på annat håll. 13
- Centrifugera blod vid 500 x g under 5 minuter, och nivåer varumärkesrätten i hematokrit (röd, nedre skikt) och plasma (gulaktig, övre skiktet) på röret.
- Sug plasma försiktigt via en mikropipett, lägga in blekmedel, och kasta in biologiskt avfall.
- Fyll hematokrit röret märkt linje (ursprunglig nivå av plasma) med 150 mM NaCl-lösning. Cap och skaka försiktigt blanda. Centrifugera vid 500 x g under 5 minuter.
- Upprepa steg 2,3-2,4 att tvätta blodceller igen. Sedan aspirera supernatant och ersätt med PBS vid pH 7,4. Invertera att blanda.
- Split blod jämnt i fyra rör, vilket motsvarar varje pH som kommer att testas. Märk rören enligt varje pH som skall testas (5,6, 6,2, 6,8, 7,4).
- Centrifugera blod rören vid 500 xg under 5 minuter. Markera nivåer på rör, sedan aspirera supernatanten.
- Fyll varje rör till märkt linje med buffert av lämpligt pH (såsom indikeras i 2,6).
- Etikett fyra 50 ml koniska rör (en per pH till test), och pipett 49 ml PBS av lämpligt pH i varje koniskt rör.
- Tillsätt 1 ml av erytrocyter (samma pH) till motsvarande rör för en 1:50 spädning. Granska det utspädda blodet, vilket bör grumlig och kommer att bosätta om de lämnas orörda. Om inga pellets former, har celler lyserades.
3. Lysanalys 96 brunnar Setup och kvantifiering
- Bered stamlösningar av alla experimentella ämnen drug delivery, vid 20x önskade slutliga koncentrationen som ska testas (analystar 10 pl läkemedel levererande medel + 190 pl utspädda röda blodkroppar, vilket leder till en 1/20 spädning av den ursprungliga läkemedelstillförsel medlet i den slutliga testblandningen). Lagren av 20, 100, och 800 pg / ml föreslås, resulterar i slutliga testkoncentrationer av 1, 5, och 40 ng / ml, resp.
- Pipettera 10 | il av varje stamlösning i V-botten 96-brunnars plattor. För bästa resultat, ladda varje prov tre gånger eller fyra exemplar.
OBS: För att underlätta rekommenderas att en separat 96-brunnsplatta bör upprättas för varje pH som skall testas med varje prov (vid varje koncentration) lastas vid n = 3-4 per platta.
- För positiva kontrollbrunnarna, tillsätt 10 pl 20% Triton X-100.
- För negativa kontrollbrunnarna, tillsätt 10 pl fosfatbuffert. Använd buffert vid samma pH som skall testas.
- Pipettera 190 | il utspädda erytrocyter (se 2,10) till varje brunn och se lösningen cell lager förblirhomogen under överföringen. Tips: Använd flerkanaligt pipett för att förenkla denna uppgift.
- Inkubera plattorna vid 37 ° C i en timme (Valfritt: Använd en orbitalskakare eller rocker).
- Centrifugera plattor för 5 min vid 500 xg för att pelletera intakta erytrocyter. Obs: När du tar bort plattan från centrifugen och transportera det till nästa steg, hantera varsamt och vara säker att inte störa cellpelleten.
- Med hjälp av en flerkanalig pipett, överför 100 pl av supernatant från varje brunn till en klar, flatbottnad 96-brunnsplatta. Obs: om cellpelleten av misstag störd för ett prov (er), kan en re-centrifugera plattan och fortsätt sedan med supematant överföring.
- Mät absorbansen hos supernatanterna med en plattläsare. Observera att ett våglängdsområde kan användas (400 - 541 nm).
OBS: Olika plattor läsare kan ha olika mättnad punkter och känslighet, så valet av en våglängd för migasurements beror på huruvida hemolys data från experimentella prover tillförlitligt kan normaliseras mot maximal hemolys som induceras av rengöringsmedel behandling. Detta kräver noggrann mätning av absorbansvärden för de positiva kontrollprover.
- Använda Microsoft Excel eller liknande dataanalys programvara, hitta medelvärdet av värdena bakgrundsabsorbansen från de negativa kontrollprover som inrättats för varje pH (steg 3,4). Subtrahera detta värde bakgrundsabsorbansen från alla andra prover som mättes vid detta pH.
- Efter bakgrundssubtraktion, hitta den genomsnittliga absorbansen för den positiva kontrollen tvättmedel behandlade prover (steg 3,3). Sedan normalisera alla experimentella data pekar på detta medelabsorbansvärdet, vilket bör utgöra 100% hemolys. Slutligen, multiplicera varje brunn värde med 100% för att beräkna% hemolys som inträffade i varje individuell brunn relativt tvättmedel kontrollen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Typiskt medel som uppvisar ideala pH-beroende hemolytisk beteende har den högsta potentialen för cytosoliskt leverans av läkemedel, nukleinsyror eller andra bioaktiva molekyler. Detta exemplifieras av Agent # 1 såsom skildras i figur 2, som uppvisar minimal hemolys vid pH 7,4, men en kraftig ökning av hemolytisk beteende vid endosomala pH-intervall (<6,5). Vissa medel kan uppvisa en hög grad av hemolytisk beteende vid fysiologiska pH-områden (ombud # 2 vid 40 pg / ml; figur 2), vilket tyder på att dessa medel inte kan vara hemocompatible och skulle kunna vara cytotoxiska vid dessa koncentrationer.
I de flesta fall, är hemolys också dosberoende, eftersom ökande koncentrationer av testmaterialen motsvarar högre nivåer av hemolys, speciellt vid de lägre pH-områdena testade (5,6-6,2).
"Alt =" Bild 1 "FO: content-width =" 4I "FO: src =" / files/ftp_upload/50166/50166fig1highres.jpg "/>
Figur 1. Skiss av röda blodkroppar Hemolys analys. Mänskliga erytrocyter isoleras och inkuberas med experimentella endosomolytic ämnen drug delivery i en serie av buffertar simulerar pH-intervallet från fysiologiska (7,4) till sen endosomer / lysosomer (5,6). De optimala drug delivery agenter kommer inte störa erytrocyterna vid fysiologiskt pH men kommer att uppvisa stark hemolys i mer sura förhållanden. För att bedöma procent hemolys, är frisättningen av hemoglobin till det omgivande mediet mätt genom absorbans på en plattavläsare.
Figur 2. Representativa resultat av en Hemolys analys Demonstration Beteende två experimentella EndoSomolytic Agents. Först (PBS) den genomsnittliga En 450 av fordonets kontrollen subtraherades från de andra proven testades vid detta pH. Efteråt togs experimentella prover normaliserades till A 450 av Triton X-100-behandlade prover erytrocyt och multiplicerat med 100%. Baserat på dessa kontrollprover, kan förmågan hos experimentella transfektion medel att lysera erytrocyter beräknas. Typiskt ideala endosomolytic medel uppvisar dosberoende och pH-beroende beteende hemolytisk. Ideala medel (såsom ombud # 1) uppvisar minimal hemolys vid pH 7,4, men en kraftig ökning av hemolytisk beteende vid endosomala pH-intervall (<6,5). Vissa medel uppvisar betydande hemolytisk beteende vid fysiologiska pH-områden (ombud # 2 vid 40 ng / ml), vilket antyder att dessa medel kan vara cytotoxiska vid dessa koncentrationer. Felstaplar anger standardavvikelse av 4 oberoende mätningar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
pH-responsiva polymerer eller andra medel avsedda för endosomolytic funktion kan vara snabbt och effektivt screenas utifrån lys av röda blodkroppar vid pH-värden som uppstått i endosomen (figur 1, pH 6,8 - tidig endosome, pH 6,2 - sen endosome, pH 5,6 - lysosom). 14-17 pH-beroende hemolys har använts för att screena förmåga transportörer att mediera endosomala frisättning av biomacromolecular terapeutiska (t.ex. peptider, siRNA, ODN, proteiner), och resultaten av denna analys kan vara förutsägande av prestanda som en intracellulär drug delivery fordon. 3,4,8,18,19 Således representerar denna analys en effektiv skärm för att mäta förmågan hos polymera läkemedelsbärare att förmedla intracellulär läkemedelstillförsel baserat på deras pH-beroende membran störningar.
Såsom noterats i förfarandet, är hemolys detekteras genom spektrofotometrisk mätning av supernatanterna av röda blodkroppar behandlade med experimentellmedel. Därför, förutom hemoglobin, är det troligt att innehålla andra erytrocyt-härledda cytosoliska komponenter, inklusive proteiner och kolhydrater. Medan dessa andra komponenter kan bidra en liten mängd av signal till den spektrofotometriska mätningen, var 100% hemolys kalibrerad till den erytrocyt lysatet resulterar från behandling med Triton X-100. Förutsatt att alla erytrocyter från samma donator innehåller liknande nivåer av hemoglobin och andra biomolekyler, kan vi konstatera säkert att "förorenande" komponenter inte kommer att bidra några artefakter till hemolys mätningen, särskilt om samma blodprov används för alla tester. Men belyser detta möjligheten att, för en given blodgivare, det kommer sannolikt att vara små dag till dag variationer i blodets sammansättning och hematokrit, och därför intern kontrollprover (steg 3,3-3,4, 3,10-3,11) bör analyserades för alla experiment.
Man bör också alltid noggrant undersöka den råa absorbance uppgifter. Även om det inte kan uppskattas i de normaliserade exempel data som visas i figur 2, detergenter såsom Triton X-100 effektivt destabilisera erytrocytmembran oavsett pH och man bör förvänta sig att se väldigt lite prov till prov variation i positiva kontroller. Absorbansen spektrum av Triton X-100 inte omfattar toppar i 400-600 nm rekommenderas för denna analys, och därför inte borde störa normalisering av experimentella data. 20 dessutom för negativa kontrollprover, bör man inte observera signifikanta hemolys efter 1 h inkubation i någon av de buffertar som används (dvs även den mest sura bufferten inte normalt genererar hemolys på denna tidsram). Bakgrund avläsningar på negativa kontrollprover bör noga ungefärliga bakgrund absorbansavläsningar tagit de färska buffertar.
Helst ska forskarna använda kompletterande strategier för att karakterisera deras erfarenhetrimental läkemedelstillförselsystem. Den hemolys analysen är fördelaktigt för första endosomolytic agent screening på naturligt förekommande Biomembranes, men bör betraktas som endast en av de många verktyg i drug delivery forskarens arsenalen för att testa cytosoliska leverans agenter. Till exempel, är en potentiell brist av hemolys analysen att den utnyttjar den röda membran blodkroppar som en biologisk modell för endosomala membran. Varierar dock smink och fett i endosomala membran av cell-typ och kan inte exakt rekapituleras av blod cellmembranet. 1 En mängd andra, kompletterande analyser har utvecklats för att efterlikna endosomala membranet sammansättning och beteende. 21, 22 Ett alternativ till att använda liposomer innehållande fluorescens resonansenergiöverföring (FRET)-kylda fluoroforer, som blir OSLÄCKT efter destabilisering av liposomerna och frisättning av fluoroforerna till omgivande media. I studier evid använda denna metod, har kvantifiering av OSLÄCKT fluoroforer befunnits korrelera med förmågan hos fordon att förmedla endosomal flykt av dess nyttolast. 21,23 Mikroskopi-mätningar kan ge en mer robust men lägre kapacitet metod som är ett komplement till hemolysen analysen. Till exempel är det vanligt att bedöma samlokalisering av bäraren eller drogen själv med färgämnesmärkta lysosomer (t.ex. LysoTracker av Life Technologies), eller människohandel vägarna kan karaktäriseras med hjälp pH-känsliga färgämnen konjugerade bäraren eller droger (t.ex. pHrodo av Life Technologies). 24-26
När en endosomolytic leveranssystem har bekräftats att uppnå cytosoliskt last leverans kan hemolys analysen ger också information om den mekanism genom vilken endosomal flykt inträffar. Till exempel, gentillförsel fordon baserade på polyetylenimin (PEI) saknar en inneboende förmåga att störa fosfolipidmembranvid neutralt eller surt pH. 11,27 istället, uppnår PEI cytosolisk gentillförsel genom en "protonsvamp" effekt. Efter internalisering, buffrar PEI endosomen med "absorbera" protoner som pumpas över endosomala membranet att surgöra dessa avdelningar. Så småningom leder detta till uppbyggnad av överskott protoner och deras motjoner inuti endosomen. Detta resulterar i en ökning av osmotiskt tryck, vatten inflöde, vesikler svullnad och endosomolysis. Därför nödvändiggör framgång protonsvamp effekt ackumuleringen av en kritisk koncentration av PEI till en endosom. 27 Leverans fordon som uppnår endosomal störningar genom "protonsvamp" effekt inte fysiskt störa röda blodkroppar eller liposomer, och deras effektivitet för att uppnå intracellulär läkemedelsavgivning måste bedömas genom osmotiskt tryck beräkningar eller in vitro mikroskopi eller funktionella studier.
Sammanfattningsvis beskrivs hemolys analysen härär en pålitlig modell för screening farmaceutiska medel avsedda för intracellulär avgivning av biologiska läkemedel. Denna analys ger en hög genomströmning sätt läkemedelstillförsel fordonets screening möjliggör snabba utvecklingen av formuleringar som levererar biologiska med intracellulära mål.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
IRB godkännande: förfaranden med människor har godkänts av Vanderbilt University Institutional Review Board (IRB, protokoll # 111.251). Inga intressekonflikter deklareras.
Acknowledgments
Författarna erkänner finansiering genom försvarsdepartementet congressionally riktade Medical Research Program (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) och American Heart Association (# 11SDG4890030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
- Alberts, B., et al. Molecular Biology of the Cell. , 4th, Garland Science. (2002).
- Boasson, E. H.
- Convertine, A. J., Benoit, D. S., Duvall, C. L., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Development of a novel endosomolytic diblock copolymer for siRNA delivery. J. Control. Release. 133, 221-229 (2009).
- Duvall, C. L., Convertine, A. J., Benoit, D. S., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Intracellular Delivery of a Proapoptotic Peptide via Conjugation to a RAFT Synthesized Endosomolytic. 7, 468-476 (2010).
- Varkouhi, A. K., Scholte, M., Storm, G., Haisma, H. J. Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release. 151, 220-228 (2011).
- Plank, C., Oberhauser, B., Mechtler, K., Koch, C., Wagner, E. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gene transfer systems. Journal of Biological Chemistry. 269, 12918-12924 (1994).
- Ratner, A. J., et al. Epithelial Cells Are Sensitive Detectors of Bacterial Pore-forming Toxins. Journal of Biological Chemistry. 281, 12994-12998 (2006).
- Saar, K., et al. Cell-penetrating peptides: A comparative membrane toxicity study. Analytical Biochemistry. 345, 55-65 (2005).
- Kichler, A., Leborgne, C., Coeytaux, E., Danos, O. Polyethylenimine-mediated gene delivery: a mechanistic study. The Journal of Gene Medicine. 3, 135-144 (2001).
- Behr, J. -P. The Proton Sponge: a Trick to Enter Cells the Viruses Did Not Exploit. CHIMIA International Journal for Chemistry. 51, 34-36 (1997).
- Dawson, R. M. C., Elliot, D. C., Elliot, W. H., Jones, K. M. Data for Biochemical Research. , 3rd, Oxford University Press. (1986).
- Ernst, D. J. Applied Phlebotomy. , 1st, Lippincott Williams & Wilkins. (2005).
- Bulmus, V., et al. A new pH-responsive and glutathione-reactive, endosomal membrane-disruptive polymeric carrier for intracellular delivery of biomolecular drugs. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 93, 105-120 (2003).
- Lackey, C. A., et al.
- Murthy, N., Campbell, J., Fausto, N., Hoffman, A. S., Stayton, P. S. Bioinspired pH-responsive polymers for the intracellular delivery of biomolecular drugs. Bioconjugate chemistry. 14, 412-419 (2003).
- Murthy, N., Robichaud, J. R., Tirrell, D. A., Stayton, P. S., Hoffman, A. S. The design and synthesis of polymers for eukaryotic membrane disruption. Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 61, 137-143 (1999).
- Yu, H., et al. Overcoming endosomal barrier by amphotericin B-loaded dual pH-responsive PDMA-b-PDPA micelleplexes for siRNA delivery. ACS nano. 5, 9246-9255 (2011).
- Nelson, C. E., et al. Sustained local delivery of siRNA from an injectable scaffold. Biomaterials. 33, 1154-1161 (2012).
- Miozzari, G. F., Niederberger, P., Hütter, R. Permeabilization of microorganisms by Triton X-100. Analytical Biochemistry. 90, 220-233 (1978).
- Chen, H., Zhang, H., McCallum, C. M., Szoka, F. C., Guo, X. Unsaturated Cationic Ortho Esters for Endosome Permeation in Gene Delivery. Journal of Medicinal Chemistry. 50, 4269-4278 (2007).
- Roth, C. M. Quantitative Measurements and Rational Materials Design for Intracellular Delivery of Oligonucleotides. Biotechnology Progress. 24, 23-28 (2008).
- Blumenthal, R., Seth, P., Willingham, M. C., Pastan, I. pH-dependent lysis of liposomes by adenovirus. Biochemistry. 25, 2231-2237 (1986).
- Moore, N. M., Sheppard, C. L., Barbour, T. R., Sakiyama-Elbert, S. E. The effect of endosomal escape peptides on in vitro gene delivery of polyethylene glycol-based vehicles. The Journal of Gene Medicine. 10, 1134-1149 (2008).
- Panyam, J., Zhou, W. Z., Prabha, S., Sahoo, S. K., Labhasetwar, V. Rapid endo-lysosomal escape of poly(DL-lactide-co-glycolide) nanoparticles: implications for drug and gene delivery. The FASEB Journal. 16, 1217-1226 (2002).
