Abstract
CD4 + regulatorischen T-Zellen (Tregs) sind potente Immunmodulatoren und haben eine wichtige Funktion in der menschlichen Immunhomöostase. Depletion von Tregs hat messbare Antigen-spezifischen T-Zell-Antworten in Impfstoff Einstellungen für Krebs und infektiösen Erregern führte. Jedoch bleibt ihre Rolle in HIV-1 Immuno-Pathogenese umstritten, da sie entweder könnte dazu dienen, schädliche HIV-1-assoziierten Aktivierung des Immunsystems zu unterdrücken und so langsam HIV-1 Fortschreiten der Krankheit zu unterdrücken oder auch HIV-1-spezifische Immunität zu fördern und dadurch Virus verbreiten. Understanding und modulierende Treg-Funktion im Rahmen der HIV-1 könnte zu möglichen neuen Strategien zur Immuntherapie oder HIV-Impfstoffe führen. Dennoch bleiben wichtige Fragen offen über ihre Rolle im Zusammenhang mit der HIV-1-Infektion, die sorgfältig untersucht werden muss.
Stellvertretend für rund 5% des menschlichen CD4 + T-Zellen im peripheren Blut, das Studium der Treg Population hat sich als schwierig erwiesen, essondere in HIV-1-infizierten Individuen, wo HIV-1-assoziierten CD4 T-Zell-und damit Treg Erschöpfung auftritt. Die Charakterisierung von regulatorischen T-Zellen bei Patienten mit fortgeschrittener HIV-1 Erkrankung oder Gewebeproben, für die nur sehr kleinen biologischen Proben erhalten werden können, ist es äußerst schwierig. Wir schlagen vor, eine technische Lösung für diese Einschränkungen zu überwinden mit Isolierung und Expansion von Tregs von HIV-1-positiven Personen.
Hier beschreiben wir eine einfache und robuste Methode erfolgreich ausbauen Tregs isoliert von HIV-1-Infizierten in vitro. Durchfluss-sortierten CD3 + CD4 + CD25 + CD127 niedrig Tregs wurden mit anti-CD3/anti-CD28 beschichtete Beads stimuliert und kultiviert in Gegenwart von IL-2. Die erweiterte Tregs exprimiert hohe FOXP3, CTLA4 und HELIOS im Vergleich zu herkömmlichen T-Zellen und erwiesen sich als sehr suppressive. Leichterer Zugang zu einer großen Anzahl von Tregs erlaubt Forschern, i Adressemportant Fragen über ihre Rolle im HIV-1 Immunpathogenese. Wir glauben, dass die Beantwortung dieser Fragen können nützliche Erkenntnisse für die Entwicklung eines wirksamen HIV-1-Impfstoff bereitzustellen.
Introduction
Mit mehr als 34 Millionen Menschen mit HIV / AIDS weltweit schätzungsweise 2,5 Millionen Menschen im Jahr 2011 neu infiziert, die Notwendigkeit einer wirksamen HIV-Impfstoff, um die weltweite HIV-Epidemie einzudämmen bleibt von größter Bedeutung. Doch trotz drei Jahrzehnten intensiver Forschung haben sich die HIV-1-Vakzine Wirksamkeitsstudien bisher nur bescheidenen Schutz 1-3 führte und die Korrelate der schützenden Immunität bleiben weitgehend unverstanden. Erläuterung der Art der Immunantwort zum Schutz benötigt ist für die strategische Gestaltung einer wirksamen HIV-1-Impfstoff und anderen immuntherapeutischen Strategien gegen HIV-1-Infektion.
Natürliche CD4 + regulatorische T-Zellen (Tregs) sind entscheidend für die Aufrechterhaltung der Homöostase Immunzellen durch Steuern übermäßige Aktivierung des Immunsystems und begrenzt somit immun-vermittelte Gewebeschädigung. Sie können aber auch zu unterdrücken Immunantworten gegen Pathogene und verhindern deren Beseitigung. Krebs und Hepatitis B Impfstoff-Studien haben gezeigt, dass die Verringerung der Aktivität von Tregs kann Impfstoff Reaktion und Antigen-spezifische Immunität gegen Viren 4-7 zu verbessern. In Zusammenhang mit der HIV-1-Infektion, ist die genaue Auswirkung von regulatorischen T-Zellen nicht vollständig verstanden. Tregs wurde gezeigt, dass die Virusreplikation in aktivierten T-Zellen 8 zu verringern und möglicherweise Auswirkungen auf Aktivierung des Immunsystems 9. Sie wurden auch gezeigt, dass HIV-1-spezifische Immunantworten, die negative Folgen für die Progression der Erkrankung haben könnten 10,11 unterdrücken. Somit bevor sie zu modulieren Treg Aktivität, um die Wirksamkeit eines HIV-1-Vakzine zu verbessern, ist es wichtig, weitere Einblicke in die Funktion gewinnen in diesem Zusammenhang Krankheit.
Menschliche CD4 + regulatorische T-Zellen sind eine relativ knapp Zellpopulation, die etwa 5% der CD4 + T-Zellen im peripheren Blut und ihrer absoluten Zahlen weitere Abnahme mit HIV-assoziierten CD4 + T-Zell-Depletion 12 </ Sup>. Diese Assays Treg Funktion, wie T-Zell-Proliferations-Assays mit Treg Co-Kultur zu beurteilen, mit relativ großer Zellzahlen 12. Daher kennzeichnenden Funktion und Spezifität von regulatorischen T-Zellen bei Patienten mit fortgeschrittener HIV-1-Erkrankung ist schwierig gewesen, trotz ihrer Bedeutung für die HIV-Pathogenese.
Die ex vivo Isolation und Expansion von Tregs von HIV-1-Patienten könnte eine Lösung für einige dieser Einschränkungen zu überwinden. Hier beschreiben wir eine einfache und robuste Protokoll zu funktionellen Tregs von HIV-1-infizierten Individuen in vitro abgeleitet erweitern; wir weiter, wie man ihnen zu erklären, Phänotyp und testen ihre suppressive Funktion mit durchflusszytometrischen Assays. Wir glauben, dass dieses Protokoll wird der Zugang zu Tregs erleichtern und das Verständnis ihrer Rolle in HIV-1 Fortschreiten der Erkrankung.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | - | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | - | |
| FlowJo | Tree Star | v887 | |
References
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