Summary
Citrobacter rodentium infeksjon gir en verdifull modell for å studere enteriske bakterielle infeksjoner samt vert immunresponser og kolitt hos mus. Denne protokollen beskriver måling av barriere integritet, patogen last og histologiske skader som åpner for grundig karakterisering av patogene og vert bidrag til murine smittsomme kolitt.
Abstract
Denne protokollen skisserer trinnene som kreves for å produsere en robust modell av infeksjonssykdom og kolitt, samt de metoder som benyttes for å karakterisere citrobacter rodentium infeksjon hos mus. C. rodentium er en gram negativ, murine spesifikk bakteriell patogen som er nært knyttet til klinisk viktige menneskelige patogener enteropatogene E. coli og enterohemorrhagic E. coli. Ved infeksjon med C. rodentium, immunkompetente mus lider beskjeden og forbigående vekttap og diaré. Histologisk, er intestinal krypten forlengelse, immunceller infiltrasjon og pokal celle uttømming observert. Clearance av infeksjon oppnås etter 3 til 4 uker. Måling av tarmepitel barriere integritet, bakteriell last, og histologiske skader ved ulike tidspunkt etter infeksjonen, tillate karakterisering av muselinjer mottakelig for infeksjon.
Virulens mekanismes der bakterielle patogener kolonisere tarmkanalen av sine verter, samt spesifikke vert respons som beskytter mot slike infeksjoner er dårlig forstått. Derfor C. rodentium modell av enterisk bakterieinfeksjon fungerer som et verdifullt verktøy for å hjelpe i vår forståelse av disse prosessene. Enteriske bakterier har også vært knyttet til inflammatoriske tarmsykdommer (IBDs). Det har blitt antatt at disse maladaptive kroniske inflammatoriske responser sett i IBD pasienter utvikle seg i genetisk disponerte individer etter unormal eksponering av intestinal mucosal immunsystem til enteriske bakterier. Derfor tilbyr studiet av modeller av infeksiøs kolitt betydelig potensial for å definere potensielt patogene vert svar på enteriske bakterier. C. rodentium indusert kolitt er en slik sjelden modell som tillater analyse av verten responser til enteriske bakterier, fremme vår forståelse av potensielle mekanismer IBD patogenesen;vesentlig i utviklingen av nye forebyggende og terapeutiske behandlinger.
Introduction
Infeksjon av enteriske bakterielle patogener utløser gastrointestinale (GI) betennelse, samt intestinal patologi og patofysiologi, inkludert diaré og tarmepitel barriere dysfunksjon. Virulens mekanismer som bakterielle patogener kolonisere mage-tarmkanalen av sine verter, samt spesifikke vert respons som beskytter mot slike infeksjoner er dårlig forstått, har imidlertid de siste fremskritt i modellering av enteriske bakterielle infeksjoner begynt å hjelpe vår forståelse av disse prosessene. Enteriske bakterier har også vært knyttet til inflammatoriske tarmsykdommer (IBDs). Den IBDs Crohns sykdom (CD) og UC er komplekse sykdommer av ukjent etiologi, karakterisert av kronisk tarmbetennelse og vevsskade. Mange musemodeller av tarmbetennelse eksisterer, fra spontan betennelse i genmodifiserte stammer, for eksempel IL10 - / - mus, til kjemiske utfordringer med forbindelser, såsom dekstran natriumsulfat (DSS) og dinitrobenzene sulfonsyre (DNBS) 1. Det har blitt antatt at disse maladaptive kroniske inflammatoriske responser til stede i IBD pasienter utvikler seg i genetisk disponerte individer ved unormal eksponering av intestinal mucosal immunsystem til enteriske bakterier 2, derfor studiet av modeller av infeksiøs kolitt tilbyr også et betydelig potensial for å definere potensielt sykdomsfremkallende vert . Responsen på enteriske bakterier citrobacter rodentium indusert kolitt er en av de sjeldne modeller av infeksiøs kolitt som har blitt godt karakterisert 1,3, slik at for analyse av verten responser på enteriske bakterier og videre forståelse av potensielle mekanismer IBD patogenesen, en avgjørende skritt i å utvikle nye forebyggende og terapeutiske behandlinger.
C. rodentium er en gram negativ feste og effacing (A / E), murine spesifikk bakteriell patogen som er nært knyttet til viktige menneskeligepatogener enteropatogene E. coli (EPEC) og enterohaemorrhagic E. coli (EHEC) 3-8. Familien av A / E patogener intimt feste til den apikale vertscelle membran av cecal og colonic epitel, danner en ikke-invasiv pidestall-lignende struktur på vertscellen. Oral utfordring med C. rodentium av 10 8 -10 9 organismer produserer en robust modell av infeksiøs kolitt preget av colonic hyperplasi eller forlengelse av crypts, mononukleære immunceller infiltrasjon og pokal celle utarming 3,4. Den innledende stedet kolonisering, et par timer etter utfordring, er på cecal lapp, etterfulgt av progresjon til distale colon 2-3 dager etter smitte 3. I immunkompetente musestammer, er clearance av organismen oppnådd 3 til 4 uker etter smitte 1,3,4. Men mange genmodifiserte stammer, dvs. genet mangelfull eller knockout (- / -), er mus, blitt funnet å vise øktsed mottakelighet for infeksjon resulterer i overdreven skade og / eller kronisk infeksjon og betennelse 9-14. Bruk av denne smittsomme kolitt modell i disse knockout stammer, mange mangler medfødte signal proteiner, har vært uunnværlig i å avsløre flere vert proteiner integrert i oppløsning på intestinal infeksjon og betennelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Utarbeidelse av citrobacter rodentium Inoculum og oral sonde til mus
- Forberede og autoklaver Luria Bertani buljong (LB).
- Skaffe levedyktig C. rodentium fra en frossen glyserol lager og strek på LB agar plate ved hjelp av en steril podeøse eller pipettespissen. Inkuber ved 37 ° C over natten. Inokuler 3 ml steril LB-næringsløsning i falk kultur rør med kolonier fra LB plate ved hjelp av en podeøse eller pipettespissen. Fremstilling av inokulum skal gjøres med aseptiske teknikker.
- Inkuber C. rodentium kultur aerobt ved 37 ° C over natten i en stasjonær inkubering risteapparat ved 200 rpm. Det inokulerte LB kjøttkraft skal vises skyet etter overnatter kultur.
- Bruke en pære tipped gastrisk gavage nål festet til en 1 ml sprøyte til gavage hver mus med 100 pl av den over natten C. rodentium kultur. Forsiktig scruff musen, ved å ta godt tak i løs hud over nakken og ryggenmed tommelen og fingrene. Trekk tilbake dyrets hode med pekefingeren for å immobilisere hodet og rett i spiserøret for innsetting av gavage nål.
- Opprettholde musen i oppreist stilling og direkte pære spissen av gavage nål langs siden av munnen sin og over tungen sin. Forsiktig passere nålen langs taket av munnen og avansere den ned i spiserøret. Hvis det er noen motstand følte under denne prosedyren, må du fjerne gavage nål og sett det.
- Injiser sakte 100 ul av den bakterielle inokulat og fjern forsiktig gavage nålen. Overvåk pust og oppførselen til mus etter å returnere den til buret sitt.
Merknader:
- I trinn 2 og 3, også utarbeide en falk kultur rør ved hjelp av aseptiske teknikker med 3 ml steril LB-næringsløsning til dyrkes over natten for å sikre at det er ingen bakteriell kontaminering av kjøttkraft selv. LB kjøttkraft skal være klar etter overnatter kultur.
- Overnatter kultur skal kastes dersom det har blitt vaksinert for over 24 timer.
- Alle C. rodentium infeksjoner og boliger av infiserte dyr bør utføres i en biosikkerhetsnivå 2 anlegget.
2. Måling Colonic epithelial Barrier Permeabilitet i C. rodentium-infiserte mus
- Måle barriere integritet på et ønsket tidspunkt etter infeksjon.
- På dagen for analysen, forberede nok 4 kDa fluorescein isothiocyanat (FITC)-dekstran oppløst i fosfatbufret saltvann (PBS) til en konsentrasjon på 80 mg ml -1 til gavage hver mus med 150 pl og forberede standardkurven.
- Scruff musen og gavage med 150 ul FITC-dekstran. Uttak mat fra buret på denne tiden.
- Anesthetize mus fire timer ettergavaging og samle så mye blod som mulig (~ 450 ul) gjennom hjertepunktur. Legg blodet til en sluttkonsentrasjon på 3% syre-citrat dekstrose i en mikrosentrifugerør å avskrekke koagulering. Avlive mus og samle colonic vev i PBS for bakterieveksten (trinn 3.1 til 3.5) og i 10% formalin for vev fiksering og til slutt immunfluorescens flekker (trinn 4.1 til 4.8).
- Spinne blodprøver ved 1000 xg i 12 min i en sentrifuge ved 4 ° C. Samle serum og fortynn til 1/10 og 1/100 i PBS. Legg 100 ul av hver prøve på disse to fortynninger til en 96 brønn plate i replikater.
- For å forberede den standardkurven, fortynne den opprinnelige 80 mg ml -1 FITC-dekstran pleide å gavage musene i PBS til følgende konsentrasjoner: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25 og 0 ug / ml . Legg 100 ul av hver konsentrasjon til en 96 brønns plate i triplikat.
- Kvantifisere fluorescens for hver prøve ved hjelp av en fluorometer på en eksitasjon wavelength av 485 nm og 535 nm emisjonsbølgelengde.
- Analysere rådataene ved plotting standardkurven. Input rådataene for hver prøve til ligningen for linje som genereres av standardkurven for å bestemme konsentrasjonen av FITC-dekstran i hver prøve.
Merknader:
- Fra trinn 4 og fremover, holde blodprøver på is og minimere eksponering for lys.
- Ved måling epiteliale barriere integritet et tidspunkt på, eller før, er 7 dager etter infeksjon optimalt, som alvorlig vevsskade oppstår etter dette tidspunktet. Måling barriere integritet før alvorlig skade inntreffer kan du bestemme maksimal forskjeller i permeabilitet i løpet C. rodentium smitte mellom muselinjer.
- Sørg for at infisert kontroll mus er også testet for epithelial barriere integritet.
3. Måling av bakteriell belastning i vev i C. rodentium-infiserte mus
- Tilsett 1 ml steril PBS ennd en autoklaverte metall perle til en rundbunnet 2 ml sentrifugerør ved bruk av aseptisk teknikk. Individuelle vev samlet fra hvert dyr skal plasseres i egne PBS rør. Vei rørene før tilsetning av vev.
- Fjern cecum og tykktarm fra musen. Separer cecum i tykktarm og presse ut de luminal innholdet med pinsett. Legge til innholdet i et PBS rør. Etter å skille 0,5 cm seksjoner fra den distale kolon og cecum for 10% formalin fiksering, kutte åpne de resterende tykktarm og cecum lengderetningen og vask med sterilt PBS før du legger vev i rør.
- Veie PBS rørene med vev og deretter homogenisere prøvene ved hjelp av en perle beater i 6 min ved 30 Hz.
- Med aseptiske teknikker, tilsett 180 pl steril PBS per brønn til en 96 brønns plate. Tilsett 20 ul av hver homogenisert prøve til den første brønnen i hver rad. Bland godt og serielt fortynne, legger 20 ul fra hver tidligere godt å få fortynninger fra 10 -1 (første vill) til 10 -6. Plate 10 ul av hver fortynning fra hver prøve i triplikat på en firkantet bunn LB plate med et rutenett. Inkuber over natten ved 37 ° C.
- Telle koloni dannende enheter (CFU), deretter gjennomsnittlig 3 teller, og registrere fortynning hvor hver prøve ble talt. Multipliser gjennomsnittlige CFU med 50, som 20 pl av den opprinnelige 1 ml prøve ble brukt, og med fortynningsfaktoren der prøven ble tellet som resulterer i CFU / ml. Endelig dele på vev vekt for å avgjøre CFU / g.
4. Histologiske undersøkelser og Immunofluorescence Farging av infiserte Colon vev
- Samle vev som i trinn 3.2. Oppbevar vev i formalin over natten, vask deretter med 70% etanol. Legge vev i parafin og kuttet fem mikrometer seksjoner for farging. Flekken med hematoxylin & eosin for histologiske undersøkelser og fortsette til neste trinn for immunfluorescens flekker.
- Å deparaffinize vev før farging, glir sted ien Coplin farging krukke og satt i 65 ° C vannbad i 10 min. Deretter plasserer lysbilder i xylen for fire vasker av 2 min hver. Lysbilder bør deretter bli utvannet med to 5-liten vaskinger i 100% etanol, etterfulgt av en 5 min vask i hver av de følgende: 95% etanol, 75% etanol og dH 2 0. Disse vasker bør gjøres i en avtrekkshette for å unngå eksponering for skadelige damper.
- Plasser lysbildene i Coplin krukke med forvarmet natriumsitrat buffer og deretter plassere inn et dampskip i 30 min, så la sitte i 30 minutter. Denne prosessen bryter proteinet kryssbindinger dannet av formalin fiksering hente potensielle antigeniske steder.
- Vask med PBS-azid i 5 min, tre ganger. Tørre lysbilder og mark område rundt vevet med en PAP penn for å opprette en hydrofob barriere, holde flekker reagenser lokalisert på vevet.
- Blokk vev i 1 time ved romtemperatur med blokkerende buffer (f.eks α-geit serum) i en farging fuktighet kammer.
- Fortynne primær antistoff til ønsket konsentrasjon ved hjelp av antistoff fortynningsbuffer. Hell av blokkering buffer og legge 50-100 ul av primær antistoff til vev. Inkuber ved 4 ° C over natten eller ved romtemperatur i 2 timer.
- Vask med PBS-azid i 5 min, tre ganger. Legg 50-100 pl sekundært antistoff fortynnet i antistoff fortynningsbuffer til vev og inkuber ved romtemperatur i 1 time i mørke. Vask med dH 2 O i 5 min, tre ganger.
- Dehydrate lysbilder, legge DAPI Forleng Gold montering medium og bruke et dekkglass. Vise lysbilder under en fluorescens mikroskop.
Merknader:
- PBS azide kan være substituert med tilberedes PBS som et alternativ for å unngå bakterievekst i vask mediet fra trinn 4 og fremover.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Under en vanlig infeksjon eksperiment, er mus infisert med ca 2,5 x 10 8 CFU gjennom gavage av 100 ul overnatter C. rodentium kultur. Infeksjon av C57BL / 6 mus med C. rodentium resultater i beskjeden og forbigående vekttap og diaré. Selv om en sjelden forekomst med C57BL / 6 mus, kan dyr blir syke og må euthanization. Derfor bør mus overvåkes for graden av vekttap og symptomer på nød som piloerect pels og krum holdning, for å fastslå i hvilken grad ulike stammer påvirkes av infeksjonen.
Resultater er presentert i figurene 1 til og med 4 er representative for en infeksjon gjort ved hjelp av en over natten kultur fremstilt fra en frosset glyserol lager. Ved 7 dager etter infeksjon, var mus bedøvet og blod ble oppsamlet gjennom hjertepunktur. Figur 1 viser FITC-dekstran målt i serumav C57BL / 6 mus, samt fra Toll som reseptor 2 (TLR2) knockout mus, som tidligere har blitt funnet å utvise nedsatt epiteliale barriere integritet under infeksjon 9. I nærvær av en intakt tarmepitel barriere, er 4 kDa FITC-dekstran dårlig permeabelt gjennom dette laget. Derfor økte nivåer av FITC-dekstran i serum foreslå en svekkelse av tarmepitel barriere integritet under infeksjonen slik dette molekylet å lekke over. Som en kontroll blir serumnivå i uinfiserte mus gavaged med FITC-dekstran også presentert.
Med en uke etter infeksjon, har bakterielle belastninger i tykktarmen er funnet å nå en topp rundt 10 9 CFU / g 3,4. Bakterielle laster kan måles ved ønsket tidspunkt poeng etter infeksjon for å bekrefte infeksjon, samt å vurdere om forskjellige knockout mus lider øket eller reduserte bakterielle byrder. Som C. rodentium er en luminal patogen som kan intimt adhere til intestinal epitelceller, bakterielle belastninger i luminal innholdet, cecal og colonic vev kan måles. Figur 2 viser typiske bakterielle belastninger målt på dag 7 etter infeksjon cecal og colonic vev samt innen intestinal lumen C57BL / 6 mus.
Mesteparten av patologi observert under C. rodentium infeksjon i C57BL / 6 mus forekommer i distale 2 cm av colon11. Makroskopisk etter dag 7 etter infeksjon, er en fortykkelse av colonic slimhinnene samt en forkorting i lengde av tykktarmen observert, med lite utilslørt skader sett i C57BL / 6 mus. Normalt under infeksjon, C57BL / 6 mus lider bare moderat betennelse og patologi preget histologisk av immunceller infiltrasjon, forlengelse av colonic krypter og pokal celle uttømming (figur 3).
Som sett i H & E seksjoner i Figur 3, er flere vert responser montert during infeksjon med C. rodentium. For ytterligere å karakterisere disse endringene, kan immunfluorescens flekker brukes til å undersøke endringer i proteiner av interesse, for eksempel markører for spredning, celledød, eller medfødte og ervervede immunresponser. Immunfluorescens farging er også verdifull i å undersøke deler av bakteriell respons, for eksempel dens lokalisering innenfor infisert vev. Et eksempel på denne farging teknikken, undersøker en vert protein Ki67 (rød), en markør for celleproliferasjon og C. rodentium protein tir, grønt, for å undersøke bakteriell lokalisering på dag 12 etter infeksjon er presentert i Figur 4.
Figur 1. Måling av serum FITC-dekstran å vurdere epithelial barriere integritet. Mus vargavaged med 4 kDa FITC-dextran henhold uinfiserte forhold og ved 7 dager etter infeksjon, etter som serum FITC-dextran nivåer ble bestemt. C57BL / 6 (WT) mus oppviser en ubetydelig økning i FITC-dextran serumnivåer på 7 dager etter infeksjon sammenlignet med uinfiserte forhold. I kontrast, TLR2 - / - har mus betydelig økt nivå av FTIC-dekstran i serum sammenlignet med baseline tyder alvorlig svekket barriere integritet i denne belastningen under C. rodentium infeksjon, har som tidligere vært vist.
Figur 2. C. rodentium last i lumen, cecum og tykktarm av infiserte C57BL / 6 mus på 7 dager etter smitte. Lumen, cecal, og colonic vev ble samlet inn, homogenisert, og belagt i seriell fortynning på LB agar. Hver Circle representerer en enkelt prøve samlet fra individuelle dyr. Heltrukne linjene viser det geometriske gjennomsnittet, mens vertikale feilfelt indikerer SEM.
Figur 3. Histologisk analyse av skade forårsaket av C. rodentium infeksjon. Etter dag 7 post-infeksjon moderat immunceller infiltrasjon, samt forlengelse av krypter, pokal celle uttømming og mild ødem er observert i forhold til å kontrollere infisert vev. Klikk her for å se større figur .
Figur 4. Immunfluorescens flekker på infisert og dag 12 etter smittesjon vev av C57BL / 6 mus. Distal colonic vev er farget for verten protein Ki67 (rød) og C. rodentium protein tir (grønn).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Citrobacter rodentium infeksjon gir en verdifull modell for studiet av både smittsomme sykdommer og kolitt i mus. Denne unike modellen tillater for karakterisering av både vert responser, samt patogene egenskaper av bakterier. Fremgangsmåten som er beskrevet i denne protokollen detalj vellykket bruk av denne modellen.
Det er flere kritiske trinnene i denne protokollen å huske på når du induserer kolitt og analysere svarene. Først, utarbeidelse av en frisk over natten C. rodentium inokulatet i LB-næringsløsning er nødvendig for vellykket infeksjon av mus. Som en dose på 10 8 -10 9 organismer er nødvendig for å infisere de fleste stammer av mus, hvis inokulatet er igjen i shaker eller på benkeplaten ved romtemperatur i lengre perioder, vil det ikke være nok levedyktige organismer som er igjen i kulturen å indusere kolitt ved infeksjon. Det er også viktig å agitere det bakterielle inokulum førLaster sprøyten for infeksjon, for å sikre at hver mus mottar en lik dose av bakterier. Ved innsamling vev ved terminus av infeksjonen, fullføre submersion av colonic vev i en rikelig mengde 10% formalin er nødvendig for riktig vev fiksering å skje. Er det foreslått at vev legges til formalin i en 5 ml ampulle, snarere enn inn mikrosentrifugerør som forholdet 10:1 av fikseringsmiddel for å vev er anbefalt. Riktig fiksering er avgjørende for senere histologisk analyse, samt immunfluorescens farging av disse vev. Det er også viktig å huske på at ulike knockout stammer vil ha varierende svar på induksjon av C. rodentium kolitt. Når infisere en ny stamme for første gang, bør mus nøye overvåket for å bestemme en human endepunkt for eksperimentet, om nødvendig. Tidspunkter for analyse av epiteliale barriere integritet, bakterielle belastninger, og histologi kan defineres basert på responsen av musenstamme av interesse for infeksjonen.
Som plettering av vev homogenater på LB plater for å bestemme bakterielle belastninger er ikke en helt selektiv metode, utføre PCR for en C. rodentium spesifikt gen på bakteriekolonier kan gjøres for å skille C. rodentium fra andre bacterialcolonies på plate. Et annet alternativ er å plate vev homogenater på MacConkey agar, som dette mediet er mer selektiv for C. rodentium enn LB agar. En alternativ tilnærming er å bruke en streptomycin resistente villtype C. rodentium stamme instead.Substitution med streptomycin resistent stamme vil resultere i induksjon av den samme kolitt modellen beskrevet i denne protokollen. Fordelen med å bruke streptomycin resistent stamme er for enklere analyse av bakterielle belastninger, som vev homogenater fra disse infeksjonene kan bli belagt på LB agar supplert med streptomycin enn LB agar alene. Dette unngår potensiell vekst av commensal mikrober på plate, noe som gjør CFU telling prosessen enklere og mer nøyaktig. Et annet alternativ mens måling bakterielle belastning, er å inkubere platene etter plating fortynninger av vev homogenater på LB agar på enten 37 ° C over natten eller ved romtemperatur i 2-3 dager, noe som resulterer i lavere bakterievekst, før telling.
Denne protokollen skisserer trinnene som kreves for å produsere en robust modell av smittsomme kolitt, samt de metoder som brukes for å karakterisere C. rodentium infeksjon hos mus. Bortsett fra å bruke denne modellen for å undersøke patogen-vert interaksjoner og immunresponser, kan den også brukes til å studere hvordan en bakteriell infeksjon kan øke risikoen for tykktarmskreft. Dette kan gjøres ved å utsette C. rodentium smittet mus til kreftfremkallende azoxymethane, eller ved å studere hvordan smitte virkninger på epithelial celleproliferasjon, eller på gener som er involvert i epitelcelleopprinnelse differensiering eller svulst utvikling 15. Ossing den smittsomme kolitt modellen skissert i denne protokollen, kan bakterielle tall også vurderes på ekstra-intestinale områder, for eksempel mesenteric lymfeknuter, milt og lever. Høyere tall i disse organene kan tyde på at musen belastningen blir testet er svært utsatt for smitte. Bruke immunfluorescens farging teknikken beskrevet, kan et nesten uendelig antall mekanismer som svar på infeksjon bli utforsket. Gang kjent med teknikkene beskrevet her, kan protokollen endres for å samle vev å måle andre endepunkter, slik som for RNA ekstraksjon og vurdering av genuttrykk nivåer, til mer grundig karakterisere responser til C. rodentium infeksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av driftstilskudd til BAV fra Crohns og kolitt Foundation of Canada (CCFC) og den kanadiske Institutes for Health Research (CIHR). GB ble finansiert av en utdannet studieplass fra CIHR. BAV er barna med Intestinal og leversykdommer (barn) Foundation Chair of Pediatric IBD Forskning og Canada Research Chair i Pediatric Gastroenterology.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
- Nell, S., Seurbaum, S., Josenhans, C. The impact of microbiota on the pathogenesis of IBD: lessons from mouse infection models. Nature Reviews Microbiology. 8, 564-577 (2010).
- Cario, E. Toll-like Receptors in Inflammatory Bowel Diseases: A Decade Later. Inflammatory Bowel Diseases. 16 (9), 1583-1597 (2010).
- Eckmann, L. Animal Models of Inflammatory Bowel Disease. Annals New York Academy of Sciences. , 1027-38 (2006).
- Mundy, R., MacDonald, T. T., Dougan, G., Frankel, G., Wiles, S. Citrobacter rodentium of mice and man. Cellular Microbiology. 7, 1697-1706 (2005).
- Luperchio, S., Schauer, D. Molecular pathogenesis of Citrobacter rodentium and transmissible murine colonic hyperplasia. Microbes and Infection. 3 (4), 333-340 (2001).
- Bergstrom, K. S., Sham, H. P., Zarepour, M., Vallance, B. A. Innate host responses to enteric bacterial pathogens: a balancing act between resistance and tolerance. Cellular Microbiology. 14, 475-484 (2012).
- MacDonald, T. T., Frankel, G., Dougan, G., Goncalves, N. S., Simmons, C. Host defences to Citrobacter rodentium. International Journal of Medical Microbiology. 293, 87-93 (2003).
- Borenshtein, D., McBee, M. E., Schauer, D. B. Utility of the Citrobacter rodentium infection model in laboratory mice. Current Opinion in Gastroenterology. 24, 32-37 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Rosenberger, C. M., Bergstrom, K. S. B., Valdez, Y., Huang, J. T., Khan, M. A., Vallance, B. A. Toll-like receptor 2 plays a critical role in maintaining mucosal integrity during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10, 388-403 (2008).
- Dennis, A., Kudo, T., et al. The p50 subunit of NF-κB is critical for in vivo clearance of the non-invasive enteric pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 76 (11), 4978-4988 (2008).
- Gibson, D. L., Ma, C., Bergstrom, K. S. B., Huang, J. T., Man, C., Vallance, B. A. MyD88 signalling plays a critical role in host defence by controlling pathogen burden and promoting epithelial cell homeostasis during Citrobacter rodentium-induced colitis. Cellular Microbiology. 10 (3), 618-631 (2008).
- Lebeis, S. L., Bommarius, B., Parkos, C. A., Sherman, M. A., Kalman, D. TLR signaling mediated by MyD88 is required for a protective innate immune response by neutrophils to Citrobacter rodentium. Journal of Immunology. 179 (1), 566-577 (2007).
- Bry, L., Brenner, M. B. Critical role of T cell dependent serum antibody, but not the gut-associated lymphoid tissue, for surviving acute mucosal infection with Citrobacter rodentium, an attaching and effacing pathogen. Journal of Immunology. 172 (1), 433-441 (2004).
- Simmons, C. P., Clare, S., et al. Central role for B lymphocytes and CD4+ T cells in immunity to infection by the attaching and effacing pathogen Citrobacter rodentium. Infection & Immunity. 71 (9), 5077-5086 (2003).
- Ahmed, I., Chandrakesan, P., Tawfik, O., Xia, L., Anant, S., Umar, S. Critical Roles of Notch and Wnt/β-Catenin Pathways in the Regulation of Hyperplasia and/or Colitis in Response to Bacterial Infection. Infection & Immunity. 80 (9), 3107-3121 (2012).
