Abstract
CD4 + регуляторных Т-клеток (Tregs) являются мощными иммуномодуляторами и играют важную функцию в человеческом иммунного гомеостаза. Истощение Tregs привело к заметному увеличению антиген-специфических Т-клеточные ответы на вакцину настройки для рака и инфекционных возбудителей. Тем не менее, их роль в ВИЧ-1 иммуно-патогенеза остается спорным, так как они могут служить либо для подавления вредных ВИЧ-1 связанных иммунную активацию и тем самым замедлить ВИЧ-1 прогрессирования заболевания или же подавлять ВИЧ-1-специфический иммунитет и тем самым стимулировать вируса распространяться. Понимание и модулирующей функции Treg в контексте ВИЧ-1 может привести к потенциальным новым стратегиям для иммунотерапии или вакцин против ВИЧ. Тем не менее, важные вопросы остаются открытыми на их роль в контексте ВИЧ-1 инфекции, которая должна быть тщательно изучена.
Представляя примерно 5% от человеческих CD4 + Т-клеток в периферической крови, изучая Treg населения оказалось трудно, ESглавным образом у ВИЧ-1-инфицированных, где ВИЧ-1-связанного CD4 Т-клеток и с этим происходит истощение Treg. Характеристика регуляторных Т-клеток у пациентов с продвинутой стадией ВИЧ-1 заболевания или тканей, для которых только очень малые биологические образцы могут быть получены, поэтому чрезвычайно сложной задачей. Мы предлагаем технические решения для преодоления этих ограничений использованием изоляции и расширения Tregs от ВИЧ-1-инфицированных.
Здесь мы опишем простой и надежный метод успешно расширять Tregs изолированы от ВИЧ-1-инфицированных в пробирке. Поток отсортированных CD3 + CD4 + CD25 + CD127 низкий Tregs были стимулированы anti-CD3/anti-CD28 покрытые гранулы и культивировали в присутствии ИЛ-2. Расширенное Tregs выразили высокие уровни FOXP3, CTLA4 и ГЕЛИОС по сравнению с обычным Т-клетки и были показаны весьма подавляющим. Более легкий доступ к большому количеству Tregs позволит исследователям адрес, который яmportant вопросы, касающиеся их роли в ВИЧ-1 иммунопатогенеза. Мы считаем, что ответы на эти вопросы опыт может оказаться полезным для развития эффективной профилактики ВИЧ-1 вакцины.
Introduction
Обладая более чем 34 миллионов людей, живущих с ВИЧ / СПИДом во всем мире и, по оценкам, 2,5 миллиона человек были впервые инфицированы в 2011 году потребность в эффективной вакцины против ВИЧ, чтобы обуздать всемирную эпидемию ВИЧ остается первостепенной. Однако, несмотря на три десятилетия интенсивных научных исследований, ВИЧ-1 испытаний эффективность вакцины на сегодняшний день привели лишь скромные защиту 1-3 и коррелирует защитного иммунитета остаются плохо изученными. Выяснения природы иммунного ответа, необходимые для защиты имеет важное значение для стратегической разработки эффективного ВИЧ-1 вакцины и другие иммунотерапевтическую стратегий, нацеленных на ВИЧ-1 инфекции.
Природные CD4 + регуляторных Т-клеток (Tregs) имеют решающее значение для поддержания иммунного гомеостаза клетки, контролируя чрезмерную иммунную активацию, тем самым ограничивая иммуноопосредованной повреждению тканей. Однако они также могут подавлять иммунный ответ против патогенов и предотвратить их очистку. Рака и Hepaисследования гепатита B вакцины продемонстрировали, что снижение активности Tregs может улучшить отклик вакцины и антиген-специфический иммунитет против вирусов 4-7. Тем не менее, в контексте ВИЧ-1 инфекции, точным ударом регуляторных Т-клеток остаются не вполне ясными. Tregs было показано, что снижение репликации вируса в активированных Т-клетках 8 и, возможно, повлиять иммунной активации 9. Они были также показаны для подавления ВИЧ-1-специфических иммунных реакций, что может иметь негативные последствия для прогрессирования заболевания 10,11. Таким образом, прежде чем он сможет модулировать активность Treg для повышения эффективности ВИЧ-1 вакцины, важно, чтобы получить дальнейшее понимание их функции в контексте данного заболевания.
Человеческих CD4 + регуляторные Т-клетки относительно редким популяцией клеток, что составляет около 5% от CD4 + Т-клеток в периферической крови, а их абсолютные цифры дальнейшее снижение с ВИЧ-ассоциированной CD4 + Т-лимфоцитов 12 </ Вир>. Текущие анализы для оценки Treg функции, такой как анализы пролиферации Т-клеток с Treg совместного культивирования, использование относительно большого количества клеток 12. Таким образом, характеризующей функции и специфичности регуляторных Т-клеток у пациентов с поздними стадиями ВИЧ-1 заболевания была сложной, несмотря на их важность для патогенеза ВИЧ.
Бывший изоляции естественных и расширение Tregs из ВИЧ-1 пациентов может представлять собой решение для преодоления некоторых из этих ограничений. Здесь мы опишем простой и надежный протокол расширить функциональные Tregs, взятых у ВИЧ-1-инфицированных лиц в пробирке, мы более подробно объяснить, как фенотип их и проверить их подавляющих функцию с помощью проточной цитометрии анализа. Мы считаем, что этот протокол будет способствовать доступу к Tregs и помощь в понимании их роли в ВИЧ-1 прогрессирования заболевания.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | - | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | - | |
| FlowJo | Tree Star | v887 | |
References
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
- Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
- Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
- Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
- Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
- Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
- Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
- Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
- Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
- Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
- Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
- Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
- De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
- Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
- Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
- Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
- Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
- Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
- Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
- Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
- Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
- Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
