Abstract
Las células T reguladoras CD4 + (células T reguladoras) son moduladores inmunes potentes y tienen una función importante en la homeostasis inmune humano. El agotamiento de células T reguladoras ha conducido a aumentos mensurables en las respuestas específicas de antígeno de células T en la configuración de vacunas para el cáncer y agentes patógenos infecciosos. Sin embargo, su papel en el VIH-1 inmuno-patogénesis es controvertida, ya que o bien podrían servir para suprimir la activación inmune VIH-1 asociada perjudicial y por lo tanto disminuir el VIH-1 progresión de la enfermedad o bien suprimir la inmunidad del VIH-1 específica y con ello promover el virus diseminado. La comprensión y la función Treg modulación en el contexto del VIH-1 podría dar lugar a posibles nuevas estrategias para la inmunoterapia o vacunas contra el VIH. Sin embargo, importantes preguntas abiertas permanecen en su papel en el contexto de la infección por VIH-1, que debe ser estudiado cuidadosamente.
En representación de más o menos 5% de las células T en la sangre periférica CD4 + humanas, el estudio de la población Treg ha demostrado ser difícil, ESespecialmente en el VIH-1 en individuos infectados por VIH-1 asociada a células T CD4 y con la que se produce el agotamiento de Treg. La caracterización de las células T reguladoras en individuos con VIH avanzado-1 enfermedad o muestras de tejido, para el que sólo las muestras biológicas muy pequeñas se puede conseguir, por lo tanto, es extremadamente difícil. Se propone una solución técnica para superar estas limitaciones mediante el aislamiento y expansión de células T reguladoras de individuos VIH-1 positivos.
A continuación se describe un método sencillo y robusto para expandir exitosamente Tregs aislado de individuos VIH-1 infectadas in vitro. Flujo-ordenados CD3 + CD4 + CD25 + CD127 bajo células T reguladoras se estimularon con anti-CD3/anti-CD28 perlas recubiertas y se cultivaron en presencia de IL-2. La ampliación de Tregs expresa altos niveles de FOXP3, CTLA4 y HELIOS comparación con las células T convencionales, y mostraron ser altamente supresiva. Acceso más fácil a un gran número de células T reguladoras permitirá a los investigadores abordar importante preguntas acerca de su papel en el VIH-1 inmunopatogénesis. Creemos que responder a estas preguntas puede proporcionar información útil para el desarrollo de una vacuna eficaz contra el VIH-1.
Introduction
Con más de 34 millones de personas en todo el mundo que viven con el VIH / SIDA y se estima que 2,5 millones de personas se infectaron en el 2011, la necesidad de una vacuna eficaz contra el VIH para frenar la epidemia mundial del VIH sigue siendo primordial. Sin embargo, a pesar de tres décadas de intensos esfuerzos de investigación, la pandemia del VIH-1 ensayos de eficacia de vacunas hasta la fecha han resultado en sólo modesta protección de 1-3 y los correlatos de inmunidad protectora siguen siendo poco comprendidos. La elucidación de la naturaleza de la respuesta inmune necesaria para la protección es esencial para el diseño estratégico de una eficaz contra el VIH-1 vacuna y otras estrategias inmunoterapéuticas que atacan al VIH-1 infección.
Células T reguladoras CD4 + (células T reguladoras naturales) son críticos para el mantenimiento de la homeostasis celular inmune mediante el control de la activación inmunitaria excesiva, limitando así el daño tisular mediada inmunológicamente. Sin embargo, también pueden suprimir las respuestas inmunitarias contra los agentes patógenos y evitar su aclaramiento. Cáncer y Hepaestudios de la vacuna titis B han demostrado que la disminución de la actividad de células T reguladoras puede mejorar la respuesta a la vacuna y antígeno específico de la inmunidad contra los virus 4-7. Sin embargo, en el contexto de la infección por VIH-1, el impacto exacto de las células T reguladoras sigue siendo no se entiende completamente. Células T reguladoras se muestra para disminuir la replicación del virus en las células T activadas 8 y, posiblemente, afectar la activación inmune 9. También se mostró a suprimir las respuestas inmunes del VIH-1 específica, lo que podría tener consecuencias negativas para la progresión de la enfermedad 10,11. Por lo tanto, antes de ser capaz de modular la actividad de Treg para mejorar la eficacia de una vacuna contra el VIH-1, que es importante para obtener una mayor comprensión de su función en este contexto de la enfermedad.
Células T reguladoras CD4 + humanas son una población de células relativamente escasos, que representa alrededor del 5% de células T CD4 + en la sangre periférica, y sus números absolutos disminución adicional con el agotamiento de células T CD4 12 asociadas con el VIH + </ Sup>. Los ensayos actuales para evaluar la función Treg, tales como ensayos de proliferación de células T con Treg co-cultivo, use el número de células relativamente grandes 12. Por lo tanto, la función y la especificidad de las células T reguladoras en la caracterización de las personas con VIH avanzado-1 de la enfermedad ha sido un reto, a pesar de su importancia para la patogénesis del VIH.
El aislamiento y la expansión ex vivo de células T reguladoras de los pacientes VIH-1 podrían representar una solución para superar algunas de estas limitaciones. A continuación se describe un protocolo sencillo y robusto para ampliar Tregs funcional derivado de VIH-1 en individuos infectados in vitro, se explica con más detalles cómo fenotipo ellos y probar su función supresora utilizando ensayos de citometría de flujo. Creemos que este protocolo facilitará el acceso a Tregs y ayudar a la comprensión de su papel en el VIH-1 de progresión de la enfermedad.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | - | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | - | |
| FlowJo | Tree Star | v887 | |
References
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