Summary
Un protocollo per infusioni cronici di glucosio e Intralipid nei ratti è descritto. Questo modello può essere utilizzato per studiare l'impatto di un eccesso di nutrienti in funzione degli organi e dei parametri fisiologici.
Abstract
Esposizione cronica a livelli eccessivi di nutrienti è postulata a pregiudicare la funzione di diversi organi e tessuti e per contribuire allo sviluppo delle molte complicazioni associate con l'obesità e la sindrome metabolica, compreso il diabete di tipo 2. Per studiare i meccanismi con cui livelli eccessivi di glucosio e acidi grassi influenzano la beta pancreatiche cellule e la secrezione di insulina, abbiamo stabilito un modello infusione di sostanze nutrienti cronica nel ratto. La procedura consiste di cateterizzazione della vena giugulare destra e sinistra arteria carotide in anestesia generale; consentendo un periodo di recupero di 7 giorni; collega i cateteri alle pompe utilizzando una girevole e sistema di contrappesi che consente all'animale di muoversi liberamente nella gabbia; ed infondendo glucosio e / o Intralipid (un'emulsione di olio di soia che genera una miscela di circa 80% unsaturated/20% di acidi grassi saturi quando infuso con eparina) per 72 hr. Questo modello offre diversi vantagGES, compresa la possibilità di modulare finemente i livelli target di glucosio circolante e di acidi grassi, la possibilità di co-infusione composti farmacologici, e il lasso di tempo relativamente breve rispetto a modelli alimentari. Può essere usato per esaminare i meccanismi della disfunzione nutrienti indotta in una varietà di organi e testare l'efficacia dei farmaci in questo contesto.
Introduction
Livelli cronicamente elevati di glucosio e lipidi in circolo sono state proposte per contribuire alla patogenesi del diabete di tipo 2 alterando la funzione dei vari organi implicati nel mantenimento dell'omeostasi del glucosio compreso, ma non limitato a, il pancreas cellule beta (recensione in 1). Le ipotesi postula glucotossicità che l'iperglicemia cronica aggrava il difetto delle cellule beta che ha dato origine alla iperglicemia, in primo luogo, creando così un circolo vizioso e contribuendo al deterioramento del controllo glicemico nei pazienti con diabete di tipo 2. Allo stesso modo, l'ipotesi glucolipotoxicity propone che aumenti concomitanti dei livelli di glucosio e di lipidi, come spesso osservati nel diabete di tipo 2, sono dannosi per la cellula beta.
Decifrare i meccanismi cellulari e molecolari degli effetti deleteri di nutrienti cronicamente elevati di funzionalità delle cellule beta del pancreas è la chiave per il understanding della patogenesi del diabete di tipo 2 1. A tal fine, un gran numero di studi hanno esaminato i meccanismi della cronica nutrienti in eccesso ex vivo in isole di Langerhans isolate o in vitro in linee cellulari clonali, secernono insulina. Tuttavia, la traduzione dei risultati ottenuti in questi sistemi modello per l'intero organismo è complesso, in particolare perché le concentrazioni di acidi grassi utilizzati in cellule coltivate o isolotti raramente corrispondono i livelli circolanti nelle vicinanze delle cellule beta in vivo 2. D'altra parte, i meccanismi di guasto beta-cellula in risposta ad eccesso di nutrienti sono stati esaminati in modelli di roditori di diabete, come esemplificato dal ratto Zucker Diabetic Fatty 3,4, il gerbillo Psammomys obesus 5 e l'alta percentuale di grassi dieta- fed del mouse 6. Questi modelli, tuttavia, sono caratterizzati da intrinseche anomalie metaboliche e non sono facilmente suscettibili di manipolazioni di glicemiae / o livelli di lipidi in un ambiente più controllato e meno cronica. Per essere in grado di alterare i livelli circolanti di nutrienti in un lasso di tempo di giorni in animali altrimenti normali, abbiamo sviluppato un modello di infusione cronica in ratti normali che ci permette di esaminare gli effetti di lipidi e del glucosio, da soli o in combinazione, su parametri fisiologici e funzionali 7,8.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Sommario: La procedura consiste cateterizzazione della vena giugulare destra e sinistra arteria carotide in anestesia generale; consentendo un periodo di recupero di 7 giorni; collega i cateteri alle pompe utilizzando una girevole e sistema di contrappesi che consente all'animale di muoversi liberamente nella gabbia; e infondendo glucosio e / o Intralipid (un'emulsione di olio di soia che genera una miscela di circa 80% unsaturated/20% di acidi grassi saturi quando infuso con eparina 9) per 72 hr.
1. Canulation della Vena giugulare destra e l'arteria carotide sinistra
- Sterilizzare gli strumenti chirurgici. Canulation tubazione deve essere sterilizzato a freddo usando un agente sterilizzante liquido (2,6% glutaraldeide) prima della procedura. Immergere il tubo in un contenitore sterilizzato per 16-24 ore. Risciacquare e lavare abbondantemente con acqua distillata sterile per rimuovere tutte le tracce di glutaraldeide prima dell'uso.
- Pesare il ratto per calcolaredosaggi di farmaci:
Carprofene 5 mg / kg: diluizione 1/10 = Peso corporeo (g) x 0.001 ml SC (analgesico)
Glicopirrolato 0,01 mg / kg: diluizione 1/10 = BW (g) X 0,0012 ml SC (anticolinergici) - Anestetizzare il ratto utilizzando isoflurano e ossigeno.
- Posizionare il topo sul suo stomaco. Radere la zona dietro le orecchie alla base delle spalle. Posare il ratto sulla sua schiena. Radersi la regione sotto il collo per le zampe anteriori.
- Preparazione del sito chirurgico con clorexidina, alcol e iodio. Somministrare farmaci.
- Trasferire il ratto al campo chirurgico.
- Utilizzando una tecnica asettica, canulate vena giugulare destra e l'arteria carotide sinistra con una cannula PE-50 attaccato ad una siringa da 1 ml riempita con 5 U di soluzione fisiologica eparinizzata. Lavare le cannule con 50 U di soluzione fisiologica con eparina per evitare la coagulazione durante il periodo di recupero. Utilizzare aghi 23G smussati. Chiudere ogni cannula con un perno 23G.
- Dopo l'intervento chirurgico, tagliare circa 2,5 mm dalincisivi inferiori e il luogo del ratto in una giacca di infusione per evitare che le cannule da essere mangiato.
- Fornire ossigeno (1 L / min per 10 minuti) per aiutare evacuare isoflurano.
- Collocare il ratto in una gabbia riscaldata finché non è completamente sveglio.
- Operare quattro ratti di utilizzare uno per condizione infusione (Tabella 1).
2. Assistenza post-operatoria (trattamento post-chirurgico e di collegamento dei cateteri)
- Pesare i ratti al giorno 1 e giorno 2 post-chirurgico.
- Somministrare glycopyrrolate (BW (g) x 0,00048 ml) SC due volte al giorno 1 post-chirurgico e una volta il giorno 2 post-chirurgico.
- Ulteriori trattamenti di supporto possono essere somministrati se necessario: liquidi, rilievo di riscaldamento, la dieta umida, ossigenoterapia, analgesici, anticolinergici.
- Il giorno 7 post-chirurgia, pesare i topi per calcolare le portate per infusione.
- Collegare ogni ratto di un sistema di infusione con un laccio e girevole montata su un grill da gabbia (Figura 1).
- Lavare le cannule con 5 U di soluzione fisiologica con eparina per rimuovere i coaguli. Lavare le cannule, una volta di più con 50 U di soluzione fisiologica con eparina per prevenire la coagulazione.
- Lasciare i ratti si adatti al laccio e girevole per almeno 24 ore prima di iniziare l'infusione.
3. Infusione
- Disegnare 0,15 ml di sangue dalla carotide di ciascun ratto e misurare glicemia. Lavare le cannule giugulari. Utilizzare 50 U di soluzione fisiologica con eparina per prevenire la coagulazione sia cannule di ogni ratto.
- Trasferire il campione di sangue di un tubo di raccolta ml 0,5 contenente il 2% di EDTA. Centrifugare a 10.000 rpm per 2 min e congelare il plasma a -20 ° C.
- Riempire due siringhe 60 ml per ciascuna delle condizioni di infusione sotto elencate. Siringa 1 posto sulla posizione anteriore della pompa e siringa 2 posto sulla posizione posteriore della pompa.
- Unisciti a ogni coppia di soluzioni con y-connettori e CO-EX tubi T22 che è stato sterilizzato. Mettere le siringhe su un Harvard 33doppia pompa siringa.
- Modificare il fondo della gabbia e rimuovere tutti gli alimenti alla griglia superiore della gabbia.
- Pesare 150 g di cibo standard e posto sulla griglia superiore della gabbia.
- Collegare le siringhe per la girella sulla griglia della gabbia. Lavare le siringhe correttamente per rimuovere l'aria intrappolata dalle linee.
- Calcolare le portate di infusione utilizzando il peso corporeo che è stata presa prima di collegare il ratto al sistema di infusione. Le tariffe sono calcolate con un file di Microsoft Excel che converte il tasso di infusione di glucosio (GIR) in ml / h.
- Impostare la pompa per amministrare le portate per 60 ml siringhe in base alle impostazioni del produttore. Inserire il tasso di siringa 1 (siringa anteriore) e il tasso per siringa 2 (torna siringa).
- Avviare la pompa.
4. Monitoraggio
- Dopo aver avviato la pompa, verificare che non vi sia fuoriuscita dalla girevole o dalle cannule e tubi di infusione non sia attorcigliata. Verificare inoltre che non vi siano bolle d'aria nelil tubo.
- Dopo 3 ore di infusione, prelevare un campione di sangue per monitorare la glicemia. Ripetere dopo 6, 24, 48, e 72 ore di infusione. Per precauzione, glicemia viene monitorato anche dopo 30, 34, 54, e 60 ore di infusione. Glucosio nel sangue può essere misurata usando una goccia di sangue intero utilizzando un monitor portatile glucosio. Questo limita la quantità di sangue prelevato durante l'infusione e quindi evita alterare significativamente il volume del sangue e / o ematocrito.
- Il tasso per siringa 1 è modificato sulla base di valori di glicemia a mantenere glicemia a 220-250 mg / dl. Il tasso di siringa 2 non cambia durante la 72 ore di infusione, perché gli acidi grassi liberi sono mantenuti a 1 mmol / L.
- Condizioni di infusione sono accoppiati in modo che il volume ricevuto per gli animali di controllo è equivalente al volume ricevuto per gli animali di prova (Tabella 1).
- Dopo 24 ore di infusione, cambiare il fondo gabbia e pesare il cibo che rimane nella griglia gabbia. Restituire la parte non mangiato tØ la griglia della gabbia. Ripetere dopo 48 ore.
- Refill siringhe al giorno secondo necessità durante la 72 ore di infusione.
- Durante l'infusione, osservare sempre il ratto per eventuali segni di infiammazione o di disagio. L'assistenza appropriata, se necessario.
5. Eutanasia post-infusione
- Dopo 72 h di infusione, i ratti vengono anestetizzati per via endovenosa con 0,5 ml di un cocktail di ketamina / xilazina (182 mg / kg di ketamina e 11,6 mg / kg di xilazina diluito 1:2 con 0,9% NaCl).
- Il riflesso toe-pinch viene utilizzato per verificare il livello di anestesia. Ulteriori anestetico viene somministrato come necessario.
- Quando il ratto è anestetizzato, la cavità addominale viene aperto con forbici chirurgiche. Il ratto è dissanguato disegnando 10-15 ml di sangue in una siringa dalla aorta o la vena cava.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Su una serie di 42 ratti che hanno subito un intervento chirurgico, 5 ratti sono stati persi durante il periodo post-operatorio e 1 ratto è stato perso durante l'infusione, con un tasso complessivo di successo del 86%. Il peso corporeo medio dei 37 ratti che sono stati poi infuse era 608 ± 5 g prima dell'intervento e 588 ± 6 g al di iniziare l'infusione (media ± SE, n = 37, p <0,0001 per paired t-test). I seguenti risultati rappresentativi sono stati ottenuti in due gruppi: infusione. Saline (SAL), e glucosio + Intralipid (GLU + IL) Figure 2A e 2B spettacolo di glucosio nel sangue e livelli di acidi grassi, rispettivamente, durante il periodo di infusione di 72 ore. Di progettazione, i livelli di glucosio sono mantenuti intorno 220-250 mg / dl durante l'infusione, sulla base di misurazioni e regolazioni della velocità di infusione di glucosio (GIR) come mostrato in Figura 3 regolare. Roditori hanno una forte capacità di compensare l'infusione di glucosio aumentando insulina endogena SEcretion. Pertanto, il GIR deve essere aumentata durante il corso della infusione per livelli di glucosio nel sangue per essere mantenuto a un stato stazionario relativo. Tuttavia, i livelli di glucosio nel sangue tendono a diminuire verso la fine dell'infusione, come visto in Figura 2A. Dal momento che gli animali sono intrise di nutrienti calorici, diminuiscono spontaneamente la loro assunzione di cibo (Figura 4).
| Infusione Condizioni | Siringa 1 (posizione frontale) | Siringa 2 (posizione posteriore) |
| 1 | Destrosio 70% | Saline |
| 2 | Saline | Saline |
| 3 | Destrosio 70% | Intralipid 20% + Eparina 20U/ml |
| 4 | Saline | Intralipid 20%% + Eparina 20U/ml |
Tabella 1. Regimi di infusione.
Figura 1. Fotografia del sistema di infusione che mostra il ratto con i cateteri in atto e la cavezza, girevole e braccio contrappeso montato sulla griglia della gabbia.
Figura 2. . I livelli plasmatici di glucosio (A) e gli acidi grassi liberi (B) durante l'infusione di soluzione fisiologica (SAL) o co-infusione di glucosio e Intralipid (GLU + IL) in 6 mesi vecchi ratti Wistar di dati sono media ± SEM di 3 - 4 animali di ciascun gruppo.
Figura 3 "src =" / files/ftp_upload/50267/50267fig3.jpg "/>
Figura 3. Regolazione della velocità di infusione di glucosio durante la co-infusione di glucosio e Intralipid (GLU + IL) a 6 mesi ratti Wistar. Dati vengono significano ± SEM di 4 animali.
Figura 4. Media alimentazione quotidiana di 6 mesi vecchi ratti Wistar infuso con soluzione fisiologica (SAL) o co-infuso con glucosio e Intralipid (GLU + IL). Dati sono media ± SEM di 3-4 animali di ciascun gruppo. ** P <0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Sebbene un certo numero di studi precedenti hanno impiegato infusioni cronici di glucosio (ad esempio 10-15) o lipidi (ad esempio 16,17) nei roditori, a nostra conoscenza l'infusione combinata di entrambi i carburanti è stato riportato soltanto nei topi 18. Il modello di infusione cronica qui presentato offre diversi vantaggi per studiare gli effetti sulla eccesso di nutrienti su una varietà di funzioni biologiche nei ratti. In primo luogo, esso non comporta roditori geneticamente obesi, e dal momento che l'obesità comune negli esseri umani è poligenica 19, i risultati sono quindi più probabilità di essere rilevanti per gli effetti di un eccesso di offerta di nutrienti nella popolazione generale. In secondo luogo, questo modello offre la possibilità di testare gli effetti di diverse sostanze nutritive (in particolare zuccheri o grassi) a diversi livelli circolanti, cambiando la loro natura e la portata di infusione. Terzo, la via di somministrazione IV consente al co-infusione di composti o farmaci insieme alla Nutrients 20. Infine, l'arco di tempo relativamente breve di questo esperimento (72 ore vs settimane per la dieta modelli indotti ad alto contenuto di grassi) è costo-e tempo-efficace per gli studi preclinici.
Questo modello ha anche alcuni svantaggi e limitazioni. In primo luogo, come ogni modello chirurgico si richiede personale altamente qualificato e specializzato in chirurgia asettica. In secondo luogo, come accennato nelle Risultati rappresentativi sezione gli animali tendono a compensare l'infusione di glucosio, aumentando la secrezione di insulina endogena, che richiede frequente monitoraggio dei livelli di glucosio nel sangue e regolazioni del GIR per mantenere i livelli di glucosio nel sangue bersaglio tutta la durata dell'infusione. In terzo luogo, la procedura non è facilmente applicabile ai topi, che sarebbero necessari per poter utilizzare in animali geneticamente modificati. Nella nostra esperienza, la cateterizzazione sia vena giugulare e carotide nei topi a tecnicamente impegnativo e l'approccio più semplice in questi animali più piccoli è quello di mettere un julare catetere per l'infusione e di campione da un vaso periferico. Questo, tuttavia limita considerevolmente il volume e la frequenza del campionamento durante l'infusione.
La centralità del nostro laboratorio, abbiamo utilizzato questo modello per studiare i meccanismi di glucolipotoxicity nel pancreas cellule beta 7,8. Tuttavia, può essere applicato per studiare gli effetti di un eccesso di nutrienti in qualsiasi tessuto e organo come, ma non limitato a, il cuore 21, muscolo scheletrico, 22, 23 e fegato.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Vincent Poitout è co-fondatore di contratti di ricerca e ha ricevuto da Bêtagenex Inc., un'organizzazione di ricerca a contratto, che offre il modello di infusione presentato in questo articolo come un servizio commerciale.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (R01DK58096 a Vincent Poitout). Vincent Poitout detiene il Canada Research Chair in diabete pancreatico e funzione delle cellule beta. Bader Zarrouki ricevuto borse di studio post-dottorato da Merck e Eli Lilly. Ghislaine Fontes è stato sostenuto da una borsa di studio post-dottorato della Canadian Diabetes Association.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Saline 0.9% | BD | JB1324 | |
| Dextrose 70% | McKesson | ||
| Intralipid 20% | Fresenius Kabi | JB6023 | |
| Metricide (Glutaraldehyde 2.6%) | Metrex | 11-1401 | |
| Heparin Sodium 10,000 USP u/ml | PPC | ||
| Carprofen | Metacam | ||
| Glycopyrrolate | Sandoz | ||
| Isoflurane | Abbott | ||
| Chlohexidine 2% | |||
| Alcohol 70% | |||
| Iodine | |||
| PE-50 | BD | 427411 | |
| CO-EX T22 | Instech Solomon | BCOEX-T22 | |
| Connector 22G | Instech Solomon | SC22/15 | |
| Swivel 22G | Instech Solomon | 375/22PS | |
| Y-Connector 22G | Instech Solomon | ||
| Counterbalance and arm | Instech Solomon | CM375BP | |
| 23 G blunted needles | Instech Solomon | LS23 | |
| 23 G canulation pins | Instech Solomon | SP23/12 | |
| Tethers (12 inch) | Lomir | RT12D | |
| Infusion jackets | Lomir | RJ01, RJ02, RJ03, RJ04 | |
| (SM-XL) | |||
| Tether attachment piece | Lomir | RS T1 | |
| 60 ml syringe | BD | 309653 | |
| 1 ml syringe | BD | 309602 |
References
- Poitout, V., Robertson, R. P. Glucolipotoxicity: fuel excess and beta-cell dysfunction. Endocr. Rev. 29, 351-366 (2008).
- Poitout, V., et al.
- Unger, R. H. Minireview: weapons of lean body mass destruction: the role of ectopic lipids in the metabolic syndrome. Endocrinology. 144, 5159-5165 (2003).
- Harmon, J. S., Gleason, C. E., Tanaka, Y., Poitout, V., Robertson, R. P. Antecedent hyperglycemia, not hyperlipidemia, is associated with increased islet triacylglycerol content and decreased insulin gene mRNA level in Zucker diabetic fatty rats. Diabetes. 50, 2481-2486 (2001).
- Bachar, E., Ariav, Y., Cerasi, E., Kaiser, N., Leibowitz, G. Neuronal nitric oxide synthase protects the pancreatic beta cell from glucolipotoxicity-induced endoplasmic reticulum stress and apoptosis. Diabetologia. 53, 2177-2187 (2010).
- Peyot, M. L., et al. Beta-cell failure in diet-induced obese mice stratified according to body weight gain: secretory dysfunction and altered islet lipid metabolism without steatosis or reduced beta-cell mass. Diabetes. 59, 2178-2187 (2010).
- Hagman, D. K., et al. Cyclical and alternating infusions of glucose and intralipid in rats inhibit insulin gene expression and Pdx-1 binding in islets. Diabetes. 57, 424-431 (2008).
- Fontes, G., et al. Glucolipotoxicity age-dependently impairs beta cell function in rats despite a marked increase in beta cell mass. Diabetologia. 53, 2369-2379 (2010).
- Stein, D. T., et al. Essentiality of circulating fatty acids for glucose-stimulated insulin secretion in the fasted rat. J. Clin. Invest. 97, 2728-2735 (1996).
- Leahy, J. L., Cooper, H. E., Weir, G. C. Impaired insulin secretion associated with near normoglycemia. Study in normal rats with 96-h in vivo glucose infusions. Diabetes. 36, 459-464 (1987).
- Hager, S. R., Jochen, A. L., Kalkhoff, R. K. Insulin resistance in normal rats infused with glucose for 72 h. The American Journal of Physiology. 260, 353-362 (1991).
- Laybutt, D. R., Chisholm, D. J., Kraegen, E. W. Specific adaptations in muscle and adipose tissue in response to chronic systemic glucose oversupply in rats. The American Journal of Physiology. 273, E1-E9 (1997).
- Jonas, J. C., et al. High glucose stimulates early response gene c-Myc expression in rat pancreatic beta cells. The Journal of Biological Chemistry. 276, 35375-35381 (2001).
- Tang, C., et al. Glucose-induced beta cell dysfunction in vivo in rats: link between oxidative stress and endoplasmic reticulum stress. Diabetologia. 55, 1366-1379 (2012).
- Alonso, L. C., et al. Glucose infusion in mice: a new model to induce beta-cell replication. Diabetes. 56, 1792-1801 (2007).
- Magnan, C., Gilbert, M., Kahn, B. B. Chronic free fatty acid infusion in rats results in insulin resistance but no alteration in insulin-responsive glucose transporter levels in skeletal muscle. Lipids. 31, 1141-1149 (1996).
- Goh, T. T., et al. Lipid-induced beta-cell dysfunction in vivo in models of progressive beta-cell failure. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 292, 549-560 (2007).
- Pascoe, J., et al. Free fatty acids block glucose-induced beta-cell proliferation in mice by inducing cell cycle inhibitors p16 and p18. Diabetes. 61, 632-641 (2012).
- Bell, C. G., Walley, A. J., Froguel, P.
- Fontes, G., Hagman, D. K., Latour, M. G., Semache, M., Poitout, V. Lack of preservation of insulin gene expression by a glucagon-like peptide 1 agonist or a dipeptidyl peptidase 4 inhibitor in an in vivo model of glucolipotoxicity. Diabetes Res. Clin. Pract. 87, 322-328 (2010).
- Crawford, P. A., Schaffer, J. E. Metabolic stress in the myocardium: Adaptations of gene expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. , (2012).
- Kewalramani, G., Bilan, P. J., Klip, A. Muscle insulin resistance: assault by lipids, cytokines and local macrophages. Curr. Opin. Clin. Nutr. Metab Care. 13, 382-390 (2010).
- Cusi, K. Role of obesity and lipotoxicity in the development of nonalcoholic steatohepatitis: pathophysiology and clinical implications. Gastroenterology. 142, 711-725 (2012).
