Summary
Citrobacter rodentium infectie biedt een waardevol model voor enterische bacteriële infecties te bestuderen, evenals het hosten immuunreacties en colitis bij muizen. Dit protocol beschrijft de meting van de barrière integriteit, pathogeen belasting en histologische schade waardoor de grondige karakterisering van pathogeen en gastheer bijdragen aan murine infectieuze colitis.
Abstract
Dit protocol beschrijft de stappen om een robuust model van infectieziekten en colitis produceren, evenals de methoden om Citrobacter rodentium infectie in muizen karakteriseren. C. rodentium is een gram-negatieve murine specifieke bacteriële pathogenen die nauw verband houdt met de klinisch belangrijke humane pathogenen enteropathogene E. coli en enterohemorragische E. coli. Na infectie met C. rodentium, immunocompetente muizen last van bescheiden en van voorbijgaande aard gewichtsverlies en diarree. Histologisch, worden intestinale crypte rek, immuun cel infiltratie en goblet cel depletie waargenomen. Klaring van infectie wordt bereikt na 3 tot 4 weken. Meting van intestinale epitheliale barrière integriteit bacteriologische belasting en histologische schade op verschillende tijdstippen na infectie, kan de karakterisering van muizenstammen gevoelig voor infectie.
De virulentiemechanismes waardoor bacteriële pathogenen koloniseren de darm van de gastheer, evenals specifieke gastheer responsen die verdedigen tegen dergelijke infecties worden slecht begrepen. Daarom C. rodentium model van enterische bacteriële infectie dient als een waardevol instrument om te helpen in ons begrip van deze processen. Enterische bacteriën zijn ook verbonden met inflammatoire darmziekten (IBDs). Er is verondersteld dat de onaangepaste chronische inflammatoire reacties die bij IBD patiënten ontwikkelen genetisch gevoelige individuen na abnormale blootstelling van de intestinale mucosale immuunsysteem darmbacteriën. Daarom is de studie van modellen van infectieuze colitis biedt aanzienlijke mogelijkheden voor het definiëren van potentieel pathogene gastheer responsen tegen darmbacteriën. C. rodentium geïnduceerde colitis is een dergelijke zeldzame model waarmee voor de analyse van gastheer responsen tegen darmbacteriën, bevordering van ons inzicht in potentiële mechanismen van IBD pathogenese;essentieel voor de ontwikkeling van nieuwe preventieve en therapeutische behandelingen.
Introduction
Enterische infectie door bacteriële pathogenen triggers gastro-intestinale (GI) ontsteking en intestinale pathologie en pathofysiologie, waaronder diarree en intestinale epitheliale barrière disfunctie. De virulentie mechanismen waardoor bacteriële pathogenen koloniseren het maagdarmkanaal van de gastheer, evenals specifieke gastheer responsen die verdedigen tegen dergelijke infecties slecht begrepen, hebben echter recente ontwikkelingen in de modellering van enterische bacteriële infecties begonnen ons begrip van deze processen ondersteunen. Enterische bacteriën zijn ook verbonden met inflammatoire darmziekten (IBDs). De IBDs Crohn's Disease (CD) en UC complexe ziekten van onbekende etiologie die wordt gekenmerkt door chronische darmontsteking en weefselschade. Veel muismodellen van darmontstekingen bestaan van spontane ontsteking in genetisch gemodificeerde stammen, zoals IL10 - / - muizen, chemische problemen met verbindingen, zoals natriumsulfaat dextran (DSS) en dinitrobenzene sulfonzuur (DNBS) 1. Er is verondersteld dat de onaangepaste chronische ontstekingsreacties in IBD patiënten ontwikkelen genetisch gevoelige individuen op abnormale blootstelling van de intestinale mucosale immuunsysteem darmbacteriën 2, dus de studie van modellen van colitis infectieuze ook een groot potentieel voor het definiëren van potentieel pathogene ontvangende . reacties op darmbacteriën Citrobacter rodentium geïnduceerde colitis is een van de zeldzame modellen van colitis infectieuze dat goed is gekarakteriseerd 1,3, waardoor de analyse van gastheer responsen tegen enterische bacteriën en verder begrip van mogelijke mechanismen van IBD pathogenese, een essentiële stap in de ontwikkeling van nieuwe preventieve en therapeutische behandelingen.
C. rodentium is een gram-negatieve bevestiging en uitwissen (A / E), murine specifieke bacteriële pathogenen die nauw verband houdt met de belangrijke menselijkepathogenen enteropathogene E. coli (EPEC) en enterohemorragische E. coli (EHEC) 3-8. De familie van A / E pathogenen nauw hechten aan het apicale membraan van gastheercel en de cecal colonepitheel, die een niet-invasieve voetstuk-achtige structuur van de gastheercel. Orale uitdaging met C. rodentium van 10 8 -10 9 organismen produceert een robuust model van infectieuze colitis gekenmerkt door dikke hyperplasie of verlenging van de crypten, mononucleaire immuuncellen infiltratie en goblet cel depletie 3,4. De eerste site van kolonisatie, een paar uur na uitdaging is bovenaan cecal patch, gevolgd door overgang naar het distale colon 2 tot 3 dagen na infectie 3. In immunocompetente muizenstammen wordt klaring van het pathogeen bereikt 3 tot 4 weken na infectie 1,3,4. Echter veel genetisch gemodificeerde stammen, namelijk gen deficiënte of knockout (- / -) muizen zijn, bleken increa weersed vatbaarheid voor infecties resulteert in overdreven schade en / of chronische infecties en ontstekingen 9-14. Het gebruik van deze infectieuze colitis model in deze knock-out stammen, veel ontbreekt aangeboren signaleringeiwitten, is onmisbaar in het onthullen van een aantal gastheereiwitten integraal naar de resolutie van de intestinale infecties en ontstekingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding van Citrobacter rodentium Inoculum en orale sondevoeding van Muizen
- Voorbereiden en autoclaaf Luria Bertani bouillon (LB).
- Verkrijgen levensvatbare C. rodentium uit een bevroren glycerol voorraad en streeploos op LB-agar plaat met behulp van een steriele enten lus of pipetpunt. Incubeer bij 37 ° C geroerd. Enten 3 ml steriel LB bouillon in een falcon kweekbuis met kolonies van de LB plaat met een entnaald of pipetpunt. Bereiding van het inoculum worden gedaan met behulp van aseptische technieken.
- Incubeer de C. rodentium cultuur aëroob bij 37 ° C overnacht in een benchtop incubatie schudinrichting bij 200 rpm. De geïnoculeerde LB-bouillon moet troebel zijn na een nacht cultuur.
- Gebruik een lamp gaven maag gavage naald bevestigd aan een 1 ml spuit elke muis gavage met 100 ul van de overnacht C. rodentium cultuur. Voorzichtig scruff de muis, door stevig vast te pakken in de losse huid over zijn nek en rugmet duim en vingers. Trek het dier het hoofd met de wijsvinger naar het hoofd te immobiliseren en de slokdarm recht voor het inbrengen van de maagsonde naald.
- Houd de muis in een rechtopstaande positie en richt de lamp punt van de maagsonde naald langs de zijkant van haar mond en over haar tong. Voorzichtig langs de naald langs het dak van de mond en vooruit naar beneden de slokdarm. Als er een weerstand gevoeld tijdens deze procedure, moet u de sonde naald en plaats deze opnieuw.
- Injecteer langzaam 100 ul van de bacteriële inoculum en verwijder voorzichtig de sonde naald. Toezicht houden op de ademhaling en het gedrag van de muis na terugkeer het aan zijn kooi.
Opmerkingen:
- In stap 2 en 3, maken ook een falcon kweekbuis behulp van aseptische technieken met 3 ml steriel LB bouillon gedurende de nacht worden gekweekt om te garanderen dat er geen bacteriële besmetting van de bouillon zelf. De LB-bouillon moet duidelijk blijken na een nacht cultuur.
- Overnachting cultuur moet worden weggegooid als het is ingeënt voor meer dan 24 uur.
- Alle C. rodentium infecties en huisvesting van geïnfecteerde dieren worden uitgevoerd in een Biosafety Level 2 faciliteit.
2. Het meten van Colonic epitheliale barrière permeabiliteit in C. rodentium-geïnfecteerde muizen
- Meet barrière integriteit op een gewenst tijdstip na infectie.
- Op de dag van de test, om genoeg 4 kDa fluoresceïne-isothiocyanaat (FITC)-dextran opgelost in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) tot een concentratie van 80 mg ml-1 tot elke muis gavage met 150 pi en de standaard curve te bereiden.
- Nekvel de muis en gavage met 150 ul FITC-dextran. Trek voedsel uit de kooi op dit moment.
- Verdoven muizen 4 uur nagavaging en verzamel zo veel mogelijk bloed (~ 450 pi) door hartpunctie. Voeg het bloed tot een eindconcentratie van 3% zuur citraat dextrose in een microcentrifugebuis om coagulatie te voorkomen. Euthanaseren de muizen en verzamel colon weefsels in PBS voor bacterietellingen (stap 3,1 tot 3,5) en in 10% formaline fixatie weefsel en uiteindelijk immunofluorescentiekleuring (stap 4,1 tot 4,8).
- Draai de bloedmonsters bij 1.000 xg gedurende 12 min in een centrifuge bij 4 ° C. Verzamel de serum en vul aan tot 1/10 en 1/100 in PBS. Voeg 100 ul van elk monster bij deze twee verdunningen van een plaat met 96 putjes in duplo.
- De standaard curve te bereiden, verdun het oorspronkelijke 80 mg ml-1 FITC-dextran gebruikt om de muizen in PBS maagsonde de volgende concentraties: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 en 0 ug / ml . Voeg 100 pl van elke concentratie een plaat met 96 putjes in drievoud.
- Kwantificeer de fluorescentie van elk monster met behulp van een fluorometer bij een excitatie wavelength van 485 nm en 535 nm emissie golflengte.
- Analyseer de ruwe gegevens getrokken waarbij de standaardcurve. Voer de ruwe gegevens voor elk monster in de vergelijking van de lijn die door de standaardcurve van de concentratie van FITC-dextran bepalen in elk monster.
Opmerkingen:
- Vanaf stap 4 verder, houden bloedmonsters op ijs en het minimaliseren van de blootstelling aan licht.
- Bij het meten van epitheliale barrière-integriteit een tijdstip op of vóór en 7 dagen na infectie is optimaal, aangezien ernstige weefselbeschadiging na dit punt. Het meten van barrière-integriteit voor ernstige schade voorkomende kunt u bepalen maximale verschillen in permeabiliteit tijdens C. rodentium infectie tussen muizenstammen.
- Zorg ervoor dat niet-geïnfecteerde muizen in de controlegroep ook worden getest op epitheliale barrière integriteit.
3. Meting van de bacteriële verontreiniging in de weefsels van C. rodentium-geïnfecteerde muizen
- Voeg 1 ml steriele PBS eennd een geautoclaveerd metalen kraal met een ronde bodem 2 ml centrifugebuis met behulp van aseptische techniek. Afzonderlijke weefsels verzameld van elk dier worden in afzonderlijke buizen PBS. Weeg de buizen voorafgaande aan de toevoeging van het weefsel.
- Verwijder de blindedarm en de dikke darm van de muis. Scheid de blindedarm van de dikke darm en druk de luminale inhoud behulp van een tang. Voeg de inhoud van een buis PBS. Na scheiding 0,5 cm secties van het distale colon en blindedarm 10% formaline fixatie lengterichting opengesneden de resterende colon en blindedarm en wassen met steriele PBS voordat weefsels in tubes.
- Weeg de buizen met PBS en het weefsel Homogeniseer de monsters met een bead beater gedurende 6 minuten bij 30 Hz.
- Met behulp van aseptische technieken, voeg 180 ul steriele PBS per putje van een plaat met 96 putjes. Voeg 20 ul van elk monster gehomogeniseerde het eerste putje in elke rij. Meng goed en serieel te verdunnen, het toevoegen van 20 pi van elk voorheen goed om verdunningen te verkrijgen van 10 -1 (we eerstll) tot 10 -6. Plaat 10 pi van elke verdunning van elk monster in drievoud op een vierkante bodem LB plaat met een raster. Incubeer overnacht bij 37 ° C.
- Tellen kolonievormende eenheden (CFU) en de gemiddelde 3 tellen en noteer de verdunning waarbij elk monster werd geteld. Vermenigvuldigen gemiddelde CFU met 50, tot 20 ul van de oorspronkelijke 1 ml monster werd gebruikt, en met de verdunningsfactor waarop het monster werd geteld resulteert in CFU / ml. Tenslotte delen door het weefsel gewicht CFU / g bepalen.
4. Histologische evaluatie en immunofluorescentiekleuring van geïnfecteerde Colon Tissues
- Verzamel weefsels als in stap 3.2. Bewaren weefsels in formaline 's nachts, daarna wassen met 70% ethanol. Embedden weefsels in paraffine en gesneden 5 um secties voor kleuring. Vlek met hematoxyline & eosine voor histologische beoordeling en gaat u verder met de volgende stappen voor immunofluorescentie kleuring.
- Om weefsels deparaffinize vóór de kleuring, plaats schuift ineen Coplin kleuring pot en zet in 65 ° C waterbad gedurende 10 minuten. Vervolgens plaats dia's in xyleen voor vier wasbeurten van 2 minuten elk. Objectglaasjes dan gerehydrateerd met twee 5 minuten wassen in 100% ethanol, gevolgd door 5 min was in elk van de volgende: 95% ethanol, 75% ethanol en dH 2 0. Deze wasbeurten moet worden gedaan in een hoofdkap gebruiken om blootstelling aan schadelijke dampen te voorkomen.
- Plaats de glaasjes in de Coplin pot met voorverwarmd natriumcitraatbuffer en plaats in een stomer gedurende 30 min, laat zitten voor 30 minuten. Dit proces breekt het eiwit verknopingen gevormd door formalinefixatie ophalen potentieel antigene plaatsen.
- Wassen met PBS gedurende 5 min azide, driemaal. Droge slides en mark omgeving weefsel met een PAP pen op een hydrofobe barrière te creëren, waarbij de kleurstoffen gelokaliseerd op het weefsel.
- Block weefsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur met blokkerende buffer (bijvoorbeeld α-geiteserum) in een vochtige kamer immunokleuring.
- Verdun primary antilichaam gewenste concentratie met antilichaamverdunning buffer. Giet blokkeerbuffer en breng 50 tot 100 ul van primair antilichaam aan weefsels. Incubeer bij 4 ° C gedurende de nacht of bij kamertemperatuur gedurende 2 uur.
- Wassen met PBS gedurende 5 min azide, driemaal. Voeg 50 tot 100 pi secondair antilichaam verdund in buffer antilichaamverdunning aan de weefsels en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 1 uur in het donker. Wassen met dH 2 O 5 minuten, driemaal.
- Uitdrogen dia's, voeg DAPI Verleng Gold montage medium en breng een dekglaasje aan. Bekijk dia's onder een fluorescentie microscoop.
Opmerkingen:
- PBS azide kan gesubstitueerd met vers bereide PBS als alternatief voor bacteriële groei in het wasmedium uit stap 4 verder voorkomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tijdens een standaard infectie experiment worden de muizen geïnfecteerd met ongeveer 2,5 x 10 8 CFU door gavage van 100 pi overnacht C. rodentium cultuur. Infectie van C57BL / 6 muizen met C. rodentium resulteert in een bescheiden en van voorbijgaande aard gewichtsverlies en diarree. Hoewel een zeldzame gebeurtenis met C57BL / 6 muizen, kunnen dieren ziek worden en vereisen euthanization. Derhalve muizen worden gecontroleerd mate van gewichtsverlies en symptomen van angst zoals piloerect bont en gebogen houding, de mate waarin verschillende stammen worden beïnvloed door de infectie te bepalen.
Resultaten weergegeven in de figuren 1 tot 4 representatief zijn verricht infectie met een overnachtcultuur bereid uit een bevroren glycerolvoorraad. Op 7 dagen na infectie werden muizen verdoofd en bloed werd verzameld door hartpunctie. Figuur 1 toont FITC-dextran in serumvan C57BL / 6 muizen, alsook van Toll-achtige receptor 2 (TLR2) knockout muizen die eerder gevonden verminderd epitheliale barrière-integriteit vertonen tijdens infectie 9. In aanwezigheid van een intact intestinale epitheliale barrière, 4 kDa FITC-dextran is slecht doorlatende door deze laag. Daarom verhoogde niveaus van FITC-dextran in serum suggereren een bijzondere waardevermindering van intestinale epitheliale barrière integriteit tijdens infectie waardoor deze molecule te lekken over te brengen. Als controle worden serumspiegels geïnfecteerde muizen gavaged met FITC-dextran gepresenteerd.
Een week na infectie, zijn bacteriële belasting in de colon gebleken piek rond 10 9 CFU / g 3,4. Bacteriële belastingen kan worden gemeten op gewenste tijdstippen na infectie een infectie bevestigen, en om te beoordelen of verschillende knockout muizen lijden verhoogd of verlaagd bacteriële lasten. Zoals C. rodentium is een luminale ziekteverwekker die nauw kan adhere aan intestinale epitheliale cellen, bacteriële belasting in de luminale inhoud, cecal en colon weefsel kan worden gemeten. Figuur 2 toont typische bacteriële belasting gemeten op dag 7 na infectie cecal en colon weefsels alsmede in de darmlumen van C57BL / 6 muizen.
De meeste pathologie tijdens C. rodentium infectie in C57BL / 6 muizen voorkomt in de distale 2 cm van de colon11. Macroscopisch op dag 7 na infectie, is een verdikking van de colonmucosa en een verkorting in lengte van het colon waargenomen met weinig openlijke schade gezien in C57BL / 6 muizen. Gewoonlijk tijdens infectie, C57BL / 6 muizen lijden slechts matige ontsteking en pathologie histologisch gekarakteriseerd door infiltratie immuuncellen, verlenging van colon crypten en goblet celdepletie (figuur 3).
Zoals te zien in de H & E in figuur 3 zijn verscheidene gastheer responsen gemonteerd during infectie met C. rodentium. Verder te karakteriseren deze veranderingen kan immunofluorescentiekleuring worden gebruikt om veranderingen in eiwitten van belang, zoals markers van proliferatie, celdood of aangeboren en adaptieve immuunreacties onderzoeken. Immunofluorescentiekleuring is ook waardevol onderzoek aspecten van de bacteriële respons, zoals de lokalisatie in het geïnfecteerde weefsel. Een voorbeeld van deze kleuringstechniek, behandeling van een gastheer eiwit Ki67 (rood), een merker voor celproliferatie en C. rodentium eiwit tir, groen, bacteriële lokalisatie onderzocht op dag 12 na de infectie wordt gepresenteerd in figuur 4.
Figuur 1. Meting van serum FITC-dextran aan epitheliale barrière-integriteit te beoordelen. Muizen werdengavaged met 4 kDa FITC-dextran onder geïnfecteerde omstandigheden en bij 7 dagen na infectie, waarna serum FITC-dextran werden vastgesteld. C57BL / 6 (WT) muizen vertonen een verwaarloosbare toename in FITC-dextran serumspiegels bij 7 dagen na infectie in vergelijking met niet-geïnfecteerde omstandigheden. In tegenstelling, TLR2 - / - muizen hebben significant verhoogde niveaus van FTIC-dextran in serum vergeleken met de uitgangswaarde suggereren ernstig verminderde barrière integriteit in deze stam tijdens C. rodentium infectie, zoals eerder is aangetoond.
Figuur 2. C. rodentium belasting in lumen, caecum, colon en van geïnfecteerde C57BL / 6 muizen op dag 7 na infectie. Lumen, cecal en colon weefsels verzameld, gehomogeniseerd en uitgeplaat in seriële verdunning op LB agar. Elke circle vertegenwoordigt een enkel monster verzameld bij individuele dieren. Solid lijnen geven het meetkundig gemiddelde, terwijl verticale foutbalken geven SEM.
Figuur 3. Histologische analyse van schade door C. rodentium infectie. op dag 7 na infectie matige immune cel infiltratie, als de rek van crypten, slijmbekercel uitputting en licht oedeem waargenomen vergeleken met niet-geïnfecteerde weefsel te controleren. Klik hier om groter bedrag bekijken .
Figuur 4. Immunofluorescentiekleuring op geïnfecteerde en dag 12 na infectie weefsels van C57BL / 6 muizen. distale colon weefsel gekleurd voor het gastheereiwit Ki67 (rood) en C. rodentium eiwit tir (groen).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Citrobacter rodentium infectie een waardevol model voor de studie van zowel infectieziekten en colitis bij muizen. Dit unieke model maakt de karakterisering van zowel gastheer reacties en de pathogene eigenschappen van bacteriën. De stappen die in dit protocol detail het succesvolle gebruik van dit model.
Er zijn verschillende kritische stappen in dit protocol in gedachten te houden bij het opwekken van colitis en het analyseren van reacties. Enerzijds de bereiding van een verse overnacht C. rodentium inoculum in LB-medium is vereist voor een succesvolle infectie van muizen. Als een dosis van 10 8 -10 9 organismen moet meeste stammen van muizen infecteren wanneer de inoculum blijft in de shaker of op het tafelblad bij kamertemperatuur gedurende langere tijd, is er geen voldoende levensvatbare organismen blijven in de cultuur aan colitis veroorzaken na infectie. Het is ook belangrijk om de bacteriële inoculum roeren vóórhet laden van de spuit voor infectie, opdat elke muis een gelijke dosis bacteriën ontvangt. Bij het verzamelen van weefsel op terminus van de infectie, volledige onderdompeling van de colon weefsel in een ruime hoeveelheid 10% formaline nodig voor een goede fixatie weefsel optreden. Voorgesteld wordt weefsel aan formaline in een 5 ml flesje niet in microcentrifugebuizen als een 10:1 verhouding van fixatief om weefsel wordt aanbevolen. Goede fixatie is essentieel voor later histologische analyse en immunofluorescentiekleuring van deze weefsels. Het is ook belangrijk om in gedachten te houden dat verschillende knock-out stammen zullen de reacties zijn wisselend na inductie van C. rodentium colitis. Wanneer een nieuwe stam infecteren voor de eerste keer moet muizen zorgvuldig gecontroleerd worden om een humane eindpunt bepalen het experiment, indien nodig. Tijdstippen voor analyse van epitheliale barrière integriteit, bacteriële belasting en histologie worden gedefinieerd op basis van de respons van de muisstam van belang zijn voor de infectie.
Als plating van weefselhomogenaten op LB-platen van bacteriële belasting te bepalen is niet helemaal selectieve methode, het uitvoeren van PCR voor C. rodentium specifiek gen op bacteriekolonies kan worden gedaan om onderscheid C. rodentium andere bacterialcolonies op de plaat. Een andere optie is om weefselhomogenaten plaat op MacConkey agar, dit medium is selectief voor C. rodentium dan LB agar. Een alternatieve benadering is om een streptomycine resistente wild-type C. rodentium stam instead.Substitution met streptomycine resistente stam zal resulteren in de inductie van colitis hetzelfde model beschreven in dit protocol. Het voordeel van het streptomycine resistente stam voor gemakkelijkere analyse van bacteriële belasting, zoals weefselhomogenaten van deze infecties kunnen worden uitgeplaat op LB agar aangevuld met streptomycine plaats LB agar alleen. Dit voorkomt potentiële groei van commensal microben op de plaat, waardoor de CFU tellen proces gemakkelijker en nauwkeuriger. Een ander alternatief het meten bacteriële belastingen te platen incuberen na uitplaten van verdunningen op LB weefselhomogenaten agar bij ofwel 37 ° C gedurende de nacht of bij kamertemperatuur gedurende 2-3 dagen, wat resulteert in lagere bacteriële groei vóór het tellen.
Dit protocol beschrijft de stappen om een robuust model van infectieuze colitis produceren, evenals de methoden om C. karakteriseren rodentium infectie in muizen. Afgezien van het gebruik van dit model pathogeen-gastheer interacties en immuunreacties te onderzoeken, kan ook worden gebruikt om te onderzoeken hoe een bacteriële infectie kan het risico van darmkanker. Dit kan gedaan worden door blootstelling C. rodentium geïnfecteerde muizen aan de kankerverwekkende stof azoxymethane, of door te bestuderen hoe besmetting gevolgen voor epitheelcelproliferatie, of op genen die betrokken zijn bij epitheliale cel differentiatie of de ontwikkeling van tumoren 15. OnsING de infectieuze colitis model beschreven in dit protocol, kan bacteriële nummers ook worden beoordeeld op extra-intestinale sites, zoals de mesenteriale lymfeklieren, milt en lever. Hogere getallen in deze organen kunnen aangeven dat de muizenstam getest is zeer gevoelig voor de infectie. Met behulp van de immunofluorescentie beschreven kleuring techniek, kan een vrijwel eindeloos aantal mechanismen in reactie op infectie worden onderzocht. Zodra bekend met de technieken die hier worden beschreven, kan het protocol worden aangepast om weefsel te verzamelen andere eindpunten, zoals RNA-extractie en beoordeling van genexpressie niveaus meten grondiger responsen te C. rodentium infectie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door exploitatiesubsidies aan BAV van de Crohn en Colitis Foundation of Canada (CCFC) en de Canadese Instituten for Health Research (CIHR). NL werd gefinancierd door een gediplomeerde studententijd van CIHR. BAV is het kinder met darm-en leveraandoeningen (KIND) Stichting Leerstoel Pediatric IBD Research en de Canada Research Chair in Pediatric Gastroenterology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
