Summary
Se presenta un método para aislar precursoras derivadas de la piel (SKP) células multipotentes ingenuos de cultivos de fibroblastos humanos primarios. Se demuestra que estos SKPs derivados de cultivos de fibroblastos comparten propiedades de células madre similares a los obtenidos directamente a partir de biopsias de piel humana. Estas células expresan el marcador de la cresta neural, nestina, además de los marcadores multipotentes, tales como Oct4 y Nanog.
Abstract
Durante la última década, varias poblaciones de células madre adultas se han identificado en la piel humana 1-4. El aislamiento de los precursores multipotenciales dérmicos adultos se informó por primera vez por Miller F. D de laboratorio 5, 6. Estos primeros estudios describen una población de células precursoras multipotentes a partir de la dermis de mamífero adulto 5. Estas células - SKPs denominados precursores, para derivadas de la piel - se aislaron y expandieron a partir de roedores y de la piel humana y se diferencian tanto en la progenie neuronal y mesodérmico, incluyendo tipos de células nunca se encuentran en la piel, tales como las neuronas 5. Estudios inmunocitoquímicos en SKPs cultivadas revelaron que las células expresan vimentina y nestina, una proteína de filamento intermedio expresado en precursores neuronales y musculares del esqueleto, además de fibronectina y marcadores de células madre multipotentes 6. Hasta ahora, las células madre adultas SKPs población han sido aislados de recién recogidas biopsias de piel de mamífero.
ve_content "> Recientemente, hemos establecido e informó que una población de células precursoras derivadas piel puede permanecer presente en cultivos de fibroblastos primarios establecidos a partir de biopsias de la piel 7. La suposición de que algunas células madre somáticas pueden residir en cultivos de fibroblastos primarios en duplicaciones de la población primitiva era basan en las siguientes observaciones: (1) SKPs y cultivos de fibroblastos primarios se derivan de la dermis, y por lo tanto, un pequeño número de células SKP podrían permanecer presente en cultivos de fibroblastos dérmicos primarios y (2) los cultivos primarios de fibroblastos cultivados a partir de alícuotas congelados que han sido sometidos a temperatura desfavorable durante el almacenamiento o transferencia contenía un pequeño número de células que permanecieron viables 7. Estas células raras fueron capaces de ampliar y se pudo pasar varias veces. Esta observación sugiere que un pequeño número de células con alta potencia de proliferación y la resistencia al estrés estuvieron presentes en cultivos de fibroblastos humanos 7.Nos aprovechamos de estos resultados para establecer un protocolo para el aislamiento rápido de las células madre adultas a partir de cultivos primarios de fibroblastos que son fácilmente disponibles en los bancos de tejidos de todo el mundo (Figura 1). Este método tiene un significado importante, ya que permite el aislamiento de las células precursoras cuando las muestras de piel no son accesibles mientras que cultivos de fibroblastos pueden estar disponibles en los bancos de tejidos, por lo tanto, la apertura de nuevas oportunidades para diseccionar los mecanismos moleculares que subyacen a enfermedades genéticas raras, así como enfermedades de modelado en un plato.
Protocol
1. Aislamiento SKP de cultivos de fibroblastos primarios
- Cultivos de fibroblastos ya sea de bancos de células o directamente obtenido a partir de biopsias de la piel se mantienen en cultivo en un medio de crecimiento de fibroblastos DMEM que contenía 15% de suero de ternera fetal, 2 mM de glutamina, 10 mg / ml de penicilina, y 10 mg / ml de estreptomicina.
Fibroblastos humanos GMO3349C y GMO8398A se obtuvieron del Instituto Coriell de Investigación Médica (Camden, Nueva Jersey) y se utilizaron en este estudio.
- Los cultivos de duplicaciones de la población (PPD) de 20 a 35 se utilizaron para culturas SKP a una confluencia de 80%. Un 10 cm placa de cultivo de tejidos (BD Falcon) contiene aproximadamente 1.5x10 6 células.
- Lavar las células con PBS y se incuba con 2 ml de solución de tripsina (0,25%, Invitrogen) durante 1 hora a 37 ° C.
- Recoger las células de la placa con 5 ml de PBS y transferir la suspensión celular a un tubo de 15 ml halcón.
- Se incuban las células a 4 º C durante 24 h.
- Preparar medio de crecimiento SKP que consiste de DMEM-F12, 03:01 (V / V) y 40 ng / ml de FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml de EGF (BD Biosciences), suplemento libre de suero B27 2% (Invitrogen), 1 g / ml de Fungizone (Invitrogen) y 25 m / ml de gentamicina (Invitrogen).
- Sedimentar las células a 1200 rpm durante 5 min y resuspender el sedimento de células directamente en 4 ml de medio de crecimiento SKP. Transferir la suspensión celular a un matraz de 25 cm 2 de cultivo de tejidos (BD Falcon).
- Se incuba el matraz a 37 ° C y supervisar la cultura para la formación de la esfera al día durante 3 a 4 semanas.
2. Esfera Condiciones de cultivo
- Células de cultivo en un matraz de 25 cm 2 (BD Falcon) a 37 ° C, 5% de CO 2.
- Agitar vigorosamente el matraz diariamente para evitar las células para adherirse a la parte inferior del matraz. Si es necesario, una pipeta de arriba abajo con una pipeta estéril 2 para separar las células adherentes y transferir la cultura a un nuevo frasco.
- Primero esferas comienzan a construir dentro de 3 to 4 días.
- Vamos esferas sedimento al fondo del matraz y el cambio de la mitad del medio cada 3 días. Para mantener la misma concentración final de factores de crecimiento 2X añadir factores de crecimiento al medio de crecimiento SKP recién preparado.
- Mantenga el volumen constante de un máximo de 4 ml.
- Cuando las esferas alcanzan un tamaño de ~ 200 mm deben ser pasados por romper las esferas de menor tamaño por un vigoroso pipeta hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de 2.
- El cultivo se divide en dos 25 cm 2 frascos (BD Falcon) y esferas culturas son alimentación como se describe en el paso 2.4).
- Las esferas se recogen para marcadores de células madre de cribado de día 16 al 21.
El procedimiento de 2.6) y 2.7) describen la propagación de las esferas a (1) permite nutrientes y factores de crecimiento incluidos en medio SKP para acceder a todas las células dentro de cada esfera y (2) para ampliar la cultura esfera SKP antes de uso.
Típicamente culturas Esfera bajo nuestros piescondiciones lture mantienen la capacidad de crecer en un período de tres meses y se pasan entre 3 y 4 veces.
3. La inmunocitoquímica para marcadores de células madre
- Culturas Esfera se cosechan en PBS el día 16 al 21. Los cultivos son sedimentaron a 1000 rpm durante 5 min.
- Las esferas se volvieron a suspender en un pequeño volumen de PBS.
- Dibuja dos círculos con un lápiz DAKO de aproximadamente 0,5 m de diámetro en el microscopio (marca Fisher).
- Añadir 50 l de suspensión de esfera en los círculos.
- Compruebe por microscopía de luz para detectar la presencia de esferas en cada gota.
- Deje que las gotas secas bajo el capó.
- Cualquiera de congelar los portaobjetos a -80 ° C o proceder con el protocolo de tinción de inmunofluorescencia.
- Para la tinción de inmunofluorescencia, fijar las diapositivas con metanol previamente enfriado (100%) a -20 º C durante 10 min.
- Lave los portaobjetos con PBS.
- Bloquear las diapositivas con PBS/10% de suero fetal bovino / 0,02% de Triton X100durante al menos 1 hora.
- Incubar con el anticuerpo primario (por ejemplo, anti-nestina, anti-Oct4, anti-TG30, anticuerpos anti-Nanog, Tabla 3) diluido en tampón de bloqueo: PBS/10% de FBS durante 2 horas a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° C.
- Lavar 3 veces con tampón de bloqueo y se incuba con el anticuerpo secundario durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar 3 veces con tampón de bloqueo y 3 veces con PBS.
- Montaje diapositivas con medio de montaje Vectashield (Vector Inc.).
- Analizar las muestras para la expresión de marcadores de células madre por microscopía de inmunofluorescencia.
4. Análisis de PCR en tiempo real de los niveles de expresión de marcadores de células madre
- Tome ml de cultivos de aproximadamente 2-3 días Esfera de 18 a 21.
- Pellet las esferas de 1200 rpm durante 5 minutos y aspirar todo el medio.
- Aislar ARN a partir de las esferas utilizando el Minikit RNeasy (Qiagen, Valencia, CA).
- Evaluar la pureza de ARN y por espectrometría de gel de agarosa. </ Li>
- Sintetizar ADNc (transcriptasa inversa Omniscript (Qiagen)) utilizando los ARN celular total como plantilla.
- Validar los marcadores de células madre por el tiempo real-PCR utilizando cebadores para marcadores de células madre (que se muestran en la Tabla 1) en un Poder SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems) con una concentración de 375 nM de cada cebador y 50 ng de plantilla en un 20 l volumen de reacción. GAPDH se utiliza como control endógeno.
- Para la amplificación utilizar una desnaturalización inicial a 95 ° C durante 2,5 min seguido de 40 ciclos a 95 ° C durante 5 seg y 60 ° C durante 20 seg.
- Analizar la ejecución con el (ΔΔCt) Método 2 8.
5. Diferenciación dirigida en células musculares lisas
- Esferas del día 21 al 26 se sembraron en placas de cultivo de 6 pocillos (BD Falcon) en medio SKP.
- Las células se dejaron adherir y superar de las esferas en medio SKP durante 72 horas.
- Las células musculares lisas (CML) differentiationes comenzó iniciado por reemplazó el medio con SMC medio de diferenciación que consta de alta glucosa medio de Eagle modificado de Dulbecco (Invitrogen) que contiene 5% de FBS, 5 ng / ml de PDGF-BB (Invitrogen), y 2,5 ng / ml de TGF-b1 (Invitrogen) .
- El medio se cambió cada 3 días con medio de diferenciación SMC recién preparado durante un periodo de 3 a 4 semanas en las culturas.
- La detección de marcadores de SMC se realizó después de 3 a 4 semanas por inmunohistoquímica.
- Las células se fijaron con solución de paraformaldehído al 4% en PBS durante 10 min.
- Las células se permeabilizaron con PBS que contenía 0,3% de Triton X-100 durante 30 min.
- Las células se incubaron con anticuerpos contra αSMA (MO851, Dako, 1:100), o calponina (M3556, Dako, 1:100) durante 1 hora a temperatura ambiente y aún más como se describe en 3,12) a 3,15).
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Representative Results
Se demuestra que una población de células que se expanden selectivamente para generar esferas SKP bajo condiciones de crecimiento controlado que consisten en EGF y FGF2 están presentes en cultivos de fibroblastos dérmicos primarios (Figura 1) como se informó recientemente 7.
Cultivos de fibroblastos de PPD 15 a 25 que normalmente se corresponden con las cepas de fibroblastos primarios disponibles a partir de bancos de células se utilizaron en este estudio. Cultivos de fibroblastos sometidos a la doble tratamiento que consiste en el tratamiento temperatura fría junto con el agotamiento del alimento durante 24 horas se describe en este método reproducible culturas generados que contienen esferas flotantes (también conocida como EB cuerpo embrioide) que comparten las características de crecimiento similares a la descrita anteriormente para SKPs derivados directamente a partir de muestras de piel 7, 9.
Aquí nos muestran que el método que se informó recientemente 7, aislamos una población de ceLLS a partir de cultivos primarios de fibroblastos que exhiben propiedades similares a las células madre / precursoras neurales multipotentes, aislado e identificado en la dermis humana y de ratón utilizando condiciones de cultivo de neuroesferas 5, 10, 11. Estos SKP-derivada de cultivos de fibroblastos humanos primarios muestran auto-renovación potencia, ya que pueden ser ampliadas y se pasaron por lo menos durante un período de tres meses in vitro (por favor, consulte la sección Método). Cuando las esferas alcanzaron un tamaño de 150 a 200 micras de diámetro después de 18 a 21 días en cultivo, se rompieron mecánicamente hacia abajo en un promedio de 50 micras de diámetro y se permite que vuelva a expandir en cultivo en suspensión en medio SKP. Estas esferas averiado se dejaron crecer hasta llegar a 200 mM antes de que se pasaron de nuevo como se describe en la sección Método. Esferas SKP podrían ser pasados al menos tres veces. Esta observación indica que las células dentro de las esferas fueron capaces de auto renovar y ampliar en condiciones de cultivo de neuroesferas como Otros y nos informaron de 5, 7.
Por otra parte, estas células SKP derivados de cultivos de fibroblastos expresaron la cresta neural y las neuronas de células madre nestina marcador, así como la de células madre embrionarias factores de transcripción Oct4 y Nanog y el marcador de superficie de células pluripotentes TG30 (Figura 2), de manera similar a la SKP derivado directamente de la piel biopsias 5, 7, 10. La inmunohistoquímica en esferas SKP indicado señal positiva nestin en el citoplasma, 04 de octubre mostró una señal nuclear marcada y Nanog mostró una señal nuclear más difusa (Figura 2). Además, el marcador de superficie de células pluripotentes de células madre embrionarias humanas TG30 dio una tinción de la membrana citoplásmica positiva sobre los preparativos esfera SKP (Figura 2). Usando PCR en tiempo real, que también confirmó la presencia de ARNm que codifica la nestina y Oct4 en la preparación de ARN aislado a partir de esferas SKP recogidos por 18 días en cultivo (Figura 3 5,10 humanos. A fin de probar la multipotencia de la SKP derivado de cultivos de fibroblastos, se indujo estas células a diferenciarse en células del músculo liso (Figura 4). Después de 3 semanas de inducción en medio que contiene los factores de crecimiento PDGF-BB y TGF-b1 12, inmunocitoquímica confirmó la expresión de los marcadores de SMC, αSMA, calponin en las SMC derivados de estos SKPs (Figura 4).
Colectivamente, este método y los resultados demuestran que las esferas SKP aisladas a partir de cultivos de fibroblastos primarios comparten propiedades similares a los derivados de biopsias de la piel y deben derivar de una población de células madre adultas que residen dentro de la dermis la piel humana.
| Nombre | Entrez ID | Secuencia del cebador | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 pb |
| R-AAA TTA CCG GCA CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 pb |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4-Oct | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 pb |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
La Tabla 1. Lista de los cebadores utilizados para la PCR en tiempo real y qPCR.
| Anticuerpo | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
| anti-nestina | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| anti-Oct4 | abcam | ab19857 | 1/400 |
| anti-TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| anti-Nanog | abcam | ab21624 | 1/400 |
| anti-αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| anti-Calponin 1 | Dako | M3556 | 1/100 |
| Alexa Fluor; 555 burro anti-conejo IgG (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 555 burro anti-IgG de ratón (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 burro anti-IgG de ratón (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 burro anti-conejo IgG (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
Tabla 3. Lista de origen anticuerpos.
Figura 1. Aislamiento de SKPs de cultivos de fibroblastos primarios. El método para SKP cultura esfera a partir de cultivos de fibroblastos dérmicos primarios GMO3349C en el paso 12 se describe. Día 0 muestra la suspensión de fibroblastos a partir del medio de cultivo SKP. Día 4 muestra la formación de esfera visible. Día 17 muestra una esfera SKP 3D típico. Barra de escala: 50 mm y 100 micras como se indica.arge.jpg "target =" _blank "> Haga clic aquí para ver más grande la figura.
Figura 2. La tinción de inmunofluorescencia de las esferas SKP derivadas a partir de cultivos primarios de fibroblastos. El análisis de inmunofluorescencia realiza en SKPs derivadas a partir de cultivos primarios de fibroblastos humanos (GMO3349C). Esfera del día 16 fueron depositadas sobre portaobjetos de microscopio y se tiñeron con anti-nestina, anti-TG30, anti-Oct4 y anticuerpos anti-Nanog como se indica. Los núcleos se contratiñeron con una mancha de ADN DAPI (azul). Barra de escala:. 20 mm Haga clic aquí para ver más grande la figura .
La Figura 4. Células derivadas del músculo liso de las esferas SKP en cultivos primarios de fibroblastos. SKP-esferas derivadas de fibroblastos primarios fueron dirigidos a diferenciarse en células musculares lisas (CML). (A) formación de imágenes de contraste de fase recapitular las diferentes etapas del cultivo de la cultura esfera SKP a la diferenciación de las CML (panel superior). (B) SMC derivados de esferas SKP se immunostained para los marcadores de SMC indicados, α-Smooth muscular actina (αSMA) y calponin como se indica. Haz clic aquí para ver más grande la figura .
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Discussion
Utilizando el método descrito en este documento, las células madre dérmicas ingenuos se pueden aislar a partir de cultivos primarios de fibroblastos dérmicos. Con este enfoque, se informó recientemente, el aislamiento y caracterización de células madre adultas de cultivos de fibroblastos procedentes de pacientes con un síndrome genético raro, Hutchinson-Gilford progeria síndrome 7. Como se muestran en este documento esos precursores células expresan marcadores de células madre son capaces de auto-renovación y se pueden dirigir para diferenciarse en diferentes linajes celulares, incluyendo fibroblastos y células musculares lisas (por favor refiérase a la figura 4 por Wenzel et al., 2012) 7. Este método ofrece varias ventajas para el método descrito anteriormente para el aislamiento de SKPs de muestras de piel de mamíferos 10. SKP se puede aislar a partir de cultivos primarios de fibroblastos que están ya sea recién establecidas a partir de biopsias de piel o a partir de cultivos primarios de fibroblastos que ya existen y se puede obtenerde los bancos de células de todo el mundo. Este nuevo enfoque ofrece la posibilidad de estudiar la implicación de las células madre adultas en la patogénesis de diversas enfermedades genéticas y raras para el que las muestras de piel no están fácilmente disponibles. Por último, este método proporciona una ventana de oportunidades para explorar la biología de células madre adultas y diseccionar su impacto durante el estado fisiológico y la enfermedad. En conclusión, este enfoque ofrece una manera novedosa y rápido para aislar células precursoras derivadas de la piel.
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Disclosures
No tenemos nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Alexander von Humboldt (5090371), el Centro de Kühne Christine para alérgicos Investigación y Educación (CK-CARE), y el Bayerischen Staatsministerium (para KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
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