Abstract
CD4 + regulatoriske T-celler (Tregs) er potente immunmodulatorer og tjener en viktig funksjon i menneskers immun homeostase. Nedbryting av Tregs har ført til målbare økninger i antigen-spesifikke T-celle-responser i vaksinesammensetninger innstillinger for kreft og infeksiøse patogener. Imidlertid forblir deres rolle i HIV-1 immuno-patogenese kontroversielt, da de kan enten tjene til å undertrykke skadelige HIV-1-assosiert aktivering av immunsystemet og dermed bremse HIV-1 sykdomsprogresjon eller alternativt undertrykke HIV-1-spesifikk immunitet, og derved fremme virus spre seg. Forståelse og modulerende Treg funksjon i forbindelse med HIV-1 kan føre til potensielle nye strategier for immunterapi eller HIV-vaksiner. Men viktige åpne spørsmål forbli på sin rolle i forbindelse med HIV-1-infeksjon, som må nøye studert.
Representerer ca 5% av menneskelige CD4 + T celler i perifert blod, studere Treg befolkningen har vist seg å være vanskelig, especially hos HIV-1-infiserte individer der HIV-1-assosiert CD4 T celler og med at Treg uttømming oppstår. Karakteriseringen av regulatoriske T-celler hos individer med fremskredet HIV-1-sykdom eller vevsprøver, hvor bare meget små, biologiske prøver kan oppnås, er derfor svært utfordrende. Vi foreslår en teknisk løsning for å overvinne disse begrensningene ved hjelp av isolasjon og utvidelse av Tregs fra HIV-1-positive individer.
Her beskriver vi en enkel og robust metode for å lykkes utvide Tregs isolert fra HIV-1-infiserte individer in vitro. Flow-sorteres CD3 + CD4 + CD25 + CD127 lav Tregs ble stimulert med anti-CD3/anti-CD28 belagte perler og dyrket i nærvær av IL-2. Den utvidede Tregs uttrykte høye nivåer av foxp3, CTLA4 og HELIOS sammenlignet med konvensjonelle T-celler og ble vist seg å være svært undertrykkende. Enklere tilgang til et stort antall Tregs vil tillate forskere å ta important spørsmål om sin rolle i HIV-1 immunpatogenese. Vi mener å svare på disse spørsmålene kan gi nyttig innsikt for utvikling av en effektiv HIV-1 vaksine.
Introduction
Med mer enn 34 millioner mennesker som lever med HIV / AIDS på verdensbasis og anslagsvis 2,5 millioner mennesker smittet i 2011, behovet for en effektiv HIV-vaksine for å dempe den globale HIV-epidemien er fortsatt viktig. Men til tross for tre tiår med intens forskningsinnsats, har HIV-1 vaksine effektstudier hittil resultert i bare beskjeden beskyttelse 1-3 og korrelater til beskyttende immunitet forbli dårlig forstått. Å belyse naturen av immunresponsen nødvendig for beskyttelse er viktig for den strategiske utforming av en effektiv HIV-1-vaksine og andre immunterapeutiske strategier rettet mot HIV-1 infeksjon.
Naturlig CD4 + regulatoriske T-celler (Tregs) er kritiske til vedlikehold av immunceller homeostase ved å kontrollere overdreven aktivering av immunsystemet, og dermed begrense immun-mediert vevsskade. Men de kan også undertrykke immunreaksjoner mot patogener og hindre deres klaring. Kreft og HepaTitis B-vaksine studier har vist at å redusere aktiviteten til Tregs kan forbedre vaksineresponsen og antigen-spesifikk immunitet mot virus 4-7. Men i forbindelse med HIV-1-infeksjon, forblir nøyaktige virkningen av regulatoriske T-celler ufullstendig forstått. Tregs ble vist å redusere virusreplikasjon i aktiverte T-celler 8 og muligens påvirke immunaktivering ni. De ble også vist seg å undertrykke HIV-1-spesifikk immunrespons, som kan ha negative utfall for sykdomsutvikling 10,11. Således, før de blir i stand til å modulere Treg aktivitet for å øke effekten av et HIV-1-vaksine, er det viktig å få ytterligere innsikt i sin funksjon i denne sammenheng sykdommen.
Menneskelige CD4 + regulatoriske T-celler er en relativt knappe celle befolkningen, som representerer ca 5% av CD4 + T celler i perifert blod, og deres absolutte tall ytterligere nedgang med HIV-tilknyttede CD4 + T-celle uttømming 12 </ Sup>. Aktuelle analyser for å vurdere Treg funksjon, for eksempel T-celle spredning analyser med Treg co-kultur, bruker relativt store celle tall 12. Derfor karakterisere funksjon og spesifisitet av regulatoriske T-celler hos personer med fremskredet HIV-1 sykdommen har vært utfordrende, til tross for deres betydning for HIV patogenese.
Den ex vivo isolasjon og utvidelse av Tregs fra HIV-1 pasienter kunne representere en løsning for å overvinne noen av disse begrensningene. Her beskriver vi en enkel og robust protokoll for å utvide funksjonell Tregs avledet fra HIV-1-infiserte individer i vitro, vi videre forklare hvordan du fenotype dem og teste deres undertrykkende funksjon ved hjelp flowcytometrisk analyser. Vi tror denne protokollen vil lette tilgangen til Tregs og hjelp til å forstå sin rolle i HIV-1 sykdomsutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RosetteSep Human CD4+ T Cell Enrichment Cocktail | Stemcells technologies | 15062 | |
| PBS | Sigma | D8537 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Histopaque | Sigma | H8889 | |
| Anti-CD3-PECy7 | BD Pharmingen | 557851 | |
| Anti-CD4-FITC | eBioscience | 11-0049-42 | |
| Anti-CD25-APC | eBioscience | 17-0259-42 | |
| Anti-CD127-PE | BD Pharmingen | 557938 | |
| Round-Bottom tube with 35 μm a nylon mesh | BD Falcon | 352235 | |
| X-VIVO 15 | Lonza | 04-418Q | |
| Penicillin/Streptomycin | Mediatech | 30-001-Cl | |
| Human Serum | Gemini Bio-Products | 100-512 | |
| Human T-activator CD3/CD28 | Life Technologies | 111.31D | |
| IL-2 | NIH Aids Research Reference Reagent Program | 136 | |
| LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain Kit | Life technologies | L34955 | |
| Anti-CD4-qdot-655 | Life Technologies | Q10007 | |
| Anti-CD25-PECy5 | eBiosciences | 15-0259-42 | |
| Foxp3 / Transcription Factor Staining Buffer Set | eBiosciences | 00-5523-00 | |
| Anti-FOXP3-PE | eBiosciences | 12-4776-42 | |
| Anti-HELIOS-FITC | Biolegend | 137204 | |
| Anti-CTLA4-APC | BD Pharmingen | 555855 | |
| CellTrace Violet Cell Proliferation Kit | Life Technologies | C34557 | |
| Vybrant CFDA SE Cell Tracer Kit | Life Technologies | V12883 | |
| HEPES | Mediatech | 25-060-Cl | |
| Treg Suppression inspector | Miltenyi Biotec | 130-092-909 | |
| Anti-CD4-APC | BD Pharmingen | 340443 | |
| Anti-CD8-AF700 | BD Pharmingen | 557945 | |
| RPMI 1640 | Sigma | R0883 | |
| Glutamine | Mediatech | 25-002-Cl | |
| Materials | |||
| BD Vacutainer Blood Collection Tube w/ ACID CITRATE DEXTROSE (ACD) | Becton, Dickinson and Company (BD) | 364606 | |
| FACSAria IIu Cell Sorter | BD Biosciences | - | |
| LSR II Flow Cytometer | BD Biosciences | - | |
| FlowJo | Tree Star | v887 | |
References
- Rerks-Ngarm, S., et al. Vaccination with ALVAC and AIDSVAX to prevent HIV-1 infection in Thailand. N. Engl. J. Med. 361, 2209-2220 (2009).
- Buchbinder, S. P., et al. Efficacy assessment of a cell-mediated immunity HIV-1 vaccine (the Step Study): a double-blind, randomised, placebo-controlled, test-of-concept trial. Lancet. 372 (08), 1881-1893 (2008).
- Pitisuttithum, P., et al. Randomized, double-blind, placebo-controlled efficacy trial of a bivalent recombinant glycoprotein 120 HIV-1 vaccine among injection drug users in Bangkok, Thailand. J. Infect. Dis. 194, 1661-1671 (2006).
- Morse, M. A., et al. Depletion of human regulatory T cells specifically enhances antigen-specific immune responses to cancer vaccines. Blood. 112, 610-618 (2008).
- Furuichi, Y., et al. Depletion of CD25+CD4+T cells (Tregs) enhances the HBV-specific CD8+ T cell response primed by DNA immunization. World J. Gastroenterol. 11, 3772-3777 (2005).
- Rech, A. J., Vonderheide, R. H. Clinical use of anti-CD25 antibody daclizumab to enhance immune responses to tumor antigen vaccination by targeting regulatory T cells. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1174, 99-106 (2009).
- Ruter, J., et al. Altering regulatory T cell function in cancer immunotherapy: a novel means to boost the efficacy of cancer vaccines. Front Biosci. 14, 1761-1770 (2009).
- Moreno-Fernandez, M. E., Rueda, C. M., Rusie, L. K., Chougnet, C. A. Regulatory T cells control HIV replication in activated T cells through a cAMP-dependent mechanism. Blood. 117, 5372-5380 (2011).
- Schulze Zur Wiesch, J., et al. Comprehensive analysis of frequency and phenotype of T regulatory cells in HIV infection: CD39 expression of FoxP3+ T regulatory cells correlates with progressive disease. J. Virol. 85, 1287-1297 (2011).
- Kinter, A., et al. Suppression of HIV-specific T cell activity by lymph node CD25+ regulatory T cells from HIV-infected individuals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 3390-3395 (2007).
- Moreno-Fernandez, M. E., Presicce, P., Chougnet, C. A. Homeostasis and function of regulatory T cells in HIV/SIV infection. J. Virol. , (2012).
- Angin, M., et al. Preserved Function of Regulatory T Cells in Chronic HIV-1 Infection Despite Decreased Numbers in Blood and Tissue. J. Infect. Dis. 205, 1495-1500 (2012).
- Seddiki, N., et al. Expression of interleukin (IL)-2 and IL-7 receptors discriminates between human regulatory and activated T cells. J Exp Med. 203, 1693-1700 (2006).
- De Jager, P. L., et al. The role of the CD58 locus in multiple sclerosis. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 5264-5269 (2009).
- Baron, U., et al. DNA demethylation in the human FOXP3 locus discriminates regulatory T cells from activated FOXP3(+) conventional T cells. Eur. J. Immunol. 37, 2378-2389 (2007).
- Salomon, B., et al. B7/CD28 costimulation is essential for the homeostasis of the CD4+CD25+ immunoregulatory T cells that control autoimmune diabetes. Immunity. 12, 431-440 (2000).
- Malek, T. R., Bayer, A. L. Tolerance, not immunity, crucially depends on IL-2. Nat. Rev. Immunol. 4, 665-674 (2004).
- Hoffmann, P., Eder, R., Kunz-Schughart, L. A., Andreesen, R., Edinger, M. Large-scale in vitro expansion of polyclonal human CD4(+)CD25high regulatory T cells. Blood. 104, 895-903 (2004).
- Putnam, A. L., et al. Expansion of human regulatory T-cells from patients with type 1 diabetes. Diabetes. 58, 652-662 (2009).
- Kreijveld, E., Koenen, H. J., Hilbrands, L. B., Joosten, I. Ex vivo expansion of human CD4+ CD25high regulatory T cells from transplant recipients permits functional analysis of small blood samples. J. Immunol. Methods. 314, 103-113 (2006).
- Ebinuma, H., et al. Identification and in vitro expansion of functional antigen-specific CD25+ FoxP3+ regulatory T cells in hepatitis C virus infection. J Virol. 82, 5043-5053 (2008).
- Strauss, L., Czystowska, M., Szajnik, M., Mandapathil, M., Whiteside, T. L. Differential responses of human regulatory T cells (Treg) and effector T cells to rapamycin. PLoS ONE. 4, e5994 (2009).
- Heredia, A., et al. Rapamycin causes down-regulation of CCR5 and accumulation of anti-HIV beta-chemokines: an approach to suppress R5 strains of HIV-1. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 10411-10416 (1073).
- Hoffmann, P., et al. Only the CD45RA+ subpopulation of CD4+CD25high T cells gives rise to homogeneous regulatory T-cell lines upon in vitro expansion. Blood. 108, 4260-4267 (2006).
- Hoffmann, P., et al. Loss of FOXP3 expression in natural human CD4+CD25+ regulatory T cells upon repetitive in vitro stimulation. Eur. J. Immunol. 39, 1088-1097 (2009).
- Wang, J., Ioan-Facsinay, A., vander Voort, E. I., Huizinga, T. W., Toes, R. E. Transient expression of FOXP3 in human activated nonregulatory CD4+ T cells. Eur. J. Immunol. 37, 129-138 (2007).
- Takahashi, T., et al. Immunologic self-tolerance maintained by CD25(+)CD4(+) regulatory T cells constitutively expressing cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4. J. Exp. Med. 192, 303-310 (2000).
- Thornton, A. M., et al. Expression of Helios, an Ikaros transcription factor family member, differentiates thymic-derived from peripherally induced Foxp3+ T regulatory cells. J. Immunol. 184, 3433-3441 (2010).
- Zheng, S. G., Gray, J. D., Ohtsuka, K., Yamagiwa, S., Horwitz, D. A. Generation ex vivo of TGF-beta-producing regulatory T cells from CD4+CD25- precursors. J. Immunol. 169, 4183-4189 (2002).
- Gregori, S., Roncarolo, M. G., Bacchetta, R. Methods for in vitro generation of human type 1 regulatory T cells. Methods Mol. Biol. 677, 31-46 (2011).
