Summary
Поколение унифицированных ткани миокарда является ключевым требованием для адаптации последних достижений в области биологии стволовых клеток в клинической полезных целей. Здесь мы описываем подход микроконтактной печати для точного контроля формы и функционирование клеток. Использование высокоочищенного популяций эмбриональных стволовых клеток, полученных кардиальных предшественников, мы затем генерировать анизотропные функциональной ткани миокарда.
Abstract
Расширенный сердечная недостаточность представляет собой крупный неудовлетворенной клинической проблемой, возникающие в связи с потерей жизнеспособности и / или полностью функциональный клетки сердечной мышцы. Несмотря на оптимальную медикаментозную терапию, сердечная недостаточность представляет собой основной причиной заболеваемости и смертности в развитых странах мира. Одна из основных проблем в разработке лекарственных средств является выявление клеточных анализов, которые точно воспроизводят нормальной и больной человеческой физиологии миокарда в пробирке. Кроме того, серьезные проблемы в регенеративной биологии сердечной вращаются вокруг выявление и изоляция пациента конкретных кардиальных предшественников в клинически значимых количествах. Эти клетки должны быть собраны в функциональные ткани, которая напоминает родной архитектуры ткани сердца. Микроконтактной печати позволяет создавать точные micropatterned белка формы, которые напоминают структурной организации сердца, обеспечивая тем самым геометрическую сигналы для контроля клеточной адгезии пространстве. Здесьмы описываем наш подход для выделения высокоочищенного клеток миокарда из плюрипотентных стволовых клеток дифференциации в пробирке, поколение рост клеток поверхности micropatterned с белками внеклеточного матрикса, и сборка стволовых клеток, полученных клетки сердечной мышцы в анизотропном ткани миокарда.
Introduction
Несмотря на последние достижения в области медикаментозной терапии, тяжелой сердечной недостаточностью остается одной из ведущих причин заболеваемости и смертности в развитых странах мира. Клинический синдром возникает в результате потери функциональной ткани миокарда, а затем неспособности сердечной недостаточности для удовлетворения метаболических потребностей пострадавших лиц. Так как сердце имеет ограниченный регенеративной способностью, аутологичной трансплантации сердца является единственным текущей клинической терапии принимается непосредственно направленные на восполнение потерянных функциональной ткани сердца. Значительные недостатки трансплантации сердца, в том числе ограниченного числа доноров сердца и потребность в долгосрочных иммуносупрессивной терапии, препятствует широкому распространению использования этой терапии. В результате, медикаментозная терапия была основным методом лечения для пациентов с заболеваниями сердца. Одна из основных проблем в разработке лекарственных средств является выявление клеточных анализов, которые точно воспроизводят нормальных и больных инфарктом физиологии в пробирке.
Последнее сближение биологии стволовых клеток и технологии тканевой инженерии ставит новые перспективные направления для регенерации сердца. Создание функциональной ткани миокарда из возобновляемых пациента конкретного источника будет важным шагом вперед в этой области. Это позволит обеспечить развитие болезни специфического клеточного анализа для разработки лекарств и открытие и заложит основу для сердечной регенеративной медицины. Человека эмбриональных стволовых (ЭС) клеток и, что более важно, человеческого индуцированных плюрипотентных стволовых (плюрипотентных) клеток представляют собой потенциально возобновляемых конкретного пациента источник желудочка клеток-предшественников и зрелые миоциты желудочка. Сочетание биологии стволовых клеток и тканевой инженерии стратегии решает эту проблему путем создания функциональной ткани сердца в пробирке, которые могут быть использованы при разработке клеточных анализов для открытия новых лекарств или в восстановительной сердечной подходы для лечения тяжелой сердечной недостаточностью.
_content "> главная задача в регенерации сердца было выявление оптимального типа клеток. широкий спектр клеток были изучены 1, однако до настоящего времени, хотя и отличаются мультипотентных кардиогенный прекурсоров из различных источников было обнаружено, определение ячейки Источник, который отвечает критическим требованиям, таким как приверженность миогенной судьбу клетки, обеспечение возможности для расширения в естественных условиях или в пробирке и составу функциональных тканей миокарда оказалась центральной проблемой 2. Ранее мы уже описали двойных трансгенных мышиных системы , которая позволяет изоляции высокоочищенных популяций совершенные прародителями желудочка (CVP) из ЭС клеток дифференциации в пробирке. Мы создали новый двойной трансгенные мыши, которая выражает красный флуоресцентный белок DsRed под контролем Isl1-зависимых энхансер гена и Mef2c расширение зеленого флуоресцентного белка под контролемсердечных конкретных Nkx2.5 усилитель. Основываясь на этой двухцветной флуоресцентной системы репортер, первое и второе поле сердца предшественников из развивающихся ЭС клетки могут быть выделены с помощью флуоресценции клеток, активированных сортировки (FACS) в соответствии с их выражением Mef2c и Nkx2.5 генов. CVP напоминают кардиомиоцитов на основе паттерны экспрессии маркеров инфаркта и структурные и функциональные качества 3, что открывает большие перспективы для сердечной цели регенеративных тканей.Хотя было много достижений в области тканевой инженерии, имитируя родной сотовой архитектуры остается ключевой задачей. Обычные методы для решения этой проблемы включают посев биологических или синтетических леса с клетками в лабораторных условиях. В связи с рядом недостатков лесов, в том числе быстрой деградации, ограниченные физические и механической стабильностью и низкой плотности клеток 1,4,5, мы попытались спроектировать эшафот менее тканей. Высокий звукХью сердечных клеток может изменить их местных микроокружения на секрецию белков внеклеточного матрикса, они имеют более ограниченные возможности для самоорганизации в целях стержня формы кардиомиоцитов в отсутствие внеклеточных сигналов. Таким образом, шаблон, который предоставляет клеток соответствующих пространственных и биологические сигналы для составления функциональной ткани миокарда не требуется. Микроконтактной печати решает эту проблему, предоставляя простой и недорогой метод для точного контроля формы клеток, организация и функции 6-8, все из которых имеют решающее значение для создания унифицированных функциональных ткани миокарда. Она включает в себя использование microtextured полидиметилсилоксана (PDMS) марки с функцией размеров в пределах до 2 мкм 9, что позволит осаждения белков внеклеточного матрикса на подложки PDMS в точных моделей и таким образом влиять на клеточную адгезию пространстве.
При этом, мы предлагаем объединить технологии биоинженерии тканей с помощью стволовых челл биологии для создания анизотропного функциональной ткани миокарда. Соответственно, мы здесь продемонстрировать нашу недавно опубликованной подход для следующих целей: (1) об образовании поверхностей micropatterned белка на PDMS субстратов микроконтактной печати для создания шаблонов для унифицированных ткани миокарда, (2) выделение высокоочищенных кардиальных предшественников из ЭС клетки дифференциации в пробирке, и (3) комбинация обоих методов для создания соответствие функциональной ткани миокарда.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Протокол для создания соответствие функциональной ткани миокарда можно разделить на три основные части. Изготовление мастер micropatterned помощью мягкой литографии не считаются частью следующего протокола, но могут быть сделаны на основе установленных методом 6.
1. Микроконтактной печати фибронектина на PDMS подложках
- Смешать Sylgard 184 (Dow Corning) PDMS эластомера в 10:01 базой для лечения отношение агента и дегазации сборки с помощью эксикаторе, чтобы устранить любые воздушные пузыри.
- Лечение PDMS против ранее изготовленный мастером с 20 мкм в ширину и 2 мкм высоких хребтов, разделенных расстоянием 20 мкм либо 2 дня при комнатной температуре или 4 часа при температуре 65 ° C для получения microtextured марки PDMS.
* Лечение в эксикаторе Настоятельно рекомендуется, чтобы устранить любые воздушные пузыри.
- Спин слой PDMS на стекло покровные стекла (например,22x22 мм) при 5000 оборотов в минуту в течение 2 мин с использованием Coater Headway Спин для получения тонких и даже PDMS подложки толщиной 15 мкм.
- Очистите марок с 70% этанола для удаления пыли и частиц грязи. Позвольте им высохнуть на воздухе.
* Марки могут быть использованы несколько раз, однако, обновление PDMS штампов на регулярной основе рекомендуется из-за истирания поверхности с течением времени.
- Место марок SPI Плазма-Prep II Плазменные чистое и процесс в течение 1 мин при 275 мТорр оказать PDMS поверхности гидрофильной.
* Кислородной плазмы лечение должно быть наблюдал. Дольше раз лечение может привести к растрескиванию эластомера.
- Стерилизовать марок с 70% этанола в течение 1 мин. Быстро высыхают при помощи сжатого воздуха.
* Дальнейшие шаги должны быть выполнены в бокс биологической безопасности для поддержания стерильности.
- Крышка штамп поверхности Fibronectin раствора (50 мкг / мл в DDH 2 O). Пусть он адсорбирует по крайней мере, 10 мин.
- Избавьтесь от Фибронектин решение от штампов и быстро высыхают сжатым воздухом.
- Создание конформного контакта между марками и PDMS субстратов в течение 2 минут и сильно прижать.
- Промыть micropatterned подложках с DDH 2 O. Храните их в DDH 2 O в течение максимум 2-х недель при температуре 4 ° C, если первоначально использовался. Магазин PDMS штампов в DDH 2 O.
2. Техническое обслуживание двойного трансгенных линий эмбриональных стволовых клеток
Во-первых, подготовить следующие среды для культивирования ЭС клеток мыши:
Мышиных эмбриональных фибробластов (MEF)-Medium: Дульбекко изменения Eagle Medium (DMEM), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) ES клеток или дифференциации классов, 1% пенициллина-стрептомицина (P / S)
Эмбриональные стволовые клетки (ЭСК)-среда: DMEM, 15% FBS ЭС клеток-класса,1% Non-незаменимых аминокислот (NEAA), 0,5% P / S, 0,2% Фактор ингибирующий лейкемию (LIF), 0,0007% 2-меркаптоэтанол (2-ME)
- Пальто 6-луночные планшеты с стерильным 0,1% желатина в DDH 2 O и пусть она адсорбирует 15 мин при 37 ° C.
- Добавить MEFs от талых аликвоты в 50 мл PBS в конической трубе и центрифугируют их при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Ресуспендируют MEFs в MEF-среде.
- После адсорбции, аспирации избыточного желатин и добавить MEFs в лунки. Разрешить MEFs 1 день присоединить.
* Аликвоты в 10 миллионов достаточно для MEFs 3 6-луночных планшетах.
- Когда MEFs приложил, добавьте ES клетки от талых аликвоты в 50 мл PBS в конической трубе и центрифугируют их при 1000 оборотов в минуту в течение 5 мин. Ресуспендируют ЭС клеток в ESC-среде и добавить их в лунки, содержащие MEFs. Культура ЭС клеток в ESC-среде до слияния будет достигнута.
* Как только ЭС клетки достигли слияния, пассажи в RequМРЭО, чтобы избежать разрастания и поддерживать колонии ЭСК.
- Подготовка ЭС клеток для пассирования. Аспирата ESC-среде и мыть один раз стерильной PBS.
- Аспирируйте PBS и добавьте 500 мкл трипсина. Процесс 3,5 мин при 37 ° C.
- Внесите раствор трипсина вверх и вниз несколько раз, чтобы сломать колонии ES клетки и нейтрализует его с 500 мкл ESC-среде.
- Прохождение ЭС клеток в зависимости от желаемого соотношения, например, передачу 33 мкл в другую и с заранее подготовленных MEFs для прохождения 1/30. Поддерживать ЭС клеток в ESC-Medium.
* Прохождение соотношение 1/30, позволяет ЭС клеток достичь слияния в течение 3 дней. Прохождение клеток ES в соответствии с вашим графиком дифференциации в пробирке.
3. В пробирке Дифференциация Двухместный трансгенных линий эмбриональных стволовых клеток и выделение и посев кардиальных предшественников
Во-первых, подготовить followiнг средств массовой информации, необходимых для в пробирке дифференцировку ЭС клеток:
Адаптация-Medium: Средняя Искова изменения Дульбекко (IMDM), 15% FBS ЭС клеток-класса, 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,2% LIF, 0,0007% 2-ME
Дифференциация-Medium: IMDM, 15% FBS Дифференциация классов. 1% NEAA, 0,5% P / S, 0,35% аскорбиновой кислоты 0,1 М, 0,0007% 2-ME
- Начало в пробирке дифференциации, когда ЭС клетки достигли слияния. Пальто 10 см культура блюда стерильным 0,1% желатина в DDH 2 O и пусть она адсорбирует 15 мин при 37 ° C.
* Будьте в курсе продолжительностью в процессе дифференциации пробирке. Она занимает 8 дней до кардиальных предшественников могут быть выделены. Планирование эксперимента соответственно.
- Урожай ЭС клетки, как раньше. После адсорбции, аспирации избыточного желатин и добавить примерно 1/3-1/2 от суспензии клеток ES в подготовленную культурыблюд, содержащих адаптации среды. Культуры клеток в течение 2 дней.
* Выберите количество ЭС клеток для адаптации в соответствии с вашими экспериментами.
- Урожай адаптированы ЭС клеток в 50 мл коническую трубку с использованием PBS 1. 5 мл трипсина. Центрифуга диссоциированных клеток ES на 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендируют их дифференциация-среде.
- Сделать эмбриоидные тела (ЭТ) около 1000 клеток на 10 мкл падение в 15 см блюд культуры с помощью многоканальной пипетки. Переверните пластины и культуры ЭТ как висит капель в течение 2,5 дней при температуре 37 ° C.
- Через 2,5 суток, бассейн ЭТ 6-8 см 15 блюд культуры в один при помощи дифференциации среднего и культуре их для дальнейшей 3,5 дня при температуре 37 ° C.
- Через 3,5 суток, собирать ЭТ в конической трубе 50 мл, и пусть они опускаются на дно в течение примерно 5 мин. Подлизываться супернатант и мыть ЭТ стерильной PBS. Пусть ЭТ опускаться на дно для окoximately 5 мин.
- Диссоциируют ЭТ путем обработки их 2. 5 мл трипсина в течение 2 мин на водяной бане при температуре 37 ° C встряхивании трубки тихо. Затем добавьте 2. 5 мл стерильной PBS к решению трипсина и пипетки вверх и вниз с 10 мл серологической пипетки примерно в 8-10 раз, чтобы сломать клетку кластеров. Нейтрализовать трипсина с 10 мл буфера FACS, содержащий 7,5% FBS ES клеток или дифференциации класса и 0,01% DAPI в PBS.
- Центрифуга диссоциированных ЭТ при 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут и ресуспендируют их примерно 1 мл буфера FACS. Внесите вверх и вниз с 1 мл пипетки примерно в 8-10 раз, чтобы сломать клетку кластеров.
* Добавить FACS буфера в соответствии с предполагаемой суммы диссоциированных EB. Слишком высокая концентрация клеток может привести к засорению во время FACS и слишком низкой концентрации клеток может продлить FACS времени без необходимости.
- Передача клетки в стерильный с круглым дном трубки с 35 мкм ячейки фильтра для получениясуспензии отдельных клеток.
- Сортировать дифференцированных клеток ES использованием Цитометр FACSAria потока и получения очищенного населения CVP.
* Мы разработали многоступенчатый стробирования стратегия изоляции высокоочищенных цветных клеток. Короче говоря, мы первыми воротами на переднем Амплитуда рассеяния (FSC-A) и бокового рассеяния амплитуда (SSC-A) (рис. 1А). Это позволяет отделить целые клетки от продуктов распада клеток. Затем ворота на FSC-и вперед Scatter-Ширина (FSC-W) (рис. 1б). Это позволяет нам выделить ячейки синглетов из дублетов и другие клеточные агрегаты. Затем ворота на SSC-и бокового рассеяния-Ширина (SSC-W) (рис. 1С). Это повышает чистоту клетки майки. Затем ворота на DAPI окрашивания, чтобы изолировать жизнеспособных клеток (DAPI-отрицательные) от нежизнеспособных клеток (рис. 1D). Затем ворота на Phycoeryhthrin Амплитуда (PE-A) и PE-красителя 7 Амплитуда (PE-Cy7-A), чтобы получить истинное красный положительный (R + -) клеток и исключить аутофлуоресцентной красно-негативные клетки (рис. 1E). R + и R - клетки затем закрытом отдельно на флуоресцеина изотиоцианат Амплитуда (FITC-A) и PE-для сортировки истинный зеленый положительный (G +) и истинный зеленый отрицательных (G -) клеток внутри этих групп населения (рис. 1F + 1G). Этот результат в 4 популяциях клеток следующим образом: R + G +, R + G - R - G + и R - G - (рис. 1H).
- Пассивации micropatterned подложках с 1% Pluronic F-127 в DDH 2 O в течение 10 мин. Затем промойте их 3 раза стерильной PBS.
* Pluronic F-127 представляет собой поверхностно-активное вещество, которое блокирует клеточную адгезию. Он поддерживает заключение клеточной адгезии к micropatterned области.
- Прикрепить PDMS прокладки вокруг узорные областии плотно прижмите. Затем семена CVP на Фибронектин субстратов micropatterned.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
FACS очистки в пробирке дифференцированных клеток ES показали четыре различных популяций предшественников (рис. 1). Наличие micropatterned Фибронектин была подтверждена иммунофлюоресценции микроскопии, что отображается полная передача непрерывных линий фибронектина (рис. 2). Покрытие из FACS изолированные предшественников на Фибронектин micropatterns в результате выравнивания R + G + и часть R - G + населением. Хотя Pluronic F-127 в качестве вспомогательного блокатором адгезии клеток был использован, R + G - и R - G - население не уважает анизотропной архитектуры фибронектина и вырос в пространство между соседними линиями белка (рис. 3).
Рисунок 1. Represe ntative график проточной цитометрии из 6-й день в пробирке дифференцированных клеток ES. (A) Память на переднем Амплитуда рассеяния (FSC-A) и бокового рассеяния амплитуда (SSC-A). (B) Память на FSC-и Forward Scatter-Ширина ( FSC-W). (C) Память на SSC-и бокового рассеяния-Ширина (SSC-W). (D) Память на окрашивание DAPI. (E) Память для Phycoeryhthrin (PE) и PE-красителя 7 (PE- Cy7) (F и G) Память для флуоресцеина изотиоцианат Амплитуда (FITC-A) и PE-A (H) проточной цитометрии участок выявлении четырех различных популяций предшественников.. R + G +, R + G - R - G + и R - G -. Нажмите, чтобы увеличить показатель .
fig2.jpg "ALT =" Рисунок 2 "/>
Рисунок 2. Представитель иммунофлюоресценции микроскопии micropatterned субстратов фибронектина. Шкалы, 80 мкм.
Рисунок 3. Представитель иммунофлюоресценции микроскопии эмбриональных-(A) и ЭС клеток-производных (B) FACS изолированные предшественников после дополнительных 5 дней культуры на Фибронектин micropatterns ядер, синий,. SmMHC, красный; саркомерного α-актинина, зеленый. Шкала бар, 40 мкм. Воспроизводится по Домиана и соавт. (2009).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, мы представили метод, чтобы изолировать очищенной популяции кардиогенный предшественников и семя их на micropatterned субстратов фибронектин, что позволяет им согласовать и принять сердечных миоцитов, как стержень формы. Нормальный клеточной организации имеет решающее значение для нормальной функции тканей 8,10, в частности, для ткани миокарда. Кардиомиоцитов было показано, что развитие улучшенными механическими 11,12 и 11,13 электрофизиологических свойств при формировании анизотропного массива клетки. С кардиальных предшественников культивировали на субстратах micropatterned Фибронектин дифференцироваться в палочковидные клетки миокарда в пробирке, это представляет apivotal шаг в сердечной биоинженерии тканей.
Микроконтактной печати представляет собой простой и недорогой инструмент, который может быть использован для создания 2-мерных шаблоны напоминающий ткань миокарда в пробирке. Тем не менее, эффективный и успешный паттерна добычеellular матричных протеинов зависит в значительной степени от белков выбора. Принимая во внимание большое разнообразие различных белков были успешно штамп PDMS на основаниях, определенных белков, таких как коллаген I типа, требуют модификации поверхности подложки PDMS до микроконтактной печати 14. Кроме того, количество давления на штамп, а также продолжительность тиснение также может сильно повлиять на эффективность и верность микроконтакта печати.
Другим важным шагом в этом протоколе является использование плазмы чистого оказывать поверхности штампов PDMS гидрофильными. Хорошо известно, что микроконтактной печати не происходит, когда оба PDMS штампов и субстраты не подвергаются кислородной плазмы лечение 15, и несколько групп обнаружено, что настройка смачиваемость подложки PDMS требуется для того, чтобы сделать передачу белка возможных 3,6 , 15. Однако мы обнаружили, что увеличение гидрофильностиPDMS штамп вместо подложки PDMS приводит к более равномерному белка micropatterns с более высоким качеством, таких как менее разрушительным или неполной линий белка.
Для представлен протокол, micropattern шириной 20 мкм была выбрана, по словам сообщили ширина ячейки мышиных новорожденных кардиомиоциты 16. Тем не менее, изготовление micropatterns должна осуществляться в видовом и сердце стадии развития зависит от 16-20 образом, чтобы предотвратить противоположное влияние на жизнеспособность клеток из-за ограниченного пространства.
Открытие и очистки ЭС клеток-производных CVP, в частности, R + G + населения, обеспечивают надежную исследований в сердечной биоинженерии тканей. В частности, мы наблюдали наши ЭС клеток-производных кардиальных предшественников, чтобы быть способны образовывать договаривающихся ткани миокарда с сохранением их клеточной выравнивания. Учитывая, что построение трехмерных функциональныхтканей является ключевой задачей в области биоинженерии тканей, наш сгенерированный двумерной анизотропной ткани миокарда могут быть эффективно использованы для слоем несколько листов клетка, как и другие группы описанной ранее для других типов клеток 21,22. Тем не менее, на сегодняшний день, одно ограничение трансгенных системы репортер результат в пробирке дифференцировку ЭС клеток. FACS доступны CVP, в частности, сильно кардиогенный R + G + населения, в настоящее время составляют приблизительный среднем 0,5% от всех дифференцированных клеток. Таким образом, повышение в пробирке дифференцировку ЭС клеток в CVP будет важным шагом на пути создания достаточного количества CVP построить большие анизотропные сердечную ткань, состоящая из продольно ориентированных волокон миокарда.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена частично в Центре наноразмерных системы (ЦНС), член Национальной сетевой инфраструктуры нанотехнологий (NNIN), который при поддержке Национального научного фонда NSF в награду нет. ECS-0335765. ЦНС является частью Гарвардского университета.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Prepare 0.1M solution in ddH2O |
| Desiccator, Vacuum 10 inch | Nova-Tech International, Inc. | 55206 | |
| 4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI) | Life Technologies | D1306 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Thermo Scientific | SH30022.01 | |
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| FACSAria II Flow Cytometer | BD Biosciences | ||
| Fetal Bovine Serum ES cell-grade | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| Fetal Bovine Serum Differentiation-grade | Gemini Bio-Products | 100-500 | |
| Fibronectin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | F4759 | Solubilize to 1 mg/ml in ddH2O |
| Fisherfinest Premium Cover Glass 22x22mm | Fisher Scientific | 12-548-B | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | Prepare 0.1% solution in ddH2O |
| Headway Spin Coater | Headway Research, Inc. | PWM32-PS-CB15 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium | Thermo Scientific | SH30228.01 | |
| Leukemia Inhibitory Factor | Self-prepared from LIF-secreting cell lines | Prepare 500x stock solution | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Gibco | 11140-050 | |
| 2-Mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| Mouse Embryonic Fibroblasts | Harvested from day 12-15 mouse embryos | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Pluronic F-127 | Sigma-Aldrich | P2443 | Prepare 1% solution in ddH2O |
| Round-Bottom Tube with 35 μm cell strainer | BD Biosciences | 352235 | |
| SPI Plasma-Prep II Plasma Cleaner | SPI Supplies | 11005-AB | |
| Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-056 | |
| Vacuum Gauge | SPI Supplies | 11019-AB |
References
- Alcon, A., Cagavi Bozkulak, E., Qyang, Y. Regenerating functional heart tissue for myocardial repair. Cell Mol. Life Sci. , (2012).
- Chien, K. R., Domian, I. J., Parker, K. K. Cardiogenesis and the complex biology of regenerative cardiovascular medicine. Science. 322, 1494-1497 (2008).
- Domian, I. J., et al. Generation of functional ventricular heart muscle from mouse ventricular progenitor cells. Science. 326, 426-429 (2009).
- Chan, B. P., Leong, K. W. Scaffolding in tissue engineering: general approaches and tissue-specific considerations. Eur. Spine J. 17, Suppl . 4. 467-479 (2008).
- Eschenhagen, T., Eder, A., Vollert, I., Hansen, A. Physiological aspects of cardiac tissue engineering. Am. J. Physiol Heart Circ Physiol. 303, H133-H143 (2012).
- Feinberg, A. W., et al. Muscular thin films for building actuators and powering devices. Science. 317, 1366-1370 (2007).
- Li, F., Li, B., Wang, Q. M., Wang, J. H. Cell shape regulates collagen type I expression in human tendon fibroblasts. Cell Motil. Cytoskeleton. 65, 332-341 (2008).
- Sarkar, S., Dadhania, M., Rourke, P., Desai, T. A., Wong, J. Y. Vascular tissue engineering: microtextured scaffold templates to control organization of vascular smooth muscle cells and extracellular matrix. Acta Biomater. 1, 93-100 (2005).
- Isenberg, B. C., Wong, J. Y. Building structure into engineered tissues. Materials Today. 9, 54-60 (2006).
- Athanasiou, K. A., Zhu, C., Lanctot, D. R., Agrawal, C. M., Wang, X. Fundamentals of biomechanics in tissue engineering of bone. Tissue Eng. 6, 361-381 (2000).
- Feinberg, A. W., et al. Controlling the contractile strength of engineered cardiac muscle by hierarchal tissue architecture. Biomaterials. 33, 5732-5741 (2012).
- Black, L. D. 3rd, Meyers, J. D., Weinbaum, J. S., Shvelidze, Y. A., Tranquillo, R. T. Cell-induced alignment augments twitch force in fibrin gel-based engineered myocardium via gap junction modification. Tissue Eng. Part A. 15, 3099-3108 (2009).
- Kim, D. H., et al. Nanoscale cues regulate the structure and function of macroscopic cardiac tissue constructs. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 565-570 (2010).
- Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur. Cell Mater. 18, 1-14 (2009).
- Tan, J. L., Liu, W., Nelson, C. M., Raghavan, S., Chen, C. S. Simple approach to micropattern cells on common culture substrates by tuning substrate wettability. Tissue Eng. 10, 865-872 (2004).
- Leu, M., Ehler, E., Perriard, J. C. Characterisation of postnatal growth of the murine heart. Anat. Embryol. (Berl). 204, 217-224 (2001).
- Li, F., Wang, X., Capasso, J. M., Gerdes, A. M. Rapid transition of cardiac myocytes from hyperplasia to hypertrophy during postnatal development. J. Mol. Cell Cardiol. 28, 1737-1746 (1996).
- Porrello, E. R., et al. Heritable pathologic cardiac hypertrophy in adulthood is preceded by neonatal cardiac growth restriction. Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol. 296, 672-680 (2009).
- Snir, M., et al. Assessment of the ultrastructural and proliferative properties of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 285, H2355-H2363 (2003).
- Ohler, A., et al. Two-photon laser scanning microscopy of the transverse-axial tubule system in ventricular cardiomyocytes from failing and non-failing human hearts. Cardiol. Res. Pract. 2009, 802373 (2009).
- Takahashi, H., Nakayama, M., Shimizu, T., Yamato, M., Okano, T. Anisotropic cell sheets for constructing three-dimensional tissue with well-organized cell orientation. Biomaterials. 32, 8830-8838 (2011).
- Williams, C., Xie, A. W., Yamato, M., Okano, T., Wong, J. Y. Stacking of aligned cell sheets for layer-by-layer control of complex tissue structure. Biomaterials. 32, 5625-5632 (2011).
