Summary
Un essai d'hémolyse ne peut être utilisée comme rapide, à haut débit écran de cytocompatibilité systèmes d'administration de médicaments et de l'activité de la livraison des marchandises endosomolytique intracellulaire. Le test mesure la perturbation des membranes des érythrocytes en fonction du pH de l'environnement.
Abstract
Bicouches de phospholipides qui constituent endo-lysosomal vésicules peuvent constituer un obstacle à la livraison de médicaments biologiques à des cibles intracellulaires. Pour surmonter cet obstacle, un certain nombre de transporteurs de drogues synthétiques ont été conçus pour une perturbation active de la membrane de l'endosome et livrer de la marchandise dans le cytoplasme. Ici, nous décrivons le test d'hémolyse, qui peut être utilisé aussi rapide et à haut débit pour l'écran et l'activité cytocompatibilité endosomolytique des systèmes de délivrance de médicaments intracellulaires.
Dans l'essai d'hémolyse, des globules rouges humains et des matériaux de test sont co-incubés dans des tampons à des pH définies, qui imitent extracellulaires début endosomes, et la fin de l'endo-lysosomiaux environnements. Après une étape de centrifugation à granulés de globules rouges intacts, la quantité d'hémoglobine libérée dans le milieu est mesurée par spectrophotométrie (405 nm pour la gamme plus dynamique). La perturbation pour cent des globules rouges est ensuite quantifié par rapport au contrôle positif sampLes lysées avec un détergent. Dans ce système, le modèle de la membrane du globule rouge sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Le résultat souhaité est l'hémolyse négligeable à pH physiologique (7,4) et une hémolyse robuste dans la gamme de pH endo-lysosomal d'environ 5 à 6,8 pH.
Introduction
Bien qu'il existe de nombreux potentiels à fort impact cibles thérapeutiques à l'intérieur de la cellule, la délivrance intracellulaire d'agents pose un défi de taille. Souvent, les médicaments, les produits biologiques, en particulier sont internalisés par les cellules et la traite dans des vésicules qui soit conduire à une dégradation de leur contenu par la voie endo-lysosomal, ou la navette de retour hors de la cellule par exocytose. 1 Dans ce dernier procédé, le pH interne des vésicules est acidifiée à environ 5-6, qui est le pH optimal pour l'activité des enzymes qui agissent dans ce compartiment, tel que le lysozyme. 2
Récemment, un certain nombre de matériaux ont été spécialement conçues pour tirer parti de l'acidification des endosomes pour faciliter la distribution cytosolique de leur cargaison. Un exemple de cette approche utilise des nanoparticules de polymères synthétiques, des micelles dont l'activité principale est zwitterionique et charge neutre au pH physiologique (c. 7.4). Cependant, à pH 6,0- 6,5, les polymères deviennent protonés et acquérir une charge positive nette qui déstabilise le noyau des micelles, et les segments de polymère exposées interagir avec et désorganiser la membrane de l'endosome. Cette activité a été montré pour favoriser l'évasion endosomal des peptides et des acides nucléiques thérapeutiques à base leur permettant d'accéder à leurs cibles cytosoliques. 3,4 D'autres exemples de méthodes élaborées pour servir de médiateur évasion endosomal qui perturbent la barrière de la membrane comprennent fusogènes '«peptides ou protéines qui peuvent médier la fusion membranaire ou transitoire formation de pores dans la bicouche phospholipidique. 5 Homopolymères de anioniques acides acryliques d'alkyle tels que le poly (acide propylacrylique) sont une autre approche bien étudiée, et dans ces polymères, l'état de protonation de l'acide carboxylique pendant dicte transition dans un hydrophobe, membrane interruption de l'État dans des gammes de pH endo-lysosomal. 6,7
Un système modèle utile pour le criblage comportement endosomolytique est l'ex dépendante du pH in vivo hémolyse dosage. 8 Dans ce système modèle, la membrane érythrocytaire sert de substitut pour la membrane bicouche lipidique qui entourent endo-lysosomal vésicules. Ce modèle généralisable a été utilisé par d'autres pour évaluer le comportement endosomolytique des peptides de pénétration cellulaire et d'autres polymères de systèmes de transfert de gènes. 8-11 Dans cette expérience, les globules rouges humains et matériels de test sont co-incubées dans des tampons à des pH définis qui imitent extracellulaires (7,4), au début des endosomes (6,8), et la fin de l'endo-lysosomal (<6,8) environnements. La quantité d'hémoglobine libérée au cours de la période d'incubation est quantifié comme une mesure de la lyse des globules rouges, qui est normalisée à la quantité d'hémoglobine libérée dans les échantillons témoins positifs lysées avec un détergent.
De criblage d'une petite bibliothèque de matériaux d'essais potentiellement endosomolytiques, on peut en déduire que les échantillons qui produisent aucune hémolyse à pH 7,4, mais l'ourlet significativement élevéolysis à pH <6,5, seront les candidats les plus efficaces et cytocompatible pour l'administration de médicaments cytosolique. Les matériaux qui répondent à ces critères on peut s'attendre à rester inerte et non pas aveuglément détruire membranes bicouches lipidiques (c. qui pourrait provoquer une cytotoxicité) avant d'être exposé à une baisse du pH local après internalisation dans l'endo-lysosomal compartiments.
Dans ce protocole, les érythrocytes sont isolés à partir d'un donneur humain et co-incubée à pH 5,6, 6,2, 6,8, ou 7,4 avec expérimentales endosomolytiques agents de délivrance de médicaments. Érythrocytes intacts sont culottées, et les surnageants (contenant de l'hémoglobine libérée des érythrocytes lysés) sont analysés pour l'absorbance caractéristique de l'hémoglobine par l'intermédiaire d'un lecteur de plaque (figure 1).
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Protocol
1. Préparation et stérilisation des tampons et des agents de test
- NaCl 150 mM tampon: dissoudre 4,383 g de cristaux de NaCl dans 500 ml d'eau nanopure.
- Tampons pH: Préparation des tampons phosphate à pH 5,6, 6,2, 6,8, et 7,4 en mélangeant des quantités appropriées d'monobasique et de phosphate de sodium dibasique. Si les échantillons doivent être testés à des valeurs de pH plus faibles (c.-à pH <5,6), puis un tampon plus approprié, comme un tampon citrate, doit être utilisé. Recettes tampons sont facilement disponibles, et une référence par exemple a été fourni ici 12.
- Stériliser tous les tampons indiquées ci-dessus à travers un appareil sur flacon vide filtration et re-vérifier tampon de pH.
- 20% de Triton X-100 (contrôle positif): Mélanger 20 ml pur Triton X-100 dans 80 ml d'eau nanopure. Vortex vigoureusement et sonication à se dissoudre. Laisser à température ambiante pendant une nuit avant de l'utiliser.
2. Préparation des érythrocytes
- Obtenir 25 ml de sang from un donateur anonyme humaine, tirées directement dans des tubes Vacutainer K 2-EDTA recouvertes pour éviter la coagulation.
REMARQUE: Toutes les procédures doivent être approuvés au préalable par le comité d'examen institutionnel approprié (CISR) et ponction veineuse et de prélèvement sanguin doit être effectué par un préleveur formé afin de minimiser le risque pour le donneur. Les procédures standards de saignée ont été publiés ailleurs 13.
- Centrifuger le sang à 500 xg pendant 5 min, et les niveaux d'hématocrite marque (rouge, couche inférieure) et le plasma (jaunâtre, couche supérieure) sur le tube.
- Aspirer doucement le plasma par l'intermédiaire d'une micropipette, ajouter dans l'eau de Javel, et jeter dans les déchets biologiques.
- Remplir le tube à hématocrite ligne marquée (niveau initial du plasma) avec une solution de NaCl 150 mM. Cap et la retourner plusieurs fois pour mélanger doucement. Centrifuger à 500 xg pendant 5 min.
- Répétez l'étape 2.3 à 2.4 pour laver les globules nouveau. Puis aspirer supernatfourmi et remplacez-le par du PBS à pH 7,4. Mélanger par inversion.
- Fractionner le sang uniformément dans quatre tubes, chacun correspondant à un pH qui va être testée. Etiqueter les tubes en fonction de chaque pH à tester (5,6, 6,2, 6,8, 7,4).
- Centrifuger les tubes de sang à 500 xg pendant 5 min. Marquer les niveaux sur les tubes, puis aspirer le surnageant.
- Remplir chaque tube à la ligne marquée avec un tampon de pH approprié (comme indiqué au point 2.6).
- Étiquette quatre tubes de 50 ml coniques (un par unité de pH à l'essai), et une pipette 49 ml de PBS de pH approprié dans chaque tube conique.
- Ajouter 1 ml d'érythrocytes (même pH) dans le tube correspondant à une dilution de 1:50. Inspectez visuellement le sang dilué, ce qui devrait être trouble et se déposeront si on les laisse tranquille. Si aucun formulaire à granulés, les cellules ont lysées.
3. Essai de lyse 96 Réglages Plate bien et quantification
- Préparer les solutions mères de tous les agents d'administration de médicaments expérimentaux, à 20x la concentration finale désirée à tester (testaura 10 ul d'agent de l'administration de médicaments + 190 pl dilué globules rouges, conduisant à une dilution de 1/20 de l'agent de l'administration de médicaments d'origine dans le mélange d'essai final). Stocks de 20, 100 et 800 pg / ml sont proposés, ce qui entraîne des concentrations d'essai finales de 1, 5 et 40 ng / ml, respectivement.
- Pipeter 10 ul de chaque solution mère dans V-bottom plaques à 96 puits. Pour des résultats optimaux, chargez chaque échantillon en triple ou quadruple.
REMARQUE: Pour plus de facilité, il est recommandé qu'un séparée plaque de 96 puits doit être préparé pour chaque pH à tester, à chaque échantillon (pour chaque concentration) chargé à n = 3-4 par plaque.
- Pour les puits de contrôle positif, ajouter 10 ul de Triton 20% X-100.
- Pour les puits de contrôle négatif, ajouter 10 ul de tampon phosphate. Utiliser un tampon au même pH à tester.
- Pipeter 190 pi d'érythrocytes dilué (voir 2.10) à chaque puits, en s'assurant que la solution mère cellule restehomogène au cours du transfert. Astuce: Utilisez pipette multi-canaux pour simplifier cette tâche.
- Incuber les plaques à 37 ° C pendant une heure (en option: Utiliser un agitateur orbital ou à bascule).
- Centrifuger les plaques pendant 5 min à 500 xg à granulés érythrocytes intacts. Remarque: lorsque vous retirez la plaque de la centrifugeuse et le transporter à l'étape suivante, à manipuler avec précaution et être certain de ne pas perturber le culot cellulaire.
- En utilisant une pipette multicanaux, transférer 100 ul de surnageant de chaque puits dans un cadre clair, à fond plat de 96 puits. Remarque: si le culot cellulaire est agité accidentellement pour n'importe quel échantillon (s), on peut re-centrifuger la plaque, puis procéder au transfert de surnageant.
- Mesurer l'absorbance des surnageants avec un lecteur de plaques. Notez que toute une gamme de longueurs d'onde peuvent être utilisés (400 - 541 nm).
REMARQUE: les lecteurs de plaques différentes peuvent avoir des points de saturation et des sensibilités différentes, de sorte que le choix d'une longueur d'onde pour moiasurements dépend de si oui ou non les données hémolyse des échantillons expérimentaux peuvent être normalisés de manière fiable l'hémolyse maximale induite par traitement avec un détergent. Cela nécessite une mesure précise des valeurs d'absorbance des échantillons témoins positifs.
- Utilisation de Microsoft Excel ou un logiciel similaire des données d'analyse, trouver le moyen de les lectures d'absorbance de fond portant sur les échantillons témoins négatifs mis en place pour chaque pH (étape 3.4). Soustraire cette valeur d'absorbance de fond de tous les autres échantillons qui ont été mesurés à ce pH.
- Après soustraction de fond, trouver l'absorbance moyenne du contrôle positif de détergent échantillons traités (étape 3.3). Puis normaliser tous les points de données expérimentales à cette valeur moyenne de l'absorbance, ce qui devrait représenter 100% d'hémolyse. Enfin, il faut multiplier chaque valeur et de 100% pour calculer% d'hémolyse qui s'est produite dans chaque puits par rapport au témoin détergent.
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Representative Results
Typiquement, les agents qui présentent idéal dépendante du pH comportement hémolytique ont le plus grand potentiel pour la livraison de médicaments cytosolique, des acides nucléiques ou d'autres molécules bioactives. Ceci est illustré par l'agent n ° 1 comme représenté à la figure 2, qui présente une hémolyse minimale à un pH de 7,4, mais une forte augmentation des comportements à hémolytique gammes de pH des endosomes (<6,5). Certains agents peuvent présenter des niveaux significatifs de comportement hémolytique à des gammes de pH physiologiques (Agent # 2 à 40 pg / ml, figure 2), ce qui suggère que ces agents peuvent ne pas être hémocompatible et pourrait être cytotoxique à ces concentrations.
Dans la plupart des cas, l'hémolyse est également dépendante de la dose, que des concentrations croissantes de matériel de test correspondent à des niveaux plus élevés d'hémolyse, surtout dans les gammes de pH plus faibles testées (5.6 à 6.2).
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Figure 1. Schéma du dosage sanguin Hémolyse Red Cell. Érythrocytes humains sont isolés et incubés avec expérimentales endosomolytiques agents d'administration de médicaments à une série de tampons simulant la gamme de pH allant physiologiques (7,4) à la fin de endosomes / lysosomes (5,6). Les agents optimales d'administration de médicaments ne perturbera pas les érythrocytes à pH physiologique, mais elle comprendra une hémolyse robuste dans des conditions plus acides. Pour évaluer l'hémolyse pour cent, la libération de l'hémoglobine dans le milieu environnant est mesurée par absorbance sur un lecteur de plaques.
Figure 2. Les résultats représentatifs d'un test d'hémolyse preuve de comportement de deux Endos expérimentalesAgents omolytic. Tout d'abord, la moyenne A 450 du véhicule (PBS) de commande a été soustraite des échantillons testés autres à ce pH. Par la suite, des échantillons expérimentaux ont été normalisées à la 450 A du Triton X-100-érythrocytaires échantillons traités et multiplié par 100%. Sur la base de ces échantillons de contrôle, la capacité des agents de transfection expérimentales pour lyser les érythrocytes peut être calculée. En règle générale, idéales agents endosomolytiques présentent dose-dépendante et dépendante du pH comportement hémolytique. Agents idéales (comme Agent # 1) présentent une hémolyse minimale à un pH de 7,4, mais une forte augmentation des comportements à hémolytique gammes de pH des endosomes (<6,5). Certains agents présentent substantielle le comportement hémolytique à des gammes de pH physiologiques (agent n ° 2 à 40 pg / ml), ce qui suggère que ces agents peuvent être cytotoxique à ces concentrations. Les barres d'erreur indiquent l'écart type de 4 mesures indépendantes.
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Discussion
pH-sensible polymères ou d'autres agents conçus pour fonction endosomolytique peut être rapidement et efficacement sélectionnés en fonction de lyse des globules rouges à des valeurs de pH rencontrées dans l'endosome (figure 1; pH 6,8 - endosome précoce, pH 6,2 - endosome tardif, pH 5,6 - lysosome). 14-17 dépendante du pH hémolyse a été utilisé pour cribler la capacité des transporteurs à la médiation de libération de médicaments endosomal biomacromolecular (peptides, par exemple, siRNA, ODN, protéines), et les résultats de cet essai peuvent être un facteur prédictif de la performance comme un intracellulaire véhicule de livraison de drogue. 3,4,8,18,19 Ainsi, ce test représente un écran efficace pour évaluer la capacité des transporteurs de drogue polymères de médiation intracellulaire de délivrance de médicaments en fonction de leur rupture de la membrane en fonction du pH.
Comme il est indiqué dans la procédure, l'hémolyse est détectée par mesure spectrophotométrique des surnageants des globules rouges traités avec expérimentaleagents. Par conséquent, en plus de l'hémoglobine, il est susceptible de contenir des érythrocytes autres composants dérivés cytosoliques, y compris les protéines et les glucides. Tandis que ces autres composants peuvent contribuer une petite quantité de signal de la mesure spectrophotométrique, 100% d'hémolyse a été étalonné à l'lysat érythrocytaire résultant d'un traitement avec du Triton X-100. En supposant que toutes les érythrocytes provenant du même donneur contiennent des niveaux similaires d'hémoglobine et d'autres biomolécules, nous pouvons sans risque conclure que la «contamination» des composants ne contribuent pas tous les artefacts à la mesure hémolyse, surtout si le même échantillon de sang est utilisé pour tous les tests. Cependant, cela met en évidence la possibilité que, pour tout donneur de sang donné, il ya des chances d'être petits au jour le jour des variations dans la composition du sang et de l'hématocrite et, par conséquent, des échantillons de contrôle interne (étapes 3.3 à 3.4, 3.10 à 3.11) devraient être analysées pour toutes les expériences.
Il convient également de toujours examiner de près la première absorbance données. Bien qu'il ne puisse être apprécié dans les données normalisées exemple illustré à la figure 2, les détergents tels que le Triton X-100 effectivement déstabiliser les membranes érythrocytaires quel que soit le pH, et l'on devrait s'attendre à voir l'exemple que très peu à la variabilité d'échantillonnage des contrôles positifs. Le spectre d'absorption de Triton X-100 ne tient pas compte des pics dans la gamme 400-600 nm recommandée pour cet essai, et, par conséquent, ne doit pas interférer avec la normalisation des données expérimentales. 20 En outre, pour les échantillons témoins négatifs, on ne devrait pas observer significative hémolyse après l'incubation 1 h dans l'une des mémoires tampons utilisées (par exemple le même tampon acide le plus souvent ne pas générer hémolyse sur cette période). Des renseignements de base sur les échantillons témoins négatifs doivent rapprochent étroitement des lectures d'absorbance de fond prises sur les tampons fraîches.
Idéalement, les chercheurs utilisent des stratégies complémentaires pour caractériser leur expérimentale systèmes de délivrance de médicaments. Le test d'hémolyse est avantageux pour le dépistage initiale de l'agent sur endosomolytique naturelle biomembranes, mais doit être considéré comme étant seulement l'un des nombreux outils dans l'arsenal du chercheur livraison médicament pour tester les agents de prestation cytosoliques. Par exemple, l'un des inconvénients possibles du test d'hémolyse est qu'il utilise la membrane des globules rouges comme modèle biologique pour les membranes des endosomes. Toutefois, le contenu de maquillage et des lipides des membranes endosomales varie selon le type cellulaire et ne peuvent être précisément récapitulé par la membrane des cellules sanguines. 1 Une variété d'autres, des dosages complémentaires ont été développées pour mimer composition de la membrane des endosomes et le comportement. 21, 22 Une variante consiste à utiliser de liposomes contenant de transfert d'énergie de fluorescence par résonance (FRET)-trempés fluorophores qui deviennent inassouvi déstabilisation suite des liposomes et de libération des fluorophores à des milieux environnants. Dans ème étudesà employer cette méthode, la quantification des fluorophores inassouvis a trouvé une corrélation avec la capacité d'un véhicule à la médiation évasion endosomal de sa charge utile. 21,23 Microscopie à base de mesures peuvent fournir une méthode plus robuste mais moins débit qui est complémentaire à l'essai d'hémolyse. Par exemple, il est courant d'évaluer la colocalisation du transporteur ou de la drogue elle-même avec de la teinture marqués lysosomes (par exemple Lysotracker par Life Technologies), ou les voies de trafic peuvent être caractérisés en utilisant des colorants sensibles au pH conjugué au transporteur ou à la drogue (par exemple par pHrodo Life Technologies). 24-26
Une fois qu'un système de livraison endosomolytique a été confirmée pour atteindre la livraison de cargaison cytosolique, le test d'hémolyse peuvent également fournir des informations sur le mécanisme par lequel évasion endosomal se produit. Par exemple, les véhicules d'administration de gènes basées sur polyéthylèneimine (PEI) n'ont pas une capacité inhérente à rompre les membranes phospholipidiquesau neutre ou acide pH. 11,27 Au lieu de cela, Î.-P.-É. permette la livraison gène cytosolique par un effet «éponge à protons». Après internalisation, Î.-P.-É. atténue l'endosome par "absorption" protons sont pompés à travers la membrane de l'endosome pour acidifier ces compartiments. Finalement, ce qui conduit à l'accumulation de protons excédentaires et leurs contre-ions à l'intérieur de l'endosome. Il en résulte une augmentation de la pression osmotique, l'apport d'eau, gonflement des vésicules, et endosomolysis. Par conséquent, le succès de l'effet éponge à protons nécessite l'accumulation d'une concentration critique de PEI dans un endosome. 27 véhicules de livraison qui permettent d'atteindre la perturbation des endosomes grâce à l'effet «éponge à protons" ne sera pas physiquement perturber les globules rouges ou des liposomes et leur efficacité dans la réalisation de l'administration de médicaments intracellulaire doit être évaluée par des calculs de pression osmotique, ou en microscopie in vitro, ou des études fonctionnelles.
En conclusion, le test d'hémolyse décrit iciest un modèle fiable pour cribler des agents pharmaceutiques destinées à la délivrance intracellulaire de médicaments biologiques. Ce test fournit un moyen à haut débit de contrôle des véhicules d'administration de médicaments, ce qui permet le développement rapide des formulations qui offrent des produits biologiques avec des cibles intracellulaires.
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Disclosures
Approbation de l'IRB: Les procédures impliquant des sujets humains ont été approuvés par le Conseil Vanderbilt University Institutional Review (CISR; Protocole n ° 111251). Aucun conflit d'intérêt déclaré.
Acknowledgments
Les auteurs remercient le financement par l'intermédiaire du ministère de la Défense dirigé par le Congrès programmes de recherche médicale (# W81XWH-10-1-0445), National Institutes of Health (NIH R21 HL110056) et l'American Heart Association (# 11SDG4890030).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BD Vacutainer - K2EDTA Vacutainer Tubes | Fisher Scientific | 22-253-145 | For blood collection |
| BD Vacutainer Blood Collection Needles, 20.5-gauge | Fisher Scientific | 02-665-31 | For blood collection |
| BD Vacutainer Tube Holder / Needle Adapter | Fisher Scientific | 22-289-953 | For blood collection |
| BD Brand Isopropyl Alcohol Swabs | Fisher Scientific | 13-680-63 | For blood collection |
| BD Vacutainer Latex-Free Tourniquet | Fisher Scientific | 02-657-6 | For blood collection |
| Hydrochloric acid (conc.) | Fisher Scientific | A144-500 | For adjustment of pH of D-PBS. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Positive control |
| Dulbecco's PBS | Invitrogen | 14190 | |
| Nalgene MF75 Sterile Disposable Bottle-Top Filter Unit with SFCA Membrane | Fisher Scientific | 09-740-44A | |
| BD 96-well plates, flat-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-2C | For plate-reading at the end of the assay. |
| BD 96-well plates, round-bottomed, tissue culture-treated polystyrene | Fisher Scientific | 08-772-17 | For incubation of red blood cells with experimental agents. |
References
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