Summary
Citrobacter rodentium infection constitue un modèle précieux pour l'étude des infections bactériennes entériques ainsi que l'hôte réponses immunitaires et la colite chez la souris. Ce protocole décrit la mesure du intégrité de la barrière, la charge de pathogènes et les dommages histologiques permettant la caractérisation approfondie des contributions pathogène et de l'hôte à la colite infectieuse murin.
Abstract
Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour produire un modèle robuste d'une maladie infectieuse et la colite, ainsi que les méthodes utilisées pour caractériser l'infection Citrobacter rodentium chez la souris. C. rodentium est une gram négatif, murin pathogène spécifique bactérienne qui est étroitement liée à l'importance clinique humaine entéropathogène pathogènes E. coli entérohémorragique et E. coli. Lors de l'infection à C. rodentium, souris immunocompétentes souffrent de la perte de poids modeste et transitoire et de la diarrhée. Histologiquement, l'allongement crypte intestinale, l'infiltration de cellules immunitaires, et l'épuisement des cellules caliciformes sont observées. Garde d'infection est atteinte après 3 à 4 semaines. Mesure de l'intégrité barrière épithéliale intestinale, la charge bactérienne, et les dommages histologiques à différents moments après l'infection, permettent la caractérisation des souches de souris sensibles à l'infection.
Le mécanisme de virulences par des bactéries pathogènes qui colonisent le tractus intestinal de leurs hôtes, ainsi que les réponses spécifiques de l'hôte qui défendent contre de telles infections sont mal compris. Par conséquent, le C. rodentium modèle d'infection bactérienne entérique constitue un outil précieux pour aider à la compréhension de ces processus. Les bactéries entériques ont également été associés à des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Il a été émis l'hypothèse que les réponses inflammatoires chroniques inadaptés observés chez les patients MICI se développer en individus génétiquement sensibles après une exposition anormale du système immunitaire intestinal des muqueuses à des bactéries entériques. Par conséquent, l'étude des modèles de colite infectieuse offre un potentiel important pour la définition potentiellement pathogènes réponse de l'hôte aux bactéries entériques. C. rodentium colite induite est un modèle du genre rare qui permet l'analyse des réponses de l'hôte aux bactéries entériques, approfondir notre compréhension des mécanismes potentiels de la pathogenèse du commerce international;essentiel dans le développement de nouveaux traitements préventifs et thérapeutiques.
Introduction
L'infection par des bactéries pathogènes entériques déclenche gastro-intestinal (GI) l'inflammation, ainsi que pathologie intestinale et la physiopathologie, y compris la diarrhée intestinale et dysfonction de la barrière épithéliale. Les mécanismes de virulence des bactéries pathogènes qui colonisent le tractus gastro-intestinal de leurs hôtes, ainsi que les réponses spécifiques de l'hôte qui défendent contre de telles infections sont mal comprises, mais les progrès récents dans la modélisation des infections entériques bactériennes ont commencé à nous aider dans notre compréhension de ces processus. Les bactéries entériques ont également été associés à des maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Maladie de Crohn Le MII (CD) et UC sont des maladies complexes d'étiologie inconnue, caractérisée par une inflammation intestinale chronique et des lésions tissulaires. De nombreux modèles murins d'inflammation intestinale existent, d'une inflammation spontanée des souches génétiquement modifiés, tels que l'IL10 - / - souris, aux défis chimiques avec des composés tels que le sulfate de dextrane sodique (DSS) et dinitrobenzene sulfonique (DNBS) 1. Il a été émis l'hypothèse que les réponses inadaptées chroniques inflammatoires présentes chez les patients MICI se développer en individus génétiquement sensibles à l'exposition anormale du système immunitaire intestinal muqueuse de bactéries entériques 2, donc l'étude des modèles de colite infectieuse offre également un potentiel important pour la définition de l'hôte potentiellement pathogène . réponses à des bactéries entériques Citrobacter rodentium colite induite est l'un des rares modèles de colite infectieuse qui a été bien caractérisés 1,3, ce qui permet l'analyse des réponses de l'hôte aux bactéries entériques et de la compréhension de nouveaux mécanismes potentiels de la pathogenèse de MICI, une étape essentielle dans le développement de nouveaux traitements préventifs et thérapeutiques.
C. rodentium est une gram négatif attachant et effaçant (A / E), murin pathogène bactérien spécifique qui est étroitement liée à l'humain importantentéropathogène pathogènes E. coli (EPEC) et entérohémorragique E. coli (EHEC) 3-8. La famille d'un des agents pathogènes / E intimement joindre à la membrane de la cellule hôte apicale de l'épithélium du caecum et du côlon, la formation d'un non-invasive piédestal structure en forme de la cellule hôte. Provocation par voie orale avec C. rodentium de 10 8 -10 9 organismes produisant un modèle robuste d'une colite infectieuse caractérisée par une hyperplasie du côlon ou de l'allongement des cryptes, infiltration mononucléaire cellules immunitaires et l'épuisement des cellules caliciformes 3,4. Le site initial de la colonisation, quelques heures après la provocation, est le patch du caecum, suivie par une progression dans le côlon distal 2 à 3 jours après l'infection 3. Dans souches de souris immunocompétentes, l'élimination de l'agent pathogène est atteinte 3 à 4 semaines après l'infection 1,3,4. Cependant, de nombreuses souches génétiquement modifiés, c.-à-gène déficient ou KO (- / -) des souris, ont été trouvés pour afficher augsed susceptibilité à l'infection causant des dommages exagérés et / ou d'une infection chronique et l'inflammation 9-14. L'utilisation de ce modèle de colite infectieuse chez ces souches huitièmes de finale, beaucoup manquent innées protéines de signalisation, a été indispensable pour révéler plusieurs protéines de l'hôte faisant partie intégrante de la résolution de l'infection et de l'inflammation intestinale.
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Protocol
1. Préparation de l'inoculum et Citrobacter rodentium gavage de souris
- Préparer et passer à l'autoclave Luria Bertani (LB).
- Obtenir viable C. rodentium à partir d'un stock de glycerol congelé et sans stries sur gélose LB à l'aide d'une anse stérile inoculation ou de pointe de la pipette. Incuber à 37 ° C pendant la nuit. Inoculer 3 ml de bouillon LB stérile dans un tube de culture faucon avec des colonies de la plaque de LB en utilisant une boucle d'inoculation ou de pointe de la pipette. Préparation de l'inoculum doit être fait en utilisant des techniques aseptiques.
- Incuber la C. culture rodentium en aérobiose à 37 ° C pendant la nuit dans une incubation de table agitateur à 200 tpm. Le bouillon LB inoculé devrait apparaître nuageux après une nuit de culture.
- Utilisez une ampoule à pointe aiguille de gavage gastrique attachée à une seringue de 1 ml à chaque souris gavage avec 100 ul de la nuit C. rodentium culture. Doucement nuque de la souris, en tenant fermement la peau lâche sur son cou et le dosavec le pouce et les doigts. Tirez la tête de l'animal avec votre index pour immobiliser la tête et redresser l'œsophage pour l'insertion de l'aiguille de gavage.
- Maintenir la souris dans une position verticale et de diriger la pointe de l'aiguille ampoule gavage sur le côté de sa bouche et sur sa langue. Doucement passer l'aiguille sur le toit de la bouche et le faire avancer dans l'œsophage. S'il ya une résistance ressentie lors de cette procédure, retirez l'aiguille gavage et réinsérez-le.
- Lentement, injecter 100 ml de l'inoculum bactérien et retirez délicatement l'aiguille de gavage. Surveiller le rythme de la respiration et le comportement de la souris après le retourner à sa cage.
Notes:
- Dans les étapes 2 et 3, également préparer un tube de culture en utilisant des techniques aseptiques faucon avec 3 ml de bouillon LB stérile pour être cultivées pendant une nuit pour s'assurer qu'il n'y ait pas de contamination bactérienne du bouillon lui-même. Le bouillon LB doit être limpide après une nuit de culture.
- Culture d'une nuit doit être jeté s'il a été vacciné depuis plus de 24 heures.
- Toutes C. rodentium infections et de logement des animaux infectés doivent être effectuées dans un centre de biosécurité de niveau 2.
2. Mesure de la perméabilité colique barrière épithéliale en C. rodentium souris infectées
- Mesurer intégrité de la barrière à un moment souhaité après l'infection.
- Le jour de l'essai, préparer suffisamment de 4 kDa isothiocyanate de fluorescéine (FITC)-dextrane dissous dans un tampon phosphate salin (PBS) à une concentration de 80 -1 mg ml à chaque souris gavage avec 150 pi et de préparer la courbe d'étalonnage.
- Scruff la souris et le gavage avec 150 ul de FITC-dextran. Retirer la nourriture de la cage pour le moment.
- Anesthésier les souris 4 heures aprèsgavage et de recueillir autant de sang que possible (~ 450 pi) par ponction cardiaque. Ajouter le sang à une concentration finale de 3% d'acide citrate dextrose dans un microtube pour empêcher la coagulation. Euthanasier les souris et recueillir des tissus du côlon chez PBS pour le nombre de bactéries (étapes 3,1 à 3,5) et dans 10% de formol pour la fixation des tissus et, finalement, l'immunofluorescence (étapes 4,1 à 4,8).
- Faites tourner les échantillons de sang à 1000 xg pendant 12 min dans une centrifugeuse à 4 ° C. Recueillir le sérum et diluer à 1/10 et 1/100 dans du PBS. Ajouter 100 ul de chaque échantillon à ces deux dilutions sur une plaque de 96 puits dans répétitions.
- Pour préparer la courbe d'étalonnage, diluer l'original 80 mg ml -1 FITC-dextran utilisé pour gavage des souris dans du PBS pour les concentrations suivantes: 800, 400, 200, 100, 50, 25, 12,5, 6,25, et 0 pg / ml . Ajouter 100 ul de chaque concentration à une plaque de 96 puits en trois exemplaires.
- Quantifier la fluorescence de chaque échantillon à l'aide d'un fluorimètre à une excitation wavelength de 485 nm et de longueur d'onde d'émission de 535 nm.
- Analyser les données brutes en traçant la courbe standard. Saisissez les données brutes de chaque échantillon dans l'équation de la droite engendrée par la courbe standard pour déterminer la concentration de FITC-dextran dans chaque échantillon.
Notes:
- Partir de l'étape 4 et suivants, conserver des échantillons de sang sur la glace et de minimiser l'exposition à la lumière.
- Lors de la mesure intégrité de la barrière épithéliale un point dans le temps, ou avant, 7 jours post-infection est optimale, car de graves lésions tissulaires partir de cet instant. Mesure intégrité de la barrière avant se produise des dommages graves vous permet de déterminer les différences maximales de perméabilité au cours de C. infection rodentium entre les souches de souris.
- Assurez-vous que les souris témoins non infectés sont également testés pour intégrité de la barrière épithéliale.
3. Mesure de la charge bactérienne dans les tissus de C. rodentium souris infectées
- Ajouter 1 ml de PBS stérile d'une un métal autoclave talon à fond rond d'un tube de 2 ml centrifugeuse utilisant une technique aseptique. Les différents tissus prélevés sur chaque animal seront placés dans des tubes séparés PBS. Peser les tubes avant l'addition du tissu.
- Retirez le caecum et le côlon de la souris. Séparer le caecum du côlon et poussez le contenu luminal à l'aide de pinces. Ajouter le contenu d'un tube de PBS. Après séparation de 0,5 cm sections de la partie distale du côlon et du caecum pour la fixation au formol à 10%, couper le reste du côlon et du caecum longitudinalement et laver avec du PBS stérile avant de les placer dans des tubes de tissus.
- Peser les tubes PBS avec le tissu, puis homogénéiser les échantillons à l'aide d'un fouet perles pendant 6 min à 30 Hz.
- En utilisant des techniques aseptiques, ajouter 180 ul de PBS stérile par puits d'une plaque 96 puits. Ajouter 20 ul de chaque échantillon homogénéisé au premier puits de chaque rangée. Bien mélanger et diluer en série, en ajoutant 20 pl de chaque précédente ainsi d'obtenir des dilutions de 10 -1 (d'abord nousll) à 10 -6. Planche 10 ul de chaque dilution de chaque échantillon en triple sur une plaque LB fond carré avec une grille. Incuber une nuit à 37 ° C.
- Comptez unités formant colonies (UFC), puis la moyenne des 3 chefs, et d'enregistrer la dilution à laquelle chaque échantillon a été compté. Multipliez moyenne UFC par 50, comme 20 pl de l'original 1 ml d'échantillon a été utilisé, et par le facteur de dilution à laquelle l'échantillon a été compté résultant en UFC / ml. Finalement, diviser par la masse de tissu afin de déterminer UFC / g.
4. Évaluation histologique et la coloration par immunofluorescence de tissus infectés Colon
- Recueillir des tissus comme à l'étape 3.2. Boutique de tissus dans le formol durant la nuit, puis laver avec de l'éthanol à 70%. Intégrer les tissus en paraffine et coupé 5 sections um pour la coloration. Tache avec de l'hématoxyline et de l'éosine pour évaluation histologique et procéder aux étapes suivantes pour immunofluorescence.
- Pour Déparaffiner tissus avant la coloration, le lieu glisse dansune cuvette Coplin et mettre en bain d'eau à 65 ° C pendant 10 min. Ensuite, placer les lames dans du xylène pendant quatre lavages de 2 minutes chacun. Les lames doivent être réhydratés avec deux 5-minute lavages dans de l'éthanol 100%, suivi par une 5 min de lavage dans chacune des catégories suivantes: éthanol 95%, éthanol à 75% et dH 2 0. Ces lavages doit être effectuée sous une hotte pour éviter l'exposition à des vapeurs nocives.
- Placer les lames dans la jarre Coplin avec préchauffé tampon citrate de sodium, puis le placer dans un bateau à vapeur pendant 30 min, puis laisser reposer 30 min. Ce processus rompt la réticulation de la protéine formée par la fixation au formol récupérer sites antigéniques potentiels.
- Laver avec du PBS azide pendant 5 min, trois fois. Lames sèches et la zone autour du tissu marque avec un stylo PAP pour créer une barrière hydrophobe, en gardant les réactifs de coloration localisés sur le tissu.
- Bloquer les tissus pendant 1 heure à température ambiante avec un tampon de blocage (par exemple α-sérum de chèvre) dans une chambre humide immunomarquage.
- Diluer primary anticorps à la concentration souhaitée à l'aide du tampon de dilution d'anticorps. Verser tampon bloquant et ajouter 50 à 100 ul de l'anticorps primaire dans les tissus. Incuber à 4 ° C pendant la nuit ou à la température ambiante pendant 2 heures.
- Laver avec du PBS azide pendant 5 min, trois fois. Ajouter 50-100 ul d'anticorps secondaire dilué dans un tampon de dilution d'anticorps dans les tissus et les incuber à température ambiante pendant 1 heure dans l'obscurité. Laver avec dH 2 O pendant 5 minutes, trois fois.
- Déshydrater les lames, ajouter DAPI Prolongez moyen d'or de montage et recouvrir d'une lamelle. Afficher les diapositives sous un microscope à fluorescence.
Notes:
- PBS azide peut être substitué par du PBS fraîchement préparé comme alternative pour éviter la prolifération bactérienne dans le milieu de lavage provenant de l'étape 4 en avant.
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Representative Results
Au cours d'une expérience d'infection standard, les souris sont infectées avec environ 2,5 x 10 8 UFC par gavage de 100 pi C pendant une nuit rodentium culture. L'infection des souris C57BL / 6 avec C. rodentium résultats dans la perte de poids modeste et transitoire et de la diarrhée. Bien que rare avec souris C57BL / 6, les animaux peuvent tomber malades et nécessitent l'euthanasie. Par conséquent, les souris doivent être surveillés pour le degré de perte de poids et des symptômes de détresse comme la fourrure piloerect et posture courbée, afin de déterminer la mesure dans laquelle les différentes souches sont touchés par l'infection.
Les résultats présentés dans les figures 1 à 4 sont représentatifs d'une infection fait en utilisant une culture de nuit préparé à partir d'un stock de glycerol congelé. Moins 7 jours après l'infection, les souris ont été anesthésiées et sang a été prélevé par ponction cardiaque. Figure 1 montre FITC-dextran mesurée dans le sérumdes souris C57BL / 6, ainsi que de Toll souris knock-out du récepteur 2 (TLR2), qui ont déjà été trouvés exposer altérée intégrité de la barrière épithéliale cours de l'infection 9. En présence d'une barrière épithéliale intestinale intacte, 4 kDa FITC-dextran est peu perméable à travers cette couche. Par conséquent, des niveaux accrus de FITC-dextran dans le sérum suggèrent une atteinte à l'intégrité barrière épithéliale intestinale au cours de l'infection permettant cette molécule à fuir à travers. A titre de contrôle, les concentrations sériques chez des souris non infectées gavés avec FITC-dextran sont également présentés.
D'une semaine après l'infection, la charge bactérienne dans le côlon ont été trouvés pour culminer autour de 10 9 UFC / g 3,4. Les charges bactériennes peuvent être mesurés à des points de temps après l'infection souhaité pour confirmer l'infection, ainsi que d'évaluer si les souris knock-out différents souffrent d'augmenter ou de réduire la charge bactérienne. Comme C. rodentium est un agent pathogène qui peut luminale intimement adhere aux cellules épithéliales intestinales, les charges bactériennes dans le contenu luminal, du caecum, du côlon et des tissus peut être mesurée. Figure 2 montre les charges bactériennes typiques mesurées au jour 7 post-infection des tissus caecum et du côlon ainsi que dans la lumière intestinale des souris C57BL / 6 souris.
La plupart de la pathologie observée au cours C. rodentium infection chez les souris C57BL / 6 se produit dans les 2 cm distaux du colon11. Macroscopiquement au jour 7 post-infection, un épaississement de la muqueuse colique ainsi qu'un raccourcissement de la longueur du colon est observée, avec des dégâts manifeste peu vu dans les souris C57BL / 6. Normalement, lors de l'infection, les souris C57BL / 6 souffre seulement une inflammation modérée et pathologie caractérisée histologiquement par une infiltration de cellules immunitaires, l'allongement des cryptes du côlon et de l'épuisement des cellules caliciformes (figure 3).
Comme on le voit dans les sections H & E dans la figure 3, plusieurs réponses de l'hôte sont montés au coursment infection à C. rodentium. Pour mieux caractériser ces changements, immunofluorescence peut être utilisé pour examiner les changements dans les protéines d'intérêt, tels que les marqueurs de prolifération, la mort cellulaire, ou innée et adaptative des réponses immunitaires. Immunofluorescence est également utile dans l'examen des aspects de la réponse bactérienne, tels que sa localisation dans le tissu infecté. Un exemple de cette technique de coloration, l'examen d'une protéine de l'hôte Ki67 (rouge), un marqueur de la prolifération cellulaire et l'C. rodentium protéines tir, vert, d'examiner la localisation des bactéries au jour 12 post-infection est présenté à la figure 4.
Figure 1. Mesure de sérum FITC-dextran pour évaluer l'intégrité barrière épithéliale. Les souris ont étégavées avec 4 kDa FITC-dextran dans des conditions non infectés et à 7 jours post-infection, après quoi le sérum FITC-dextran ont été déterminés. C57BL / 6 (WT) souris présentent une augmentation négligeable des taux sériques FITC-dextran à 7 jours post-infection par rapport aux conditions non infectés. En revanche, TLR2 - / - souris ont augmenté de façon significative les niveaux de SPFT-dextran dans le sérum par rapport à la valeur initiale barrière intégrité suggérant gravement compromise dans cette souche au cours C. rodentium infection, comme cela a déjà été démontré.
Figure 2. C charge rodentium dans la lumière, du caecum et du côlon de souris C57BL infecté / 6 souris à 7 jours post-infection. Lumen, du caecum, du côlon et de tissus ont été prélevés, homogénéisés, et plaqué en série de dilution sur gélose LB. Chaque cIrcle représente un seul échantillon prélevé sur des animaux individuels. Les lignes pleines indiquent la moyenne géométrique tandis que les barres d'erreur verticales indiquent SEM.
Figure 3. L'analyse histologique des dommages causés par C. infection rodentium. Au jour 7 après l'infection infiltration de cellules immunitaires modérée, ainsi que l'allongement des cryptes, l'épuisement des cellules caliciformes et un œdème léger est observée par rapport au témoin non infectées tissus. Cliquez ici pour agrandir la figure .
Figure 4. Immunofluorescence sur non infectées et 12 jours post-infectiontion des tissus de souris C57BL / 6. Distal tissus du côlon est taché pour la protéine Ki67 hôte (rouge) et le C. rodentium protéines tir (vert).
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Discussion
Citrobacter rodentium infection constitue un modèle précieux pour l'étude de deux maladies infectieuses et de la colite chez la souris. Ce modèle unique permet de caractériser des réponses de l'hôte, ainsi que les propriétés pathogènes de bactéries. Les étapes décrites dans ce protocole détail l'utilisation réussie de ce modèle.
Il ya plusieurs étapes critiques de ce protocole à garder à l'esprit lors de l'induction de colite et de l'analyse des réponses. Tout d'abord, la préparation d'un nouveau C pendant une nuit rodentium inoculum dans un bouillon LB est nécessaire à l'infection réussie de la souris. Comme une dose de 10 8 -10 9 organismes est nécessaire pour infecter la plupart des souches de souris, si l'inoculum est laissé dans le shaker ou sur la paillasse à température ambiante pendant de longues périodes, il n'y aura pas assez d'organismes viables demeurant dans la culture pour induire une colite lors de l'infection. Il est également important d'agiter l'inoculum bactérien avantle chargement de la seringue pour l'infection, à faire en sorte que chaque souris reçoit une dose égale de bactéries. Lors de la collecte des tissus sur terminale de l'infection, immersion complète des tissus du côlon dans un volume suffisant de formol à 10% est nécessaire pour la fixation du tissu propre à produire. Il est suggéré que les tissus soient ajoutés à la formaline dans un flacon de 5 ml, plutôt que dans des tubes à centrifuger comme un ratio de 10:1 de fixatif et le tissu est recommandé. La fixation adéquate est essentielle pour l'analyse histologique plus tard, ainsi que la coloration par immunofluorescence de ces tissus. Il est également important de garder à l'esprit que les souches déficientes différents ont des réponses variées lors de l'induction de C. colite rodentium. Lorsqu'il infecte une nouvelle souche pour la première fois, les souris doivent être étroitement surveillés afin de déterminer d'une façon humaine point final de l'expérience, si nécessaire. Points dans le temps pour l'analyse de l'intégrité de barrière épithéliale, les charges bactériennes, et l'histologie peut être définie sur la base de la réponse de la sourisla souche d'intérêt à l'infection.
En placage de homogénats de tissus sur des plaques LB afin de déterminer la charge bactérienne n'est pas une méthode totalement sélective, effectuant une PCR pour un C. rodentium gène spécifique sur les colonies bactériennes qui peut être fait pour différencier C. rodentium de bacterialcolonies autres sur la plaque. Une autre option est d'homogénats de tissus sur plaque de gélose Mac Conkey, que ce milieu est plus sélectif pour C. rodentium que l'agar LB. Une autre approche consiste à utiliser une résistante à la streptomycine de type sauvage C. instead.Substitution souche rodentium par une souche résistante streptomycine se traduira par l'induction de la colite même modèle décrit dans le présent protocole. L'avantage d'utiliser la souche résistante streptomycine est d'analyser plus facilement les charges bactériennes, comme les homogénats de tissus provenant de ces infections peuvent être étalées sur de la gélose LB supplémenté avec de la streptomycine plutôt que de l'agar LB seul. Cela permet d'éviter le potentiel de croissance de commmicrobes ensal sur la plaque, ce qui rend le processus de comptage CFU plus facile et plus précis. Une autre solution, tout en mesurant la charge bactérienne, est d'incuber les plaques après étalement de dilutions homogénats de tissus sur une gélose LB à 37 ° C soit pendant une nuit à la température ambiante ou à 2-3 jours, ce qui entraîne la croissance bactérienne plus lente, avant le comptage.
Ce protocole décrit les étapes nécessaires pour produire un modèle robuste d'une colite infectieuse, ainsi que les méthodes utilisées pour caractériser C. rodentium infection chez la souris. Mis à part l'utilisation de ce modèle pour étudier les interactions hôte-pathogène et les réponses immunitaires, elle peut également être utilisée pour étudier comment une infection bactérienne peut augmenter le risque de cancer du côlon. Cela peut être fait en exposant C. rodentium infecté des souris à la azoxyméthane cancérogène, ou en étudiant la façon dont les impacts sur l'infection prolifération des cellules épithéliales, ou sur les gènes impliqués dans la différenciation des cellules épithéliales ou le développement de tumeurs 15. Noustion du modèle colite infectieuse décrite dans le présent protocole, le nombre de bactéries peut également être évaluée à des sites extra-intestinaux, tels que les ganglions lymphatiques mésentériques, la rate et le foie. Un plus grand nombre de ces organes peut indiquer que la souche de souris testées est très sensible à l'infection. En utilisant la technique décrite immunofluorescence, un nombre quasi-illimité de mécanismes en réponse à l'infection peuvent être explorées. Une fois familiarisé avec les techniques décrites ici, le protocole peut être modifié pour recueillir des tissus pour mesurer d'autres paramètres, tels que l'extraction de l'ARN et l'évaluation des niveaux d'expression des gènes, de mieux caractériser les réponses à C. rodentium infection.
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Disclosures
Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêts financiers.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par des subventions de fonctionnement aux BAV de la maladie de Crohn et la colite Foundation of Canada (CCFC) et les Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC). Go a été financée par une bourse d'études supérieures des IRSC. BAV sont les enfants souffrant de troubles intestinaux et du foie (ENFANT) Président de la Fondation de la recherche sur les MII de pédiatrie et la Chaire de recherche du Canada en gastroentérologie pédiatrique.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Luria Broth | ABM | G247 | Add 25 g of LB powder to 1L of water. Autoclave before using. |
| Square bottom plate with grid | Fisher | 08-757-11A | |
| Falcon culture tube | Sarstedt | 62.515.006 | |
| Bulb tipped gastric gavage needle | Fine Science Tools | 18060-20 | |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309659 | |
| 4 kDa FITC-dextran | Sigma | FD-4 | |
| Citric acid | Sigma | C7129 | |
| Sodium citrate | Fisher | S279-500 | |
| Dextrose | Fisher | D16.1 | |
| Acid citrate dextrose | 20 mM ctiric acid, 110 mM sodium citrate, 5 mM dextrose | ||
| Black 96-well plate | Fisher | 07-200-762 | |
| Metal beads (5 mm) | Qiagen | 69989 | |
| 10% formalin | Fisher | 5F93-4 | |
| 5 ml vial | DiaMed | STK3205 | |
| Hematoxylin | Fisher | H345-23 | |
| Eosin | Fisher | E511-100 | |
| Xylene | Fisher | HC700-1GAL | |
| Tween 20 | Sigma | P5927 | |
| Coplin staining jar | VWR | 47751-792 | |
| Sodium citrate buffer | 10 mM sodium citrate, 0.05% Tween 20, pH 6.0 | ||
| Pap pen | Cedarlane | Mu22 | |
| Goat serum | Sigma | G902-3 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Fisher | BP1600-100 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8532 | |
| Sodium azide | Sigma | SZ002 | |
| Blocking buffer | 2% goat serum, 1% BSA, 0.1% triton X-100, 0.05% Tween 20, 0.05% sodium azide, 0.01 M PBS, pH 7.2, mix & store at 4 °C. | ||
| Antibody dilution buffer | 0.1% triton X-100, 0.1% BSA, 0.05% sodium azide, 0.04% EDTA | ||
| Blocking buffer & Antibody dilution buffer for tir | Same recipes as above, but without addition of detergents (triton X-100 and tween 20) | ||
| Prolong Gold Antifade Reagent with DAPI | Invitrogen | P-36931 | |
| Coverslips | Fisher | 12.54SE | |
| Benchtop incubation shaker | Barnstead Lab Line | Max Q4000 | |
| Fluorometer | Perkin Elmer | Victor2D | |
| Refrigerated centrifuge | Beckman Coulter | Microfuge 22R | |
| Steamer | Black Decker | ||
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axio Image.Z1 |
References
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