Summary
Vi rapporterer en metode til at isolere naive multipotente hud-afledt precursor (SKP) celler fra primære humane fibroblastkulturer. Vi viser, at disse SKPs stammer fra fibroblastkulturer deler lignende stamceller egenskaber til dem stammer direkte fra humane hudbiopsier. Disse celler udtrykker neuralkam markering, nestin, ud over de multipotente markører, såsom OCT4 og Nanog.
Abstract
I det sidste årti, har flere voksne stamceller populationer blevet identificeret i human hud 1-4. Isoleringen af multipotente voksne dermal forstadier blev først rapporteret af Miller F. D laboratorium 5, 6. Disse tidlige undersøgelser beskrev en multipotent forstadie cellepopulation fra voksne pattedyr dermis 5.. Disse celler - betegnes SKPs, til hud-afledte forstadier - blev isoleret og udvidet fra gnavere og menneskehud og differentieret i både neurale og mesodermal afkom, herunder celletyper aldrig fundet i huden, såsom neuroner 5.. Immuncytokemiske studier på SKPs viste, at celler udtrykte vimentin og nestin, et mellemliggende filamentprotein udtrykt i neurale og skeletmuskelceller forstadier, foruden til fibronectin og multipotente stamceller markører 6. Indtil nu har de voksne stamceller befolkning SKPs blevet isoleret fra frisk indsamlede pattedyr hudbiopsier.
ve_content "> For nylig har vi etableret og rapporterede, at en befolkning på huden afledte prækursorceller kunne være til stede i de primære fibroblastkulturer oprettet fra hudbiopsier 7.. Den antagelse, at et par somatiske stamceller kunne opholde sig i primære fibroblastkulturer på tidlige populationsfordoblinger var baseret på følgende iagttagelser: (1) SKPs og primære fibroblastkulturer er afledt fra dermis, og derfor et lille antal SKP celler kan forblive til stede i primære dermale fibroblastkulturer og (2) primære fibroblastkulturer vokset fra frosne alikvoter, der har været underkastes ugunstige temperatur under opbevaring eller overførsel indeholdt en lille antal celler, der forblev levedygtige 7.. Disse sjældne celler var i stand til at udvide og kunne passeres adskillige gange. Denne iagttagelse antydede, at et lille antal celler med høj spredning potens og modstandsdygtighed over for stress var til stede i humane fibroblastkulturer 7.Vi tog fordel af disse fund til at etablere en protokol til hurtig isolering af voksne stamceller fra primære fibroblastkulturer, som er let tilgængelige fra vævsbanker hele verden (figur 1). Denne metode har vigtig betydning, da det giver mulighed for isolering af præcursorceller når hudprøver er ikke tilgængelige, mens fibroblastkulturer kan være tilgængelige fra vævsbanker dermed åbner nye muligheder for at dissekere de molekylære mekanismer, der ligger sjældne genetiske sygdomme samt modellering sygdomme i et skål.
Protocol
1.. SKP Isolering fra Primary fibroblastkulturer
- Fibroblastkulturer enten fra cellebanker eller direkte opnået fra hudbiopsier holdes i kultur i fibroblast-vækstmedium DMEM indeholdende 15% føtalt kalveserum, 2 mM glutamin, 10 mg / ml penicillin og 10 mg / ml streptomycin.
Humane fibroblaster GMO3349C og GMO8398A blev opnået fra Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ) og blev anvendt i denne undersøgelse.
- Kulturer fra populationsfordoblinger (PPD) 20 til 35 blev anvendt til SKP kulturer på en sammenflydning på 80%. Et 10 cm vævsdyrkningsskål (BD Falcon) indeholder ca 1.5x10 6 celler.
- Vask cellerne med PBS og inkuberes med 2 ml trypsinopløsning (0,25%, Invitrogen) i 1 time ved 37 ° C.
- Saml celler fra pladen med 5 ml PBS og overføre cellesuspensionen til en 15 ml Falcon-rør.
- Inkuber cellerne ved 4 ° C i 24 timer.
- Forbered SKP vækstmedium bestående af DMEM-F12, 3:1 (v / v) og 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml EGF (BD Biosciences), B27 serumfrit tillæg 2% (Invitrogen), 1 ug / ml Fungizone (Invitrogen) og 25 um / ml Gentamycin (Invitrogen).
- Pellet cellerne ved 1.200 rpm i 5 minutter og resuspender cellepelleten direkte i 4 ml SKP vækstmedium. Overfør cellesuspensionen til en 25 cm 2 vævskultur kolbe (BD Falcon).
- Inkubér kolbe ved 37 ° C og overvåge kultur for sfære dannelse dagligt i 3 til 4 uger.
2.. Sphere dyrkningsbetingelser
- Kultur celler i en 25 cm2 kolbe (BD Falcon) ved 37 ° C, 5% CO2.
- Rystes dagligt for at undgå cellerne at klæbe til bunden af kolben. Hvis det er nødvendigt, pipetteres op og ned med en 2 ml steril pipette at frigøre adhærente celler og overføre kulturen til en ny kolbe.
- Første kugler begynder at bygge inden for 3 tØ 4 dage.
- Lad kugler sediment på bunden af kolben og ændre halvdelen af medium hver 3. dag. For at holde den samme slutkoncentration af vækstfaktorer tilføjer 2X vækstfaktorer til frisklavet SKP vækstmedium.
- Hold lydstyrken konstant maksimalt 4 ml.
- Når kugler når en størrelse på ~ 200 mm, de skal passeres ved at nedbryde de sfærer mindre størrelse ved kraftig pipettering op og ned med en 2 ml pipette.
- Kulturen er opdelt i to 25 cm2 kolber (BD Falcon) og sfærer kulturer er foder som beskrevet i trin 2.4).
- Spheres indsamles til stamceller markører screening ved dag 16 til 21.
Proceduren fra 2.6) og 2.7) beskriver udbredelsen af kuglerne til (1) giver næringsstoffer og vækstfaktorer, der indgår i SKP medium få adgang til alle celler i hver kugle og (2) at udvide SKP sfære kultur før brug.
Typisk Sphere kulturer under vores cuLTURE betingelser opretholde sin kapacitet til at vokse i en periode på tre måneder, og som passeres mellem 3 til 4 gange.
3.. Immuncytokemi for Stem Cell Markers
- Sphere kulturer høstet i PBS ved dag 16 til 21. Kulturer er pelleteret ved 1.000 rpm i 5 min.
- Spheres resuspenderes i et lille volumen af PBS.
- Tegn to cirkler med en DAKO pen på ca 0,5 um i diameter på objektglas (Fisher brand).
- Tilføj 50 pi af kugle suspensionen i de kredse.
- Check ved lysmikroskopi for tilstedeværelsen af kugler i hver dråbe.
- Lad dråberne tørre under motorhjelmen.
- Enten fryse dias ved -80 ° C eller fortsætte med immunfluorescensfarvning protokollen.
- For immunfluorescensfarvning, fastsætte objektglassene med forafkølet Methanol (100%) ved -20 ° C i 10 min.
- Vask slides med PBS.
- Bloker dias med PBS/10% føtalt bovint serum / 0,02% Triton X100i mindst 1 time.
- Inkuber med primær antistof (fx anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, anti-nanog antistoffer, tabel 3) fortyndet i blokeringspuffer: PBS/10% FBS i 2 timer ved stuetemperatur eller natten over ved 4 ° C.
- Vask 3 gange med blokerende puffer og inkuberes med sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur.
- Vask 3 gange med blokerende buffer, og 3 gange med PBS.
- Mount dias med Vectashield montering medium (Vector Inc.).
- Analysere prøver for ekspression af stamcelle markører ved immunfluorescensmikroskopi.
4.. Realtime PCR-analyse af ekspressionsniveauer af Stem Cell Markers
- Tag ca 2-3 ml Sphere kulturer fra dag 18.-21.
- Pellet sfærerne ved 1.200 rpm i 5 min, og Aspirér al medium.
- Isoler RNA fra sfærerne ved hjælp af RNeasy Minikit (Qiagen, Valencia, CA).
- Vurdere RNA renhed ved spektrometri og agarosegel. </ Li>
- Syntetisere cDNA (Omniscript revers transkriptase (Qiagen)) under anvendelse af de samlede cellulære RNA som skabelon.
- Validere stamcelle markører ved Realtime-PCR under anvendelse af primere for stamcelle markører (vist i tabel 1) i en Power SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems) med en koncentration på 375 nM af hver primer og 50 ng skabelon i en 20 ul reaktionsvolumen. GAPDH anvendes som endogene kontrol.
- Til amplifikation bruge en indledende denaturering ved 95 ° C i 2,5 minutter efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 5 sekunder og 60 ° C i 20 sek.
- Analyser flugt med de 2 (ΔΔCt) metoden 8..
5.. Rettet Differentiering i glatte muskelceller
- Spheres fra dag 21 til 26 udpladedes i 6 vel kultur retter (BD Falcon) i SKP medium.
- Cellerne fik lov til at klæbe og vokse fra sfærerne i SKP medium for 72 timer.
- Glatte muskelceller (SMC'er) differentiation startede indledt af erstattede mediet med SMC differentiering medium bestående af høj-glucose Dulbeccos modificerede Eagle-medium (Invitrogen) indeholdende 5% FBS, 5 ng / ml PDGF-BB (Invitrogen), og 2,5 ng / ml TGF-b1 (Invitrogen) .
- Medium blev ændret hver 3 dage med frisklavet SMC differentiering medium for en periode på 3 til 4 uger i kulturer.
- Screening for SMC markører blev udført efter 3 til 4 uger ved immunohistokemi.
- Celler blev fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS i 10 min.
- Celler blev permeabiliseret med PBS indeholdende 0,3% Triton X-100 i 30 min.
- Cellerne blev inkuberet med antistoffer mod αSMA (MO851, Dako, 1:100), eller calponin (M3556, Dako, 1:100) i 1 time ved stuetemperatur og behandles yderligere som beskrevet i 3.12) til 3.15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi viser, at en population af celler, der selektivt udvide at generere SKP kugler under kontrolleret vækst tilstand bestående af EGF og FGF2 er til stede i primære dermale fibroblastkulturer (figur 1), som vi rapporteret for nylig 7..
Fibroblastkulturer fra PPD 15 til 25, der typisk svarer til de primære fibroblaster stammer tilgængelige fra cellebanker blev anvendt i denne undersøgelse. Fibroblastkulturer forelagt den dobbelte behandling bestående af kuldebehandlingsmetode sammen med næring udtynding i 24 timer som beskrevet i denne metode reproducerbart genererede kulturer indeholdende flydende kugler (også nævnt som embryoid krop EB) deler lignende vækstkarakteristika som det tidligere er beskrevet for SKPs afledt direkte fra hud prøver 7, 9.
Her viser vi, at bruge den metode, som vi for nylig rapporteret 7, isolerer vi en befolkning på ceLLS fra primære fibroblastkulturer, der udviser lignende egenskaber til multipotente neurale stamceller / precursorceller, isoleret og identificeret i mennesker og mus dermis hjælp neurosfæreceller dyrkningsbetingelser 5, 10, 11. Disse SKP-afledt fra primære humane fibroblastkulturer viser selvfornyende potens, da de kan udvides og passeres for mindst en periode på tre måneder in vitro (se metode afsnit). Når kugler nået en størrelse på 150 til 200 pM i diameter efter 18 til 21 dage i kultur, blev de mekanisk opdeles i et gennemsnit på 50 uM i diameter og får lov at re-ekspandere i suspensionskultur i SKP medium. Disse opdelt sfærer fik lov til at vokse, indtil de nåede 200 uM forudgående blive passeret igen som beskrevet i metode afsnittet. SKP kugler kunne passeres mindst tre gange. Denne observation tyder på, at celler i sfærerne var i stand til selv at forny og udvide under neurosfæreceller dyrkningsbetingelser som others og vi rapporteret 5, 7.
Desuden er disse SKP celler afledt fra fibroblastkulturer udtrykte neurale kam og neuron stamceller markør nestin samt embryonale stamceller transkription faktorer Nanog og Oct4 og pluripotente celleoverflademarkør TG30 (figur 2) i lighed med SKP stammer direkte fra huden biopsier 5, 7, 10. Immunhistokemi på SKP sfærer angivne nestin positivt signal i cytoplasmaet, udviste 4 oktober en afbrudt nuklear signal og Nanog viste en mere diffus nuklear signal (figur 2). Derudover celleoverflademarkør af pluripotente humane embryonale stamceller TG30 gav en positiv cytoplasmamembranen farvning på SKP sphere præparater (figur 2). Brug real time PCR, har vi også bekræftede tilstedeværelsen af mRNA kodning nestin og Oct4 i RNA præparat isoleret fra SKP sfærer indsamlet af dag 18 i kultur (figur 3 5,10. For yderligere at teste multipotency af SKP stammer fra fibroblastkulturer, vi inducerede disse celler til at differentiere til glatte muskelceller (figur 4). Efter tre uger induktion i medium indeholdende vækstfaktorerne PDGF-BB og TGF-b1 12, bekræftede immuncytokemi ekspressionen af SMC markører, αSMA, calponin i SMC'er stammer fra disse SKPs (figur 4).
Kollektivt, denne metode, og resultaterne viser, at SKP kugler isoleret fra primære fibroblastkulturer deler lignende egenskaber til dem stammer fra hudbiopsier og skal stamme fra en voksen stamcelle befolkningen bor i den menneskelige hud dermis.
| Navn | Entrez ID | Primersekvensen | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 bp |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 bp |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4-Oct | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 bp |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
Tabel 1. Liste over primere anvendt til real time PCR og qPCR.
| Antistof | Company | Katalognummer | Kommentarer |
| anti-Nestin | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857 | 1/400 |
| anti-TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| anti-Nanog | Abcam | ab21624 | 1/400 |
| anti-αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| anti-Calponin 1 | Dako | M3556 | 1/100 |
| Alexa Fluor; 555 æsel anti-kanin IgG (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| Alexa Fluor, 555 æsel anti-mus IgG (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 æsel anti-mus IgG (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 æsel anti-kanin IgG (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
Tabel 3. Liste af antistoffer oprindelse.
Figur 1. Isolering af SKPs fra primære fibroblastkulturer. Metoden til SKP sfære kultur startende fra primære dermal fibroblastkulturer GMO3349C ved passage 12 er skitseret. Dag 0 viser start fibroblast suspension i SKP vækstmedium. Dag 4 viser synlig sfære formation. Dag 17 viser en typisk 3D SKP sfære. Scale bar: 50 mm og 100 um som angivet.arge.jpg "target =" _blank "> Klik her for at se større figur.
Figur 2. Immunfluorescensfarvning af SKP kugler afledt af primære fibroblastkulturer. Immunofluorescensanalyse udført på SKPs afledt af humane primære fibroblastkulturer (GMO3349C). Sfære fra dag 16 blev aflejret på objektglas og farvet med anti-Nestin, anti-TG30, anti-Oct4 og anti-nanog-antistoffer som angivet. Kerner blev modfarvet med en DNA-farvning DAPI (blå). Scale bar:. 20 mm Klik her for at se større figur .
Figur 4.. Glatte muskelceller afledt fra SKP sfærer isoleret fra primære fibroblastkulturer. SKP sfærer afledt af primære fibroblaster var rettet til at differentiere til glatte muskelceller (SMC'er). (A) Fase kontrast imaging opridset de forskellige kultur trin fra SKP sfære kultur til SMC'er differentiering (øverste panel). (B) SMC'er afledt fra SKP sfærer blev immunfarvet for angivne SMC markører, α-Smooth muscle actin (αSMA), og calponin som angivet. Klik her for at se større figur .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ved anvendelse af fremgangsmåden beskrevet heri, kan naive dermale stamceller isoleres fra primære dermale fibroblastkulturer. Med denne fremgangsmåde, vi for nylig rapporteret isolering og karakterisering af voksne stamceller fra fibroblastkulturer afledt fra patienter med en sjælden genetisk syndrom, Hutchinson-Gilford progeria syndrom 7.. Som viser heri de prækursorceller udtrykkelige stamceller markører er i stand til selv-fornyelse og kan rettes til at differentiere til forskellige cellulære slægter, herunder fibroblaster og glatte muskelceller (se figur 4 ved Wenzel et al., 2012) 7.. Denne metode giver flere fordele til fremgangsmåden tidligere rapporteret til isolering af SKPs fra pattedyr hudprøver 10. SKP kan isoleres fra primære fibroblastkulturer, der enten frisk etableret fra hudbiopsier eller fra primære fibroblastkulturer, der allerede eksisterer og kan fåsfra celle banker rundt om i verden. Denne nye tilgang giver mulighed for at studere konsekvenserne af voksne stamceller i patogenesen af forskellige genetiske og sjældne sygdomme, for hvilke hudprøver ikke er let tilgængelige. Endelig denne metode giver et vindue af muligheder for at udforske voksne stamceller biologi og dissekere deres indvirkning under fysiologiske og sygdomstilstand. Afslutningsvis denne tilgang tilbyder en ny og hurtig måde at isolere huden afledte præcursorceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vi har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Alexander von Humboldt Foundation (5090371), at Christine Kühne Center for Allergi Forskning og Uddannelse (CK-CARE) og Bayerischen Staatsministerium (til KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, lK. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
