Summary
Wij rapporteren een methode om naïeve multipotente huid-afgeleide precursor (SKP) cellen uit primaire menselijke fibroblast culturen te isoleren. We laten zien dat deze SKPs afgeleid van fibroblastculturen delen dezelfde stamcel eigenschappen aan deze die direct afgeleid van de menselijke huid biopten. Deze cellen brengen de neurale marker, nestin naast multipotente merkers zoals OCT4 en Nanog.
Abstract
In de afgelopen tien jaar hebben een aantal volwassen stamcellen populaties geïdentificeerd in de menselijke huid 1-4. De isolatie van multipotente adulte dermal voorlopers werd eerst gemeld door Miller F. D laboratorium 5, 6. Deze vroege studies beschreven een multipotent precursor cel populatie van volwassen zoogdieren dermis 5. Deze cellen - genoemd SKPs, voor huid-afgeleide precursoren - werden geïsoleerd en uitgebreid van knaagdier-en menselijke huid en gedifferentieerd in zowel neurale en mesodermale nakomelingen, waaronder celtypes nooit gevonden in de huid, zoals neuronen 5. Immunocytochemische studies op gekweekte SKPs gebleken dat cellen brachten vimentine en nestine, een intermediaire filament-eiwit expressie in neurale en skeletspieren voorlopers, naast fibronectine en multipotente stamcel markers 6. Tot nu toe hebben de volwassen stamcellen bevolking SKPs geïsoleerd uit vers verzameld zoogdierhuid biopsieën.
ve_content "> Onlangs hebben wij vastgesteld en gemeld dat een populatie van huid afgeleide voorlopercellen aanwezig in primaire fibroblastculturen opgericht uit huidbiopsieën 7 kon blijven. De veronderstelling dat een paar somatische stamcellen in primaire fibroblastculturen zou wonen op de vroege populatieverdubbelingen was gebaseerd op de volgende waarnemingen: (1) SKPs en primaire fibroblasten afgeleid van de dermis, en dus een klein aantal SKP cellen kunnen aanwezig zijn in primaire dermale fibroblasten blijft en (2) primaire fibroblasten gekweekt uit bevroren monsters die zijn onderworpen aan ongunstige bij opslag of overdracht van een klein aantal cellen die levensvatbaar 7 beperkt gebleven. Deze zeldzame cellen kan uitzetten en kan worden gepasseerd meermaals. Deze waarneming suggereerde dat een klein aantal cellen met een hoge potentie en proliferatie stressbestendigheid aanwezig in humane fibroblasten 7.We hebben gebruik gemaakt van deze bevindingen voor een protocol voor snelle isolatie van volwassen stamcellen uit primaire fibroblastculturen die gemakkelijk beschikbaar zijn uit weefsel banken wereldwijd (figuur 1) vast te stellen. Deze methode heeft een belangrijke betekenis als het kan de isolatie van voorlopercellen wanneer de huid monsters zijn niet toegankelijk wanneer fibroblastculturen verkrijgbaar kunnen zijn weefselbanken, dus nieuwe mogelijkheden openen om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen zeldzame genetische ziekten, alsook modelleren ziekten ontleden in een gerecht.
Protocol
1. SKP Isolatie van Primary fibroblastkweken
- Fibroblasten hetzij van celbanken of rechtstreeks uit huidbiopsieën worden in kweek gehouden in fibroblast groeimedium DMEM bevattende 15% foetaal kalfsserum, 2 mM glutamine, 10 mg / ml penicilline en 10 mg / ml streptomycine.
Humane fibroblasten GMO3349C en GMO8398A werden verkregen van het Coriell Institute for Medical Research (Camden, NJ) en werden gebruikt in deze studie.
- Culturen populatieverdubbelingen (PPD) 20 tot 35 werden gebruikt voor SKP kweken bij een confluentie van 80%. Een 10 cm weefselkweek schotel (BD Falcon) bevat ongeveer 1.5x10 6 cellen.
- Was de cellen met PBS en incubeer met 2 ml trypsine-oplossing (0,25%, Invitrogen) gedurende 1 uur bij 37 ° C.
- Verzamel cellen van de plaat met 5 ml PBS en breng de celsuspensie om een 15 ml falcon buis.
- Incubeer de cellen bij 4 ° C gedurende 24 uur.
- Bereid SKP groeimedium bestaande uit DMEM-F12, 3:1 (V / V) en 40 ng / ml FGF2 (BD Biosciences, 20 ng / ml EGF (BD Biosciences), B27 serumvrij supplement 2% (Invitrogen), 1 ug / ml Fungizone (Invitrogen) en 25 um / ml gentamycine (Invitrogen).
- Pellet de cellen bij 1200 rpm gedurende 5 min en resuspendeer de celpellet rechtstreeks in 4 ml SKP groeimedium. Breng de celsuspensie om een 25 cm 2 weefselkweek kolf (BD Falcon).
- Incubeer de kolf bij 37 ° C en controleren cultuur vorming bol dagelijks gedurende 3 tot 4 weken.
2. Sphere Cultuur Voorwaarden
- Kweekcellen in een 25 cm2 fles (Falcon BD) bij 37 ° C, 5% CO2.
- Schud de kolf krachtig dagelijks cellen voorkomen te houden aan de bodem van de kolf. Eventueel pipet op en neer met een 2 ml steriele pipet hechtende cellen los en breng de kweek naar een nieuwe kolf.
- Eerste bollen beginnen te bouwen binnen 3 to 4 dagen.
- Laat bollen sediment op de bodem van de kolf en verandering helft van het medium om de 3 dagen. Om dezelfde eindconcentratie van groeifactoren add 2X groeifactoren de vers bereide SKP groeimedium.
- Houd het volume constant maximaal 4 ml.
- Wanneer gebieden tot een grootte van ~ 200 mm moeten deze worden gepasseerd door het afbreken van de terreinen kleiner door krachtig pipetteren en neer met een pipet 2 ml.
- De cultuur wordt gesplitst in twee 25 cm2 kolven (BD Falcon) en bollen culturen diervoeder zoals beschreven in stap 2.4).
- De gebieden worden verzameld voor stamcel markers screening bij dag 16 tot 21.
De procedure van 2,6) en 2.7) beschrijven de propagatie van de sferen (1) kunnen voedingsstoffen en groeifactoren in SKP medium om alle cellen in elk gebied en (2) om de SKP bol cultuur voorgebruik breiden.
Typisch Sphere culturen onder onze culture te handhaven het vermogen om te groeien in een periode van drie maanden worden gepasseerd tussen 3-4 keer.
3. Immunocytochemie voor Stem Cell Markers
- Sphere kweken worden geoogst in PBS tot dag 16 tot 21. Cultures gepelleteerd bij 1000 rpm gedurende 5 minuten.
- Gebieden worden opnieuw gesuspendeerd in een klein volume PBS.
- Teken twee cirkels met een DAKO pen van ongeveer 0,5 micrometer in doorsnede op objectglaasjes (Fisher merk).
- Voeg 50 ul van bol schorsing in de cirkels.
- Controleer met lichtmicroscopie voor de aanwezigheid van gebieden in elke druppel.
- Laat onder de motorkap de druppels drogen.
- Ofwel bevriezen slides bij -80 ° C of doorgaan met immunofluorescentie kleuring protocol.
- Voor immunofluorescentie kleuring vast de objectglaasjes met voorgekoelde Methanol (100%) bij -20 ° C gedurende 10 minuten.
- Was de dia's met PBS.
- Blokkeer de dia's met PBS/10% foetaal bovine serum / 0,02% Triton X100ten minste 1 uur.
- Incubeer met primaire antilichaam (bijv. anti-Nestin, anti-Oct4, anti-TG30, anti-Nanog antilichamen, Tabel 3) verdund in blokkerende buffer: PBS/10% FBS gedurende 2 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Was 3 maal met blokkerende buffer en geïncubeerd met secundair antilichaam gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
- Was 3 maal met buffer en 3 keer met PBS geblokkeerd.
- Mount dia's met Vectashield montage medium (Vector Inc).
- Analyseren monsters voor expressie van stamcel markers door immunofluorescentie microscopie.
4. Realtime PCR analyse van expressie van Stem Cell Markers
- Duurt ongeveer 2-3 ml Sphere kweken van dag 18 tot 21.
- Pellet de bollen bij 1200 rpm gedurende 5 minuten en zuig alle medium.
- Isoleer RNA uit de sferen met de RNeasy minikit (Qiagen, Valencia, CA).
- Beoordelen RNA zuiverheid spectrometrie en agarosegel. </ Li>
- CDNA te synthetiseren (Omniscript Reverse Transcriptase (Qiagen)) met de totale cellulaire RNA als matrijs.
- Valideer de stamcellen merkers Realtime-PCR met primers voor stamcel markers (Tabel 1) in een Power SYBR Green PCR Mastermix (Applied Biosystems) met een concentratie van 375 nM van elke primer en 50 ng template in een 20 pl reactievolume. GAPDH wordt gebruikt als endogene controle.
- Voor de amplificatie gebruikt een initiële denaturatie bij 95 ° C gedurende 2,5 min gevolgd door 40 cycli bij 95 ° C gedurende 5 seconden en 60 ° C gedurende 20 sec.
- Analyseer de vlucht met de 2 (ΔΔCt)-methode 8.
5. Geregisseerd Differentiatie in de gladde spiercel
- Sferen van dag 21 tot 26 werden uitgeplaat in 6 putjes (BD Falcon) in SKP medium.
- Men liet de cellen hechten en groeien van de bollen in SKP medium gedurende 72 uur.
- Gladde spiercellen (SMC) differentiation gestart geïnitieerd door vervangen het medium SMC differentiatiemedium bestaande uit hoge glucose Dulbecco's gemodificeerd Eagle medium (Invitrogen) bevattende 5% FBS, 5 ng / ml PDGF-BB (Invitrogen), en 2,5 ng / ml TGF-b1 (Invitrogen) .
- Medium werd elke 3 dagen vervangen met vers bereide SMC differentiatie medium gedurende 3-4 weken kweken.
- Screening voor SMC merkers werd uitgevoerd na 3-4 weken immunohistochemie.
- Cellen werden gefixeerd met 4% paraformaldehyde in PBS gedurende 10 minuten.
- Cellen werden gepermeabiliseerd met PBS dat 0,3% Triton X-100 gedurende 30 minuten.
- Cellen werden geïncubeerd met antilichamen tegen αSMA (MO851, Dako, 1:100) of calponin (M3556, Dako, 1:100) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd en verder verwerkt zoals beschreven in 3,12) tot 3,15).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We zien dat een populatie van cellen die selectief uitbreiden naar SKP bollen onder beheerste groei voorwaarde bestaat uit EGF en FGF2 genereren die in primaire dermale fibroblasten (Figuur 1) zijn we onlangs gemeld 7.
Fibroblasten van PPD 15-25 die doorgaans overeenkomen met de primaire fibroblasten stammen beschikbaar celbanken die werden gebruikt in deze studie. Fibroblastculturen voorgelegd aan de dubbele behandeling bestaat uit koude temperatuur behandeling samen met voedingsstoffen uitputting gedurende 24 uur in deze methode beschreven reproduceerbaar gegenereerd kweken die drijvende bollen (ook wel aangeduid als embryoid lichaam EB) die soortgelijke groei-eigenschappen aan de eerder beschreven voor SKPs direct afgeleid van de huid monsters 7, 9.
Hier laten we zien dat het gebruik van de methode die we onlangs gemeld 7, isoleren we een bevolking van cells van primaire fibroblasten die dezelfde eigenschappen vertonen om multipotente neurale stam / voorlopercellen, geïsoleerd en geïdentificeerd in humaan en muis dermis met neurosphere kweekomstandigheden 5, 10, 11. Deze SKP-afgeleid van primaire menselijke fibroblasten tonen zelfvernieuwende potentie als ze kunnen worden uitgebreid en gepasseerd voor ten minste een periode van drie maanden in vitro (zie rubriek methode). Wanneer gebieden tot een grootte van 150 tot 200 uM in diameter na 18-21 dagen in kweek, werden ze mechanisch onderverdeeld in gemiddeld 50 uM in diameter en opnieuw mogen groeien in suspensiekweek in medium SKP. Deze kapotte sferen mochten groeien tot ze bereikt 200 uM voordat opnieuw wordt gepasseerd zoals beschreven in paragraaf Methode. SKP bollen kon ten minste drie keer worden gepasseerd. Deze waarneming geeft aan dat cellen in de sferen waren in staat om zichzelf te vernieuwen en uit te breiden onder neurosfeercultuur voorwaarden als others en we gemeld 5, 7.
Bovendien zijn deze SKP cellen uit fibroblasten uitgedrukt neurale en neuron stamcel marker nestine en de embryonale stamcel transcriptiefactoren Nanog en Oct4 en pluripotente celoppervlaktemarker TG30 (figuur 2), op dezelfde wijze SKP direct afgeleid van de huid biopten 5, 7, 10. Immunohistochemie op SKP bollen aangegeven nestin positief signaal in het cytoplasma, oktober 4 vertoonde een onderbroken nucleair signaal en Nanog toonde een diffuus nucleair signaal (figuur 2). Bovendien, het celoppervlak marker van pluripotente menselijke embryonale stamcellen TG30 heeft een positieve cytoplasmatische membraan kleuring op SKP bol preparaten (figuur 2). Middels real time PCR, we bevestigde de aanwezigheid van mRNA dat codeert nestine en Oct4 in RNA geïsoleerd uit bereiding SKP gebieden overdag 18 in kweek verzameld (fig. 3 5,10. Om de multipotent de SKP afgeleid van fibroblasten verdere testen we deze cellen geïnduceerd om te differentiëren in gladde spiercellen (Figuur 4). Na 3 weken in inductie medium met de groeifactoren PDGF-BB en TGF-b1 12, immunocytochemie bevestigde de expressie van de SMC markers, αSMA, calponin in de SMC's uit deze SKPs (figuur 4).
Collectief, deze methode en de bevindingen tonen aan dat SKP sferen geïsoleerd uit primaire fibroblastculturen delen dezelfde eigenschappen aan degenen afgeleid van huidbiopsieën en moeten afkomstig zijn van een volwassen stamcel bevolking die binnen de menselijke huid dermis.
| Naam | Entrez ID | Primer Sequentie | Amplicon |
| GAPDH | 2597 | F-CTC TGC TCC TCC TGT TCG AC | 144 bp |
| R-TTA AAA GCA GCC CTG GTG AC | |||
| Nestin | 10763 | F-GCCCTGACCACTCCAGTTTA | 200 bp |
| R-GGAGTCCTGGATTTCCTTCC | |||
| 4-oktober | 5460 | F-GAT GGC GTA CTG TGG GCC C | 195 bp |
| R-TGG GAC TCC TCC GGG TTT TG |
Tabel 1. Lijst van primers gebruikt voor real time PCR en qPCR.
| Antilichaam | Vennootschap | Catalogusnummer | Comments |
| anti-Nestin | Chemicon | MAB5326 | 1/100 |
| anti-Oct4 | Abcam | ab19857 | 1/400 |
| anti-TG30 | Millipore | TG30 | 1/400 |
| anti-Nanog | Abcam | ab21624 | 1/400 |
| anti-αSMA | Dako | MO851 | 1/100 |
| anti-Calponin 1 | Dako | M3556 | 1/100 |
| Alexa Fluor; 555 ezel anti-konijnen IgG (H + L) | Invitrogen | A31572 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 555 ezel anti-muis IgG (H + L) | Invitrogen | A31570 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 ezel anti-muis IgG (H + L) | Invitrogen | A21202 | 1/800 |
| Alexa Fluor; 488 ezel anti-konijnen IgG (H + L) | Invitrogen | A21206 | 1/800 |
Tabel 3. Lijst van antilichamen herkomst.
Figuur 1. Isolatie van SKPs uit primaire fibroblasten. De methode voor SKP bol cultuur vanaf primaire dermale fibroblasten GMO3349C bij passage 12 is geschetst. Dag 0 toont de start fibroblast suspensie in SKP groeimedium. Dag 4 zichtbare bol formatie. Dag 17 toont een typische 3D SKP bol. Schaal bar: 50 mm en 100 um aangegeven.arge.jpg "target =" _blank "> Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken.
Figuur 2. Immunofluorescentiekleuring van SKP bollen afgeleid van primaire fibroblasten. Immunofluorescentie analyse uitgevoerd op SKPs afkomstig van menselijke primaire fibroblastculturen (GMO3349C). Gebied van dag 16 werden op microscoopglaasjes en gekleurd met anti-Nestin, anti-TG30, anti-Oct4 en anti-Nanog antilichamen zoals aangegeven. Kernen werden tegengekleurd met een DNA vlek dapi (blauw). Schaalbalk:. 20 mm Klik hier voor een grotere afbeelding te bekijken .
Figuur 4. Gladde spiercellen-afgeleid van SKP sferen geïsoleerd uit primaire fibroblastculturen. SKP-sferen afkomstig van primaire fibroblasten waren gericht om te differentiëren in gladde spiercellen (SMC). (A) Fase contrast beeldvorming recapituleren de andere cultuur stappen van de SKP sfeer cultuur aan de SMC differentiatie (bovenste paneel). (B) SMC's afkomstig van SKP sferen werden immunostained voor geïndiceerde SMC markers, α-Smooth spieractine (αSMA) en calponin zoals aangegeven. Klik hier om een grotere afbeelding te bekijken .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Met de hierin beschreven werkwijze, kunnen naïeve dermale stamcellen geïsoleerd uit primaire dermale fibroblasten. Met deze benadering hebben we onlangs gemeld de isolatie en karakterisatie van volwassen stamcellen uit fibroblasten afkomstig van patiënten met een zeldzame genetische syndroom, Hutchinson-Gilford progeria syndroom 7. Zoals hierin tonen die voorlopercellen uitdrukkelijke stamcel markers zijn in staat van zelf-vernieuwing en kan worden gericht om te differentiëren in verschillende cellulaire geslachten, waaronder fibroblasten en gladde spiercellen (zie figuur 4 door Wenzel et al.., 2012) 7. Deze methode biedt verschillende voordelen voor de eerder beschreven voor de isolatie van SKPs van zoogdieren huidsteekproeven 10 methode. SKP kunnen worden geïsoleerd uit primaire fibroblastculturen die ofwel pas worden vastgesteld op basis van huidbiopsieën of uit primaire fibroblastculturen die reeds bestaan en kunnen worden verkregenvan cel banken over de hele wereld. Deze nieuwe benadering biedt de mogelijkheid om de gevolgen van volwassen stamcellen bestuderen in de pathogenese van verschillende genetische en zeldzame ziekten waarvoor huidsteekproeven niet beschikbaar. Tenslotte biedt deze methode een kans om volwassen stamcellen biologie ontdekken en ontleden hun invloed tijdens fysiologische en ziektestadium. Tot slot biedt deze benadering een nieuwe en snelle manier om de huid afgeleide voorlopercellen te isoleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Wij hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door de Alexander von Humboldt Stichting (5090371), de Christine Kühne Centrum voor Allergie Onderzoek en Onderwijs (CK-CARE), en de Bayerischen Staatsministerium (KD).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM high glucose | Invitrogen | 31966-047 | |
| DMEM low glucose | Invitrogen | 21885-108 | |
| fetal bovine serum | Invitrogen | 10270-106 | |
| L-glutamine | Invitrogen | 25030-024 | Final conc.: 200 mM |
| Penicillin/ Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | Final conc.: 10 mg/ml /10 mg /ml |
| trypsin solution (0.25%) | Invitrogen | 25200-056 | |
| F-12 Nutrient Mixture (Ham) | Invitrogen | 21765-029 | |
| FGF2 | BD Biosciences | 4114-TC-01M | Final conc.: 40 ng/ml |
| EGF | BD Biosciences | 236-EG-200 | Final conc.: 20 ng/ml |
| PDGFBB | Invitrogen | PHG0043 | Final conc.: 5 ng/ml |
| TGF-b1 | Invitrogen | PHG9204 | Final conc.: 2.5 ng/ml |
| 25 cm2 flask | Omnilab | FALC353109 | |
| PBS w/o CaMg | Invitrogen | 14190-169 | |
| B27 | Invitrogen | 17504-044 | |
| Methanol | Roth | 8388.2 | |
| Vectashield mounting medium | Vector Inc. | H-1200 | |
| RNeasy Minikit | Qiagen, Valencia, CA | 74104 | |
| Omniscript Reverse Transcriptase | Qiagen | 205113 | |
| SsoFast EvaGreen Supermix | BioRad | 172-5201 | |
| Fungizone | Invitrogen | 15290-018 | Final conc.:1 mg/ml |
| Table 2. Specific reagents and equipment. | |||
References
- Jahoda, C. A., Whitehouse, J., Reynolds, A. J., Hole, N. Hair follicle dermal cells differentiate into adipogenic and osteogenic lineages. Exp. Dermatol. 12, 849 (2003).
- Watt, F. M., Celso, L. o, C,, Silva-Vargas, V. Epidermal stem cells: an update. Curr. Opin. Genet. Dev. 16, 518 (2006).
- Blanpain, C., Horsley, V., Fuchs, E. Epithelial stem cells: turning over new leaves. Cell. 128, 445 (2007).
- Hunt, D. P., Jahoda, C., Chandran, S. Multipotent skin-derived precursors: from biology to clinical translation. Vurr. Opin. Biotechnol. 20, 522 (2009).
- Toma, J. G., et al. Isolation of multipotent adult stem cells from the dermis of mammalian skin. Nat. Cell Biol. 3, 778 (2001).
- Fernandes, K. J. L., et al. A dermal niche for multipotent adult skin-derived precursor cells. Nat. Cell Biol. 6, 1082 (2004).
- Wenzel, V., et al. Naïve adult stem cells from patients with Hutchinson-Gilford progeria syndrome express low levels of progerin in vivo. Bio. Open. 1, (2012).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402 (2001).
- Biernaskie, J. A., McKenzie, I. A., Toma, J. T., Miller, F. D. Isolation of skin-derived precursors (SKPs) and differentiation and enrichment of their Schwann cell progeny. Nature Protocol. 1, 2803 (2006).
- Toma, J. G., McKenzie, I., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23, 727 (2005).
- Fernandes, K. J., et al. Analysis of the neurogenic potential of multipotent skin-derived precursors. Electrophoresis. 201, 32 (2006).
- Hill, lK. L., et al. Human embryonic stem cell-derived vascular progenitor cells capable of endothelial and smooth muscle cell function. Exp. Hematol. 38, 246 (2010).
